一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用的制作方法

一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用的制作方法【专利摘要】一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用。本发明提供一种表达重组hGH的大肠杆菌操纵子、含有该操纵子序列的表达质粒以及用含有该操纵子的表达质粒转化得到的分泌表达重组hGH的工程菌QJSW-SZ01（CGMCC?No：7258）。其发明点在于通过改造大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列，突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构,同时在其末端改变一个氨基酸使其更利于引导人hGH分泌表达，并以此信号肽与大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(phoA启动子)和大肠杆菌T7终止子组合作为表达调控元件使重组hGH在大肠杆菌中得以可溶形式高效分泌表达，为最终开发低成本hGH药物制品奠定基础。【专利说明】一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及医药生物工程领域，尤其是一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用。【
背景技术：
】[0002]人生长激素(humangrowthhormone,hGH),又称为促生长素(somatotorpin),是由191个氨基酸组成的亲水性单链球蛋白，其相对分子质量在22kD左右，等电点Pl为4.9，分子中存在两对二硫键。hGH是由人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种重要的非糖基化蛋白质激素。脑垂体在下丘脑生长激素释放因子的刺激下，便能释放生长激素，而生长激素抑制素则能抑制它的释放。生长激素是通过血液运输到靶组织，影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究发现hGH还可治疗烧伤、创伤、骨折、骨质疏松等多种疾病。大量研究证实，生长激素缺乏是导致儿童生长障碍重要的因素之一。hGH的受体遍及人的全身。hGH的作用机理一般认为是通过cAMP进行的，在与靶细胞膜上特异性受体结合后，改变氨基酸及代谢产物的转运，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。[0003]生长激素的种属特异性很强，不同物种的生长激素的差别很大。传统临床应用的生长激素是从人脑的垂体中提取的，价格昂贵无法推广，一个人的垂体中最多只能提取出3~5mg的人生长激素。20世纪80年代之后，分子生物学的出现带动了生产重组蛋白的发展，使得利用基因工程的方法大规模生产HGH成为可能。这样可以得到与天然人生长因子相似或者完全一致的基因工程药物。[0004]1985年美国FDA首次批准基因技术生`产的重组hGH用于临床治疗和使用，其需求量和销售额在基因工程药物中排前列。90年代，人们开始用哺乳类细胞合成重组人生长激素(191肽)，该制剂的氨基酸序列与人天然生长激素完全一致，因为它是在哺乳细胞中合成，而非大肠杆菌，故无污染的危险，同时减少了抗原性。近年来，人们又不断尝试利用多种表达系统比如昆虫细胞、蚕、转基因小鼠、家兔、山羊、牛等表达人生长激素，但存在表达量不高，工艺复杂、发酵后处理繁琐、难以工业化生产等问题。毕赤酵母作为低等真核生物，具有高效分泌表达的特点，同时可以利用自身信号肽的切割的特点，获得无Met的人生长激素。[0005]传统的利用大肠杆菌表达重组hGH，有两种不同的技术途径，一种是生产分泌型的hGH，一种则是生产胞内型。经实践验证，生产分泌型的hGH，虽然步骤简单，杂蛋白干扰较少，氧化型的环境利于蛋白折叠，但是其表达量很低，一般要和胞内型要差I个数量级以上。但是生产胞内型的蛋白却又存在工艺步骤复杂、杂蛋白干扰较多等缺点。此外，采用上述两种方法所得到的人生长激素还存在活性低、纯度低等缺点。【
发明内容】[0006]本发明所要解决的技术问题在于克服现有利用大肠杆菌表达重组hGH的方法均存在各自不同的缺点以及得到的hGH活性低、纯度低等问题，提供一种高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用。[0007]本发明是采用如下技术方案实现的:设计改造了大肠杆菌耐热肠毒素信号肽，并以此信号肽与大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(PhoA启动子)和大肠杆菌T7终止子组合作为表达调控元件使重组hGH在大肠杆菌中得以高效分泌表达，为最终开发低成本hGH药物制品奠定基础。[0008]在本发明的第一方面，提供了一种表达重组hGH的大肠杆菌操纵子，其结构包括:大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(PhoA启动子)、经过优化改造的大肠杆菌耐热肠毒素信号肽(heat-stableenterotoxinsignalpeptide)的编码序列(SeqIDNO:1)、优化的重组人hGH的编码序列(SeqIDNO:2)和大肠杆菌T7终止子(T7terminater)。