OsVTC1-3蛋白在促进植物维生素C合成中的应用的制作方法

OsVTC1-3蛋白在促进植物维生素C合成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种OsVTC1-3蛋白在促进植物维生素C合成中的应用。本发明公开的一种干扰载体，该载体是将SEQ?ID?No.3所示的DNA片段插入出发载体pUCCRNAi的XhoⅠ和BglⅡ位点间，得到中间载体1；将SEQ?ID?No.3所示的DNA片段的反向互补序列插入中间载体1的SalⅠ和BamHⅠ位点间，得到中间载体2；用PstⅠ酶切中间载体2，得到DNA片段；PstⅠ酶切pCAMBIA2300，得到载体大片段；将DNA片段与载体大片段连接，最终得到干扰载体。本发明证明了OsVTC1-3蛋白在植物Vc合成中具有重要作用。
【专利说明】OsVTC1-3蛋白在促进植物维生素C合成中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种OsVTCl-3蛋白在促进植物维生素C合成中的应用。
【背景技术】
[0002]维生素C (Vitamin C，Vc)是动、植物体内重要的抗氧化剂和辅酶，但人无法合成Vc,需要从日常饮食中摄取。植物是人体所需Vc的重要来源但植物特别是粮食作物中Vc含量很低，所以通过生物技术的途径提高植物中Vc含量对提高作物营养价值具有重要作用。
[0003]在动物中，Vc合成路径比较清楚。其合成过程是由D-葡萄糖经UDP-葡萄糖，UDP-D-葡萄糖醛酸，D-葡萄糖醛酸，L-古洛糖酸，L-古洛糖-1，4-内酯，最后在古洛糖内酯氧化酶的作用下合成Vc。人类及一些动物由于编码古洛糖内酯氧化酶的基因发生变易而不能合成Vc。与动物不同，植物中Vc合成途径比较复杂。研究表明植物中可能存在糖醛酸途径、邻酮醛糖途径、肌醇途径、古洛糖途径和L-半乳糖途径等多条Vc合成途径。尽管不同途径在不同的实验中被证明，但在模式植物拟南芥中的实验表明半乳糖途径是植物Vc合成的主要途径。
[0004]半乳糖途径合成Vc涉及甘露糖-6-磷酸异构酶、甘露糖磷酸变位酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶、⑶P-甘露糖-3’，5’ -差向酶、⑶P-L-半乳糖磷酸化酶、半乳糖-1-磷酸化酶、半乳糖脱氢酶和半乳糖内酯脱氢酶多种酶。在拟南芥中，半乳糖途径以磷酸果糖为底物，在相关酶的催化下，经磷酸甘露糖，GDP-甘露糖，GDP-半乳糖，磷酸半乳糖，半乳糖内酯，然后在半乳糖内酯脱氢酶的作用下由L-1，4-半乳糖内酯然后生成Vc。该途径中有多个关键调控位点，其中催化1-磷酸甘露糖生成GDP-甘露糖的GDP-甘露糖焦磷酸化酶VTCl在该合成途径中发挥重要调控作用。VTCl的点突变体vtcl-1因为VTCl的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶降低而抑制拟南芥Vc合成，其Vc含量只有野生型的25-30% ;而VTCl功能缺失突变体，则因Vc合成抑制无法完成生活史。所以VTCl编码的GDP-甘露糖焦磷酸化酶在植物Vc合成中具有重要作用。
[0005]目前，尽管在模式植物拟南芥中Vc合成途径比较清楚，但在粮食作物如水稻中Vc合成途径及调控位点还不清楚。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种0sVTCl-3蛋白在促进植物维生素C合成中的应用。
[0007]本发明提供的一种干扰载体，该载体是将SEQ ID N0.3所示的DNA片段正向插入出发载体PUCCRNAi的Xho I和Bgl II位点间，得到中间载体I JfSEQ IDN0.3所示的DNA片段的反向互补序列正向插入中间载体I的Sal I和BamH I位点间，得到中间载体2 ;用Pst I酶切中间载体2，得到DNA片段；Pst I酶切pCAMBIA2300，得到载体大片段；将DNA片段与载体大片段连接，最终得到干扰载体。
[0008]一种制备维生素 C合成能力提高的转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:[0009]将SEQ ID N0.2所示蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的维生素C合成能力提高。
[0010]上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体PCAMBIA1307的多克隆位点得到的。
[0011]上述任一所述的方法中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0012]所述植物具体为拟南芥。
[0013]一种制备维生素C合成能力降低的转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:
[0014]将干扰载体导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的维生素C合成能力降低；
[0015]所述干扰载体为上述干扰载体；
[0016]所述植物具体为水稻。