[0009]构建所述大肠杆菌操纵子的方法，包括以下步骤:根据hGH全长序列设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列；改造大肠杆菌耐热肠毒素信号肽并以选出的大肠杆菌耐热肠毒素的信号肽作为前导肽引导hGH的表达。上述步骤中，替换掉hGH全序列中大肠杆菌不利表达的密码子所得到的优化基因序列hGH如SEQIDNO:2所示；[0010]GCATTCCCAACTATACCACTAAGTCGACTATTCGATAACGCTATGCTTCG[0011]GGCCCATCGTCTTCATCAGCTAGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAG[0012]AGGCCTATATCCCCAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAAC[0013]CCCCAGACCT[0014]CCCTCTGTTTCTCAGAATCGATTCCGACACCCTCCAATCGCGAGGAAACACAACAGAAAT[0015]CCAACCTAGAGCTCCTCCGCATAAGCTTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTCGAGCCCGTGC[0016]AGTTCCTGAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTCTACGGCGCCTCTGATTCGAACGTGT[0017]ACGACCTGCTGAAGGACCTAGAGGAAGGGATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATG[0018]GCAGCCCGCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCAC[0019]ACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGG[0020]ACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCT[0021]TCTAG(SeqIDNO:2)[0022]其编码的重组hGH的氨基酸序列如下:[0023]FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEG丨QTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF[0024]优化的大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的序列如SEQIDNO:1所示:[0025]ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAAT[0026]GCCTAT(SeqIDNO:1);[0027]信号肽-hGH融合蛋白的编码序列如SEQIDNO:3所示:[0028]ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAAT[0029]GCCTATGCATTCCCAACTATACCACTAAGTCGACTATTCGATAACG[0030]CTATGCTTCG[0031]GGCCCATCGTCTTCATCAGCTAGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAG[0032]AGGCCTATATCCCCAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAAC[0033]CCCCAGACCT[0034]CCCTCTGTTTCTCAGAATCGATTCCGACACCCTCCAATCGCGAGGAAACACAACAGAAAT[0035]CCAACCTAGAGCTCCTCCGCATAAGCTTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTCGAGCCCGTGC[0036]AGTTCCTGAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTCTACGGCGCCTCTGATTCGAACGTGT[0037]ACGACCTGCTGAAGGACCTAGAGGAAGGGATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATG[0038]GCAGCCCGCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCAC[0039]ACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGG[0040]ACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCT[0041]TCTAG(SeqIDNO:3)[0042]信号肽-hGH融合蛋白的两段氨基酸序列之间添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表达时切割获得基因重组hGH。[0043]在本发明的第二方面，我们将上述操纵子克隆至携带任意复制子(包括pMBl、P15A、ColEl和pSClOl复制子)的大肠杆菌质粒载体中发挥高效分泌表达重组hGH的作用。我们将优化的hGH编码序列应用NcoI和HindIII酶切后插入到大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的后面，这样设计的好处在于我们可以得到与天然hGH氨基酸序列相同的蛋白质序列而不用担心有其他杂质氨基酸掺入。[0044]在本发明的第三方面，提供一种用于本发明的方法的表达载体和宿主细胞，它含有本发明上述的大肠杆菌操纵子的表达质粒。所述的宿主细胞包括DH5a、JM109、JM109(DE3)、BL21、BL21(DE3)及其衍生株、Rosetta、Rosetta(DE3)及其衍生株、W3110、YK537、C41(DE3)和C43(DE3)。优选的所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。该菌体的细胞壁较脆弱，在反复冻融的条件下就可破裂，释放出周质间隙中的蛋白。[0045]本发明的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株QJSW-SZ01，2013年2月26日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.:7258o[0046]在本发明的第四方面，提供了一种生产重组hGH的方法，它包括步骤:[0047](a)通过LB培养基和改良种子培养基进行工程菌的活化和扩增，在适当的罐内培养基及补料方式，培养参数控制条件下表达重组hGH；[0048](b)通过低温高速离心或超滤方式获得含人hGH的菌体。在另一优选例中，所述的表达载体是含IPTG诱导的启动子的表达载体pET22b(+)-rhGH,或者所述的宿主细胞是大肠杆菌。[0049]在另一优选例中，在步骤(a)中进行高密度发酵。[0050]在另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤:[0051](i)采用冻融破碎发酵菌体,低温高速离心弃沉淀收上清；[0052](?)通过盐析和或超滤对破菌液上清液进行初步纯化；[0053](iii)柱层析采用:阳离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析及其组合。[0054]本发明涉及一种表达重组hGH的大肠杆菌操纵子、含有该操纵子序列的表达质粒以及用含有该操纵子的表达质粒转化得到的分泌表达重组hGH的工程菌。其优点在于，通过改造大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列，突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构，同时在其末端改变一个氨基酸使其更利于引导人hGH分泌表达，蛋白表达通过大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控，同时利用大肠杆菌T7终止子来增强表达过程中的翻译效率。[0055]本发明的特点为一种带有大肠杆菌色氨酸启动子和优化改造过的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽的大肠杆菌操纵子。利用上述操纵子构建的表达载体转化抗性适合的宿主，可得到能够高效分泌表达重组hGH的工程菌，得到了良好的分泌表达效果，解决了小分子异源蛋白在大肠杆菌中表达时易被降解而造成的表达量过低的问题。本发明所述的方法可以兼顾表达产量，纯化工艺、产物活性和最终的氨基酸组成，具有很高的应用价值。[0056]本发明的优点在于:[0057](I)表达工艺简单。[0058](2)表达量高。[0059](3)纯化工艺简便，回收率高。由于蛋白可以分泌到细胞周质中表达，因此简化了纯化工序,提高了成品率,使大规模生产rhGH成为可能。[0060]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法。【专利附图】【附图说明】[0061]图1为提纯产物rhGH的电泳图(rhGH电泳图)；[0062]提纯产物与标准品(中检所)进行电泳对比确定分子量及电泳纯度。[0063]图2为rhGH酶切高效液相鉴定色谱图(rhGH酶切谱图)；[0064]取重组人生长激素对照品，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)制成每1ml中含2mg的溶液，取此液300μ1、胰蛋白酶溶液[取经TPCK处理的胰蛋白酶适量，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(ΡΗ7.5)制成每1ml中含2mg的溶液]20μI与三羟甲基氨基甲烷缓冲液(ρΗ7.5)300μ1，混匀，置37°C水浴中4小时，立即置_20°C终止反应，作为对照品溶液。取本申请rhGH，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)制成每1ml中含2mg的溶液，取此液300μI,同法制备，作为供试品溶液；通过高效液相色谱法对本申请rhGH和对照品的酶切肽图进行对比基本一致。[0065]图3为提纯产物rhGH的高效液相纯度检测结果图(rhGH高效液相色谱图)；[0066]通过高效液相法对提纯产物进行纯度检测，按面积归一化法计算，总相关蛋白质含量不得过6.0%。