[0017]如下任一物质在制备维生素C合成能力提高的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围:
[0018](I)SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0019](2) SEQ ID N0.2所示蛋白的编码基因；
[0020](3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
[0021]上述应用中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0022]上述任一所述的应用中，所述植物为拟南芥。
[0023]SEQ ID N0.2所示的蛋白作为GDP-甘露糖焦磷酸化酶的应用也属于本发明的保护范围。
[0024]在体外0sVTCl-3蛋白可以催化甘露糖_1_磷酸生成⑶P-甘露糖，表明0sVTCl_3蛋白具有GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性，其在体内可能参与半乳糖途径而调控Vc合成。OsVTCl-3可以提高拟南芥VTCl的单点突变体vtcl-1中Vc含量。另外，干扰水稻中0sVTCl-3的表达显著抑制了水稻Vc的合成。可见OsVTCl-3蛋白在植物Vc合成中具有重要作用。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1为OsVTCl-3原核表达载体pET_30a (+) -OsVTCl-3构建示意图。
[0026]图2为OsVTCl-3蛋白的纯化以及OsVTCl-3蛋白的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶活性的检测。
[0027]图3为OsVTCl-3基因过表达载体pCAMBIA1307_0sVTCl_3构建示意图。
[0028]图4为OsVTCl-3基因过表达植株的Western blot检测。
[0029]图5为OsVTCl-3基因干扰表达载体pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl_3构建示意图。
[0030]图6为OsVTCl-3基因干扰植株中OsVTCl-3基因表达检测结果。
[0031]图7为OsVTCl-3基因过表达植株与干扰植株中维生素C含量的检测结果。
【具体实施方式】
[0032]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0033]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]水稻中花17 (Zhonghual7)在文献“Liu D, Chen X，Liu J, Ye J, Guo Z.(2012)The rice ERF transcription factor 0sERF922negatively regulates resistance toMagnaporthe oryzae and salt tolerance.J Exp Bot.63I3899-39Il.，，中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
[0035]拟南芥维生素C合成关键基因VTCl的单点突变体vtcl-1在文献“Conklin PL, Saracco SA, Norris SR, Last RL.(2000)Identification of ascorbicacid-deficient Arabidopsis thaliana mutants.Genetics.154:847-856.，，中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
[0036]BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWOO14。
[0037]pET-30a(+)购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司，产品目录号为S18-12。
[0038]1-P-mannose (甘露糖-1-磷酸)购自Sigma公司，产品目录号为P6556。
[0039]20mM TEAA缓冲液购自嘉德信国际有限公司，产品目录号为SP5890。
[0040]pCAMBIA1307购自上海吉然生物科技有限公司，产品目录号为JR13080311。
[0041]农杆菌LBA4404购自行知生物科技有限公司，产品目录号为AABV02-03。
[0042]诱导培养基(NB培养基)购自上海科敏生物科技有限公司，货号为BS1309。
[0043]继代培养基为NB培养基中加2mg/L2，4_D制成。
[0044]IOOuM AS+AA液体培养基`由NB培养基加2mg/L2，4-D以及100uM/L AS制成。
[0045]pUCCRNAi 在文献 “Gan D, Zhang J, Jiang H, Jiang T, Zhu S，Cheng B (2010)Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection.Plant CellRep.29:1261-1268.”中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