提纯的产物在95%以上。[0067]图4为鉴定提纯产物rhGH精确分子量的质谱检测结果图Dl(rhGH质谱图-Dl)；图5为鉴定提纯产物rhGH精确分子量的质谱检测结果图D2(rhGH质谱图-D2)。[0068]Dl,D2均是用水(含0.1%TFA)配置成摩尔浓度为10umol/L;基质HCCA或者CHCA用TA30(50%ACN,50%H20,0.1%TFA)配置成质量浓度为10mg/ml。[0069]MALD1-TOFMS条件:[0070]仪器:AutoflexspeedTOF/TOF(BrukerDaltonics,Germany)[0071]激光源:Nd:YAG355nm[0072]加速电压:19.5kV.[0073]激光器能量:75-80%[0074]延迟时间:500ns[0075]测试方法:线性正离子模式，实际分子量扫描区间为5000-30000。[0076]对提纯产物精确分子量进行质谱检测。【具体实施方式】[0077]本发明人经过深入研究，用优选的载体pET22b(+)进行表达，该载体有助于hGH真核基因在原核中的正确折叠，并以可溶性形式分泌到细胞周质间隙中，只通过反复冻融菌体就可释放出目的蛋白，从而简化了分离纯化工艺。[0078]在另一优选例中，用本发明优化的hGH编码序列转化的大肠杆菌BL21(DE3)，经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhGH以可溶、活性形式存在于细胞周质，同时简便纯化工艺，通过反复冻融的方法即可以破碎菌体，获得高表达、高得率、极具产业化价值的一种制备rhGH的方法。[0079]本发明的载体包括表达质粒，例如含IPTG诱导的启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中插入了hGH的编码序列。一种优选的表达载体是载体pET20b(+)、pET22b(+)、pET26b(+)和pET27b(+)。适用于本发明的宿主菌是原核宿主细胞，尤其是大肠杆菌BL21(DE3)。[0080]在本发明中，工程菌表达rhGH的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。通常，工程菌在以蛋白胨、酵母粉、NH4Cl等为氮源，甘油、葡萄糖、糖蜜等为碳源，磷酸盐等为无机盐，添加维生素及微量元素作为基础培养基；并通过控制参数(pH、温度、罐压、搅拌速度等)的调节及流加方式(酸碱及营养元素)，调节溶氧(DO)，比生长速率等因素，减少乙酸的积累，提高了菌体产量及表达水平。[0081]对于培养基的选择，通常包括氮源、碳源、无机盐、维生素、微量元素等的选择。[0082](a)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源为蛋白胨、酵母粉的混合物，总浓度1.5-4%;无机氮源如氨水或NH4Cl等铵盐，浓度0.4-1%。[0083](b)无机盐包括磷酸盐、镁盐、钙盐等。较佳的磷酸盐缓冲体系浓度20_50mM，ρΗ6.5-7.5;镁盐、钙盐浓度为0.1-1mM0[0084](c)在培养基中添加维生素B作为生长因素，浓度1-50μg/L。[0085](d)微量元素包括Fe3+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、硼酸等，浓度为10-8-l(T6mM。[0086](e)碳源包括甘油、葡萄糖、糖蜜等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳的甘油浓度为3-6%;葡萄糖浓度为3-5%。[0087](f)诱导剂使用IPTG，较佳的浓度在0.5-0.8mM；[0088](g)培养阶段溶氧(DO)30%以上，诱导阶段在50%以上；pH培养阶段控制在6.8-7.0,诱导阶段控制在7.2-7.4;温度培养阶段控制在35-37°C，诱导阶段控制在30-32°C；[0089]在发酵表达rhGH后，以离心方式去除发酵液上清，获得菌体。应用反复冻融的方式进行破菌，用缓冲溶液悬浮菌体后，对粗提液进行离心，去沉淀，收获上清液。粗提液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。[0090]适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析。[0091](a)离子层析。选择CMSepharoseFastF凝胶介质,盐梯度洗脱。[0092](b)亲和层析:选择肝素亲和HeparinSepharoseCL-6B凝胶介质,盐梯度洗脱。经过二步纯化，可得到纯度95%以上的rhGH蛋白。[0093]纯化后rhGH可用常规技术制成各种剂型。[0094]在本发明的一个实例中，选择了有助于真核基因在原核细胞中正确翻译的分泌型质粒载体:含IPTG诱导的启动子的表达载体，且在所述表达载体中插入了rhGH的编码序列，构建高效、稳定分泌表达的rhGH工程菌(大肠杆菌)。经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhGH以可溶形式存在于细胞周质；表达水平高，占菌体总蛋白20%左右。由于表达水平较高，rhGH又可以分泌到细胞周质中，且具有天然活性，不但避免了粗提过程对蛋白质的破坏，而且提高了纯化收率，降低了成本。