[0046]PCAMBIA2300购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，产品目录号为MCV036。
[0047]实施例1、OsVTCl-3蛋白在大肠杆菌中的表达
[0048]一、OsVTC1-3原核表达载体的构建
[0049](一)提取水稻中花17的基因组DNA。
[0050](二)设计并合成如下引物:
[0051 ]上游引物:5’ -GGCATATGACCATGAAGGCGCTCA-3’
[0052]下游引物:5’-ATGTCGACCATGACAATCTCGGGCTT-3’
[0053](下划线所示序列为酶切识别位点)
[0054](三)以步骤(一)的基因组DNA为模板，以步骤(二)的上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，PCR产物即为0sVTCl-3基因，该基因的序列如SEQ ID N0.1所示，0sVTCl-3蛋白的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0055](四)NdeI与SalI双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到基因片段；NdeI与SalI双酶切pET-30a (+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET-30a(+)-0sVTCl-3，测序结果正确，其构建示意图如图1所示。
[0056]二、0sVTCl-3 蛋白的纯化
[0057]将pET-30a(+)-0sVTCl_3电转化大肠杆菌BL21，将获得的阳性克隆接种于LB培养基，在培养基中加入终浓度为0.5 μ M的IPTG诱导OsVTCl-3蛋白的表达，28°C，200rpm培养I小时，收集菌液，液氮研磨破碎细胞，得到蛋白粗提液；同时由不加IPTG的培养基用同样的方法得到对照蛋白粗提液；将蛋白粗提液用Bio-Rad蛋白低压层析系统纯化，得到纯化组分。
[0058]将蛋白粗提液、对照蛋白粗提液和纯化组分进行SDS-PAGE凝胶电泳结果如图2A所示。
[0059]图2A中，marker为蛋白Marker，-1PTG代表对照蛋白粗提液；+IPTG代表蛋白粗提液；Purified表示纯化组分(即OsVTCl-3蛋白)。
[0060]图2A表明，OsVTCl-3蛋白的分子量为36.2kD。
[0061]将PET_30a(+)质粒进行步骤二的实验，无目的条带出现。
[0062]三、OsVTCl-3蛋白⑶P-甘露糖焦磷酸化酶活性检测
[0063]⑶P-甘露糖焦磷酸化酶可以催化甘露糖-1-磷酸生成⑶P-甘露糖。
[0064](一)将步骤二纯化得到的OsVTCl-3蛋白样品和pET_30a(+)表达的His标签蛋白(对照蛋白)分别加入透析袋中，用IOOmM Tris-HCl透析缓冲液透析去盐。透析缓冲液每I小时置换一次，置换5次，将透析后的各蛋白分装保存于_80°C待用。
[0065](二)将获得的OsVTCl-3蛋白和对照蛋白用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
[0066](三)分别取Iμ g纯化得到的各蛋白按如下体系进行GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性检测。
[0067]酶活反应体系如下:
[0068]
IOOmM Tris-HCl (pH7.5)5u I
40mM MgCl25 μ I
IOOmM GTP0.5 μ I
IOmM 1-P-mannose (甘露糖_1-憐酸)5 ? I
纯化的蛋白Iwg
[0069]加水至总体积为50 μ I。
[0070]37°C反应lh。沸水浴2min终止反应。
[0071](四)HPLC检测⑶P-甘露糖的合成量
[0072]所用色谱柱为Waters公司的C-18色谱柱(型号为rat046980，填料为高纯硅胶，色谱柱规格为250X4.6mm)
[0073]洗脱缓冲液如下:
[0074]洗脱缓冲液1:20mM TEAA缓冲液和乙腈按照体积比2:98混匀。
[0075]洗脱缓冲液II:20mM TEAA缓冲液和乙腈按照体积比5:95混匀。
[0076]洗脱缓冲液II1: 20mM TEAA缓冲液和乙腈按照体积比10:90混匀。
[0077]洗脱条件为:洗脱缓冲液I线性洗脱12min，然后用洗脱缓冲液II线性洗脱5min，最后用洗脱缓冲液III线性洗脱5min。
[0078]将⑶P-甘露糖标准样品制成IOmM母液，然后将母液按0，100，500，1000, 1500，2000，2500, 3000nM的梯度稀释成不同浓度的⑶P-甘露糖标准样品，各取25 μ I标准样，在柱温25°C，流速lml/min过色谱柱，然后按上述洗脱条件进行洗脱，并在254nm检测标准样品的出峰时间和计算峰面积，以时间为横坐标(分钟)，GDP-甘露糖浓度为纵坐标作图(nM)，绘制GDP-甘露糖标准曲线。