通过简便、快速的纯化方法，即获得高质量的hGH纯品O[0095]实施例1:rhGH表达工程菌的构建[0096]1、优化基因的获得[0097]根据已知的hGH的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变`氨基酸序列的条件下，设计hGH的编码序列引物。通过PCR方法获得rhGH的全长序列。大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列由宝生物合成。[0098]2、表达质粒pET22b(+)-rhGH的构建与转化宿主菌[0099]表达质粒为购自InVitrogen公司的pET22b(+)表达载体(该表达载体含有IPTG诱导的启动子和PeIB分泌信号肽)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。[0100]用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切分别处理合成的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽和重组hGH的编码序列，以及表达载体pET22b(+)，37°C酶切2小时回收相应的片段，用T4DNA连接酶在16°C连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(100ug/mL)的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定:抽提的质粒DNA用限制性内切酶及Ncol+Hindlll在37°C反应3小时，获得在pET22b(+)中插入了rhGH基因的重组质粒pET22b(+)-rhGHο[0101]利用菌落PCR进行阳性鉴定。应用Ncol+Hindlll双酶切鉴定序列已正确插入载体pET22b(+)中。此外，用常规方法进行正、逆向序列分析，委托大连宝生物公司进行序列的测定，证实克隆序列与设计序列完全一致。[0102]摇瓶试验，该工程菌培养后，经IPTG诱导2小时后，目的蛋白表达量占总蛋白20%左右。[0103]实施例2合适表达载体的选择[0104]按照实施例1类似的方法，将hGH序列分别插入几个不同的表达载体，如pET28a(+)(购自invitorgen公司)、pET29a(+)(购自invitrogen公司)、pET_30Ek/LIC购自invitorgen公司)的相同酶切位点(Ncol/Hindlll),获得质粒pET28a(+)-rhGH、pET29a(+)-rhGH,pET-30Ek/LIC_rhhGH。[0105]将质粒pET28a(+)-rhGH、pET29a(+)-rhGH,pET-30Ek/LIC_rhGH分别转化相应的宿主菌，挑选出抗性菌株。与含质粒pET22b(+)/rhGH的工程菌一起进行摇瓶试验，经IPTG(或阿拉伯糖)诱导2小时后，含质粒pET22b(+)-rhGH的工程菌表达的目的蛋白表达量占总蛋白20%左右，而含质粒pET28a(+)_rhGH、pET29a(+)-rhGH,pET-30Ek/LIC_rhGH的工程菌表达的目的蛋白表达量分别占总蛋白10%，12%和13%。这表明，pET22b(+)-rhGH表达载体优于其他表达载体。[0106]实施例3最佳培养基的选择[0107]挑实施例1中制备的转入pET22b(+)-rhGH的大肠杆菌BL21(DE3)单克隆，接种到含50mlLB种子液的250ml三角烧瓶中，培养3-4hr，待OD6tltl达到0.8-1.0，按I:10的比例接种于含250ml改良种子液的1000ml三角烧瓶中，培养8_10h左右，待0D_达到6_8，按I:10上罐发酵，流加碳源(甘油)、镁盐、氨水调节pH6.8-7.0、温度37°C、DO>30%，待0D_达到15-18，加入0.5-0.8mMIPTG开始诱导，适当补加碳源(甘油)、氮源、磷酸盐缓冲液调节PH7.2-7.4、DO>50%、温度30_32°C、诱导4_5hr结束。样品进行SDS-PAGE检测、测定蛋白含量。[0108]实施例4rhGH分泌表达工程菌的构建及高密度发酵[0109]用质粒pET22b(+)-rhGH转化大肠杆菌空宿主BL21(DE3)、Rosseta(DE3)、W3110和C43(DE3)，将得到的工程菌通过AP5培养基摇瓶培养，SDS-PAGE电泳鉴定表达结果。AP5培养基成分:0.15%葡萄糖，1.1%酸水解酪蛋白，0.06%酵母抽提物，0.019%MgS04,0.107%NH4C1，0.373%KC1，0.12%NaCl，0.12mol/L三乙醇胺ρΗ7.4。[0110]高密度发酵:将菌种接种到含50mlLB种子液的250ml三角烧瓶中，培养3_4hr，待OD600达到0.8-1.0，按I:10的比例接种于含250ml改良种子液的1000ml三角烧瓶中，培养8-10h左右，待0D_达到6-8，按1:10上罐发酵，流加碳源(甘油)、镁盐、氨水调节ρΗ6.8-7.0、温度37。。、DO>30%，待OD600达到15-18，加入0.5-0.8mMIPTG开始诱导，适当补加碳源(甘油)、氮源、磷酸盐缓冲液调节PH7.2-7.4、DO>50%、温度30_32°C、诱导5hr结束。样品进行SDS-PAGE检测，在24kD左右获得清晰条带(图1)。[0111]实施例5rhGH的纯化[0112]发酵液在4°C下5000rpm离心10min，得菌体，菌体_80°C速冻24h后室温缓慢融化，再-20°C冷冻7天后室温缓慢融化。