[0079]将步骤(三)得到的各反应液取25 μ I体积上样，柱温25°C，流速lml/min，254nm检测反应液中GDP-甘露糖的峰面积。
[0080]根据⑶P-甘露糖标准曲线计算反应液中的⑶P-甘露糖含量(nM)。
[0081]OsVTCl-3蛋白的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶活性(nM/hr/mg蛋白)=GDP_甘露糖含量(nM)/酶反应时间I小时(hr)/样品中OsVTCl-3蛋白量(mg)。
[0082]结果如图2B所示，OsVTCl-3蛋白的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶活为1478.2+52.7 (nM/hr/mg 蛋白)。
[0083]对照蛋白的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶活性(nM/hr/mg蛋白)=GDP_甘露糖含量(nM)/酶反应时间I小时(hr) /样品中His标签蛋白量(mg)。
[0084]pET-30a(+)表达的His标签蛋白(对照蛋白)的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶活仅为
3.7+1.2 (nM/hr/mg 蛋白)。
[0085]综上表明OsVTCl-3具有⑶P-甘露糖焦磷酸化酶活性。
[0086]实施例2、OsVTCl-3基因过表达载体转化拟南芥
[0087]一、过表达载体的构建
[0088](一)提取水稻中花17的基因组DNA。
[0089](二)设计并合成如下引物:
[0090]上游引物:5’-GCTCTAGAACCATGAAGGCGCTCATT-3，
[0091]下游引物:5’-ATGTCGACCATGACAATCTCGGGCTT-3’
[0092](下划线所示序列为酶切识别位点)
[0093](三)以步骤(一)的基因组DNA为模板，以步骤(二)中的上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，得到OsVTC1-3基因。
[0094](四)用XbaI与Sal I双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到基因片段；XbaI与Sal I双酶切PCAMBIA1307，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pCAMBIA1307-0sVTCl-3，将该质粒送测序结果正确，其构建示意图如图3所
/Jn ο
[0095]二、将pCAMBIA1307-0sVTCl-3通过电转化方法导入农杆菌LBA4404中，得到重组农杆菌，将其命名为 LBA4404/pCAMBIA1307-0sVTCl-3。
[0096]三、过表达载体转化拟南芥
[0097](一)取生长状况良好的、有较多的花苞的拟南芥维生素C合成关键基因VTCl的单点突变体vtcl-1,转化前一天烧水。
[0098](二)将重组农杆菌 LBA4404/pCAMBIA1307-0sVTCl-3 于 28 °C 培养过夜，至OD600=0.8,6000rpm 离心 6min,收集菌体。
[0099](三)将菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化缓冲液中，至终浓度0D_=0.4，制成悬浮液。
[0100]( 四)转化时剪去已经开花的花朵或者已有的果荚，倾倒小盆，确保拟南芥全部花苞都浸没入步骤(三)制备的悬浮液中，浸泡约40s。
[0101](五)吸去植物周围多余的液体，将植物平放于一个密封的小盒内以保持湿度，避光过夜。
[0102](六)第二天将植物取出，竖直，转移到20°C，16h光照/8h黑暗条件下生长，得到Tl代种子。
[0103](七)将Tl代种子铺于含40ug/mL潮霉素的筛选培养基上，4°C春化48h_72h，移到人工气候室，16h光照/8h黑暗条件下生长两周。
[0104](A)待长出绿色的转基因抗性幼苗(转基因植物为绿色的幼苗且根较长；非转基因植物基本为黄化苗或绿色无根幼苗)后移栽入土继续生长，获得Tl代转基因植株。
[0105](九)筛选Tl代苗的潮霉素抗性与非抗性的种子具有3:1分离比的转基因植株并加代繁殖，得到T3代转基因拟南芥。
[0106]对野生型拟南芥、拟南芥维生素C合成关键基因VTCl的单点突变体vtcl-1以及三株T3代转基因拟南芥(0Ε-1、0Ε-2和0E-3)进行Western blot，检测0sVTCl-3蛋白(带标签)的表达情况，结果如图4所示。
[0107]图4中，WT为野生型拟南芥；vtcl-l为拟南芥维生素C合成关键基因VTCl的单点突变体vtcl-1 ;0E-1、0E-2和0E-3为三株T3代转0sVTCl_3过表达载体pCAMBIA1307-0sVTCl-3 的拟南芥。
[0108]图4表明，野生型拟南芥和拟南芥维生素C合成关键基因VTCl的单点突变体中无0sVTCl-3蛋白的表达，三株T3代转0sVTCl-3过表达载体pCAMBIA1307-0sVTCl_3的拟南芥(0E-1、0E-2 和 0E-3)有 OsVTCl-3 蛋白的表达。
[0109]将T3代转基因拟南芥应用于OsVTCl-3蛋白在植物中的功能分析。
[0110]实施例3、OsVTC1-3 基因干扰载体转化水稻
[0111]一、干扰载体的构建
[0112](一)提取水稻中花17的基因组DNA。
[0113](二)设计并合成如下引物:
[0114]上游引物:5’-AACTCGAGGAGGCGAGGCGAAGGATT-3，；
[0115]下游引物:5’-GGAGATCTCAACCATATAGCCTGATGACA-3’。
[0116](下划线所示序列为酶切识别位点)
[0117](三)以步骤(一)的基因组DNA为模板，以步骤(二)的上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，该片段不包含OsVTCl-3基因cDNA片段，位于OsVTCl-3基因的3’ UTR区。
[0118](四)XhoI与Bgl II双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到OsVTCl-3基因的3’UTR片段；Xho I与Bgl II双酶切pUCCRNAi，得到载体大片段I ;将OsVTCl-3基因的3’UTR片段与载体大片段I连接，得到中间载体I。
[0119]Sal I与BamH I双酶切中间载体I，得到载体大片段2 ；Xho I与Bgl II双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到OsVTCl-3基因的3’ UTR片段；将载体大片段2与OsVTCl-3基因的3’UTR片段连接，得到中间载体2 (Xho I与BamH I ,Bgl II与Sal I是同尾酶)。
[0120]Pst I酶切中间载体2，得到双向互补的OsVTCl-3基因的3’ UTR片段；Pst I酶切PCAMBIA2300，得到载体大片段3 ;将双向互补的OsVTCl-3基因的3’ UTR片段与载体大片段3连接，得到重组质粒，将其命名为pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-3，其构建示意图如图5所示。[0121]二、将pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-3以电转化方法导入农杆菌LBA4404中，得到重组农杆菌，将其命名为 LBA4404/pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-3。
[0122]三、干扰表达载体转化水稻
[0123](一)将用体积百分含量75%乙醇灭菌后的水稻中花17的种子种于诱导培养基上，28°C黑暗培养。两周后，将愈伤组织转入新的诱导培养基，28°C继代暗培养，共继代暗培养2代。
[0124](二)将第三代继代愈伤组织中自然分散、颜色淡黄的胚性愈伤颗粒置于继代培养基上，28°C暗培养3天，得到的愈伤组织用于重组农杆菌的转化。
[0125](三)将重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-3 悬浮于 IOOuM AS+AA 液体培养基中(0D_为0.3)，然后将步骤(二)得到的愈伤组织置于菌悬浮液中浸泡10-20分钟，其间轻轻摇动，于28°C培养过夜，至OD6tltl=0.8，6000rpm离心6min，收集菌体。将菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化缓冲液中，至终浓度0D_=0.3-0.6。
[0126](四)倒掉菌液，小心取出愈伤组织用滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织转移到共培养培养基上，21 °C -22°C暗培养3天。
[0127](五)挑选共培养后的愈伤组织，滤纸滤干表面水汽后平铺于筛选培养基(含50mg/L潮霉素)上，28°C进行暗培养。2周时继代一次，共继代2次。
[0128](六)将步骤(五)得到的生长旺盛， 呈乳白色或微黄色的新鲜愈伤组织转至预分化培养基，28°C暗培养I周左右，然后28°C光照培养，两周左右继代一次，得到分化苗。
[0129](七)将长势好的分化成苗移至生根培养基(瓶装)上。培养1-2周后移栽温室，得到TO代转基因植株以及TO转基因植株的种子。
[0130]将TO转基因植株的种子使用潮霉素选择平板萌发，确认潮霉素抗性具有3:1分离比的株系，然后将由其得到的Tl转基因植株转至土壤培养直至成熟。将获得的转基因材料加代繁殖，得到T3代转基因水稻。
[0131]提取野生型水稻中花17以及T3代转基因水稻的RNA，进行Q-PCR实验，检测OsVTCl-3基因的相对表达量，结果如图6所示。
[0132]图6中，WT为野生型水稻中花17 ；R1-2和R1-4为两株T3代转OsVTCl-3干扰载体 pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-3 的水稻。
[0133]图6表明，与野生型水稻中花17相比，R1-2和R1-4这两株T3代转基因水稻的OsVTCl-3基因的相对表达量显著下降。
[0134]利用获得的T3代转基因水稻分析OsVTCl-3蛋白在植物中的功能。