显微镜观察，菌体细胞壁破裂，成为原生质球。20000rpm离心30min,得上清。超滤浓缩及更换缓冲液:使用Millipore超滤器,超滤膜截流分子量为10KD，超滤时留取浓缩液(作用是去除小分子杂质和盐类)。[0113]1.层析I(阳离子层析)[0114]层析介质:CMSepharoseFastF[0115]缓冲液:溶液A:PBS(PH7.4，20mM)[0116]溶液B:PBS(PH7.4，20mM)+IMNaCl[0117]上样:将超滤浓缩的rhKGF-2溶液上样。[0118]清洗:上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。[0119]梯度:清洗后用IOCV将溶液B从0%升至100%。[0120]收集:收集rhGH样品峰。[0121]2.层析2(亲和层析):[0122]层析介质:HeparinSepharoseCL-6B[0123]缓冲液:溶液A:PBS(PH7.4，20mM)[0124]溶液B:PBS(ρΗ7.4，20mM)+IMNaCl[0125]上样:将离子交柱层析蛋白溶液上样。[0126]清洗:上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。[0127]梯度:清洗后用IOCV将溶液B从0%升至100%。[0128]收集:收集rhGH样品峰。[0129]样品经过此二步纯化，即离子层析、亲和层析以后，纯度提高至95%以上。按照《中国药典2010版中国药品检测标准操作规程》中，生长激素生物活性的测定方法检测，分别根据方法一去垂体大白鼠体重法和方法二去垂体大白鼠胫骨法进行检测，通过计算，本申请rhGH提纯产物与标准品具有相同的生物活性。[0130]本发明提供了一种分泌表达重组人hGH的制备方法，该方法提供了一种重组hGH的表达载体，它含有分泌信号肽编码序列，能将hGH蛋白分泌到细胞周质中进行表达，含有此重组质粒的宿主细胞经低温反复冻融，在不破坏细菌内膜的情况下即可使重组蛋白释放到缓冲液中，不破坏蛋白的活性。`【权利要求】1.一种表达重组人生长激素(rhGH)的大肠杆菌操纵子，其结构包括:大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、经过优化改造的大肠杆菌耐热肠毒素信号肽(heat-stableenterotoxinsignalP印tide)的编码序列、优化的重组人hGH的编码序列(SeqIDN0:2)和大肠杆菌T7终止子。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌操纵子，其特征在于包含的经过优化改造的大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列如下所示:ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTAT(SeqIDNO:1)。3.根据权利要求1所述的大肠杆菌操纵子，其特征在于，利用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控权利要求2所述的信号肽引导的hGH分泌表达。4.含有权利要求1所述的大肠杆菌操纵子的大肠杆菌质粒，其特征在于，将权利要求1所述的操纵子克隆至携带任意复制子(包括pMBl、P15A、ColEl和pSClOl复制子)的大肠杆菌质粒载体中，发挥分泌表达重组hGH的作用。5.根据权利要求4所述的大肠杆菌质粒，其特征在于，所述大肠杆菌质粒为pET22b(+)-rhGHο6.大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株QJSW-SZ01，2013年2月26日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.:7258。7.能够高效分泌表达重组hGH的工程菌，其特征在于，为权利要求4或5所述的表达质粒转化的抗性适合的大肠杆菌空宿主，包括DH5α、JM109、JM109(DE3)、BL2UBL21(DE3)及其衍生株、Rosetta、Rosetta(DE3)及其衍生株、W3110、YK537、C41(DE3)和C43(DE3)。8.一种生产重组hGH的方法，包括以下步骤:`(a)通过LB培养基和改良种子培养基进行工程菌的活化和扩增，在适当的罐内培养基及补料方式，培养参数控制条件下表达重组hGH；(b)通过低温高速离心或超滤方式获得含人hGH的菌体。9.根据权利要求8所述的方法，所述的表达载体是含IPTG诱导的启动子的表达载体pET22b(+)-rhGH,所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。10.根据权利要求8所述的方法，在步骤(a)中进行高密度发酵；所述的步骤(b)包括步骤:(i)采用冻融破碎发酵菌体，低温高速离心弃沉淀收上清；(?)通过盐析和或超滤对破菌液上清液进行初步纯化；(iii)柱层析采用:阳离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析及其组合。【文档编号】C12N1/21GK103882015SQ201310699346【公开日】2014年6月25日申请日期:2013年12月17日优先权日:2013年12月17日【发明者】席玥申请人:席玥