[0135]实施例4、转基因植株中的维生素C含量检测
[0136]一、选取3周龄T3代转基因水稻和野生型水稻中花17的根及T3代转基因拟南芥、野生型拟南芥和拟南芥VTCl突变体Vtcl-1的叶片，用水冲洗干净，并用吸水纸吸干多余的水分，然后分别用液氮迅速冷冻，于_80°C保存。
[0137]二、准确称取0.175g AsA，溶于Iml体积百分含量为6%的高氯酸(HClO4)水溶液中，即得lmmol/ml的AsA溶液。
[0138]三、将lmmol/ml的AsA溶液用体积百分含量为6%的高氯酸溶液将其最终稀释为浓度分别为 1000nmol/ml、800nmol/ml、600nmol/ml、400nmol/ml、200nmol/ml、100nmol/ml的AsA溶液。[0139]四、分别取300 μ I步骤三得到的不同浓度的AsA溶液，加入2700 μ I ρΗ=12.7 丁二酸钠缓冲液中，混匀，此时的ρΗ=5.8左右，AsA的浓度相应减少了 10倍。在265nm处测不同浓度的AsA的吸收值。以吸收值(OD)为横坐标，AsA浓度为纵坐标作图，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
[0140]五、分别取步骤一得到的0.5g的各植株的材料，在液氮下研磨，分别加入Iml体积百分含量为6%的HClO4水溶液，混匀，冰上放置5min，4°C，12000g,离心lOmin。取上清，提取其中的AsA。
[0141]六、将步骤五提取的上清液200 μ I加入1800 μ I ρΗ=12.7 丁二酸钠缓冲液中，然后加入4U的抗坏血酸氧化酶(购自Sigma),反应10min后，记录265nm紫外吸收值,记作ODl ;取步骤五提取的上清液200 μ I加入1800 μ I ρΗ=12.7 丁二酸钠缓冲液中，加入DTT至终浓度为30mM，室温反应30min，记录265nm紫外吸收值，记作OD2。 [0142]七、将OD2-OD1值代入步骤四得到的线性回归方程，计算出AsA的浓度。
[0143]各植株中的维生素C含量检测结果如图7所示。
[0144]图7A中，WT为野生型拟南芥，vtcl-1为拟南芥VTCl的单点突变体vtcl_l，OE-1和0E-3为两株T3代转OsVTCl-3过表达载体pCAMBIA1307-0sVTCl_3的拟南芥。
[0145]图7B中，WT为野生型水稻中花17，R1-2和R1-4为两株T3代转OsVTCl-3干扰载体 pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-3 的水稻。
[0146]图7表明，OsVTCl-3可以提高拟南芥VTCl突变体vtcl_l中Vc含量，表明OsVTCl-3蛋白在植物中有VTCl类似功能，通过催化⑶P-甘露糖合成提高植物Vc合成。OsVTCl-3的表达抑制降低了水稻Vc的合成，当OsVTCl-3的表达抑制时，其根中Vc含量约为野生型水稻50%，可见OsVTCl-3在水稻Vc合成中具有重要作用。
【权利要求】
1.一种干扰载体，该载体是将SEQ ID N0.3所示的DNA片段插入出发载体PUCCRNAi的Xho I和Bgl II位点间，得到中间载体I JfSEQ ID N0.3所示的DNA片段的反向互补序列插入中间载体I的Sal I和BamH I位点间，得到中间载体2 ;用Pst I酶切中间载体2，得到DNA片段；Pst I酶切pCAMBIA2300，得到载体大片段；将DNA片段与载体大片段连接，最终得到干扰载体。
2.一种制备维生素C合成能力提高的转基因植物的方法，包括如下步骤: 将SEQ ID N0.2所示蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相匕匕，转基因植物的维生素C合成能力提闻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体PCAMBIA1307的多克隆位点得到的。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如SEQID N0.1 所示； 所述植物具体为拟南芥。
5.一种制备维生素C合成能力降低的转基因植物的方法，包括如下步骤: 将干扰载体导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的维生素C合成能力降低； 所述干扰载体为权利要求1所述的干扰载体； 所述植物具体为水稻。
6.如下任一物质在制备维生素C合成能力提高的转基因植物中的应用: (1)SEQID N0.2所示的蛋白； (2)SEQ ID N0.2所示蛋白的编码基因； (3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于:所述植物为拟南芥。
9.SEQ ID N0.2所示的蛋白作为⑶P-甘露糖焦磷酸化酶的应用。
【文档编号】C12N15/54GK103710380SQ201310699609
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】张执金, 秦华, 邓载安, 张传玉, 王亚云, 王娟, 张海文, 权瑞党, 黄荣峰 申请人:中国农业科学院生物技术研究所