具有神经细胞保护活性的六个三萜皂苷类化合物的制作方法

本发明涉及一种药化合物，特别是涉及一种具有神经细胞保护活性的六个三萜皂苷类化合物。

背景技术：

随着人口老龄化问题日益突出，神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病是以特异性神经元渐进性损伤为主要特征的一类神经系统疾病，包括阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)、帕金森病(parkinsondisease，pd)、亨廷顿病(huntingtondisease，hd)和肌萎缩侧索硬化症等。神经退行性疾病的发病机制极其复杂，迄今尚未被完全阐明，目前缺乏有效的诊断和治疗方法。大量研究表明，氧自由基损伤(氧化应激，oxidativestress)在神经退行性疾病的机理中起重要作用，超氧阴离子、羟自由基及过氧化氢等氧自由基的堆积和损伤与神经退行性疾病的不断加重有关。天然抗氧化剂作为神经保护剂，在预防和治疗神经退行性疾病中发挥着重要作用。h2o2是氧自由基的一种主要形式，易于穿过细胞膜并引起细胞氧化应激，被广泛应用于构建体外模型来研究氧化应激机制和评估新药物疗法的神经保护潜能。人的神经母细胞瘤sh-sy5y细胞由于具有类似于神经元的细胞形态、生理及生化功能，经常用于神经细胞损伤的研究。本专利应用h2o2诱导sh-sy5y细胞构建氧化应激损伤细胞模型，初步证明分离得到的化合物是否具有抗氧化损伤的神经保护潜力。

紫花苜蓿(medicagosatival.)为豆科(leguminosae)蝶形花亚科(papilionoideae)车轴草族(trib.trifolieae)苜蓿属植物，是栽培最为广泛的牧草之一，其蛋白质含量高、适口性好、适应性强，被称为“牧草之王”。《本草纲目》谓其有“利五脏，轻身健人，洗去脾胃间邪热之气，通小肠诸恶热毒”之功效，传统医药中能增强记忆力，治疗咳嗽，肾结石，胃溃疡，关节炎和中枢神经系统疾病等。紫花苜蓿富含多种化学成分，包括三萜皂苷、黄酮、生物碱、香豆素以及多糖等。其中，三萜皂苷类化学成分为主要的活性次级代谢产物之一，有着广泛的生物活性。经查，现有技术中未见有本发明的化合物及其具有抗神经退行性疾病价值治疗前景的活性的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有神经细胞保护活性的六个三萜皂苷类化合物，该化合物具有抗神经退行性疾病价值的新化合物1-6，以其为活性成分的药物组合物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

具有神经细胞保护活性的六个三萜皂苷类化合物，所述化合物从干燥的紫花苜蓿(medicagosatival.)根部分离得到具有下述结构式的新化合物1-6：

所述的具有神经细胞保护活性的六个三萜皂苷类化合物，所述化合物的制备如下：制备化合物1-6的方法，紫花苜蓿(7.0kg)用70%乙醇水加热回流提取三次，每次2小时；提取液减压浓缩得到粗体物，将粗体物用水分散，用二氯甲烷萃取三次，得到水层(1.5kg)；水层经减压大孔树脂柱色谱，分别用乙醇水(0,30%,50%,70%和95%,v/v)洗脱，得到组分1-5；薄层色谱分析后，4和5组分合并(600.0g)过减压硅胶柱用ch2cl2/meoh(50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1,v/v)洗脱，得到组分a-h；c组分(43.0g)过硅胶开放柱用ch2cl2/meoh(50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1,v/v)洗脱，得到组分c1-c4；接着c3组分(14.0g)再过硅胶开放柱用ch2cl2/meoh(30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1,v/v)洗脱，得到组分c3-1-c3-4；c3-3组分(4.7g)经ods柱色谱用meoh-h2o(40%,60%,80%和100%,v/v)洗脱，得到组分c3-3a-c3-3e。组分c3-3c用半制备hplc(示差折光检测器)制备，得到化合物2(4.9mg,tr=51.2min)和4(6.1mg,tr=38.9min)，流动相为70%meoh-h2o；组分c3-3b用上述所示方法得到化合物3(33.0mg,tr=26.5min)和6(4.5mg,tr=20.8min)；组分c3-3d用示差hplc制备(72%meoh-h2o)得到化合物5(5.5mg,tr=36.7min)和1(4.2mg,tr=40.5min)。

所述的具有神经细胞保护活性的六个三萜皂苷类化合物，所述化合物在制备神经退行性疾病药物中的应用。

本发明的优点与效果是：

本发明化合物1-6进行h2o2诱导的sh-sy5y神经细胞损伤保护活性测试，六个新化合物均有较好的神经细胞保护活性，且呈现一定的量效关系。

本发明首次公开了紫花苜蓿根中六个新的三萜皂苷类化合物的结构。本发明通过对紫花苜蓿根的化学成分进行研究，从中分离得到六个三萜皂苷类新化合物。为进一步研究新化合物的生物活性，利用h2o2诱导sh-sy5y神经细胞损伤模型评价化合物的神经细胞保护作用。结果表明，结果表明六个新化合物具有显著的神经细胞保护作用，且其呈现明显的量效关系，显示该类化合物在制备抗神经退行性疾病药物中的应用前景。

附图说明

图1是化合物1的hresims图谱；

图2是化合物1的¹hnmr图谱；

图3是化合物1的¹³cnmr图谱；

图4是化合物1的hmbc图谱；

图5是化合物1的hsqc图谱；

图6是化合物1的¹h-¹hcosy图谱；

图7是化合物1的tocsy图谱；

图8是化合物1的noesy图谱；

图9是化合物2的hresims图谱；

图10是化合物2的¹hnmr图谱；

图11是化合物2的¹³cnmr图谱；

图12是化合物2的hmbc图谱；

图13是化合物2的hsqc图谱；

图14是化合物2的¹h-¹hcosy图谱；

图15是化合物2的tocsy图谱；

图16是化合物2的noesy图谱；

图17是化合物3的hresims图谱；

图18是化合物3的¹hnmr图谱；

图19是化合物3的¹³cnmr图谱；

图20是化合物3的hmbc图谱；

图21是化合物3的hsqc图谱；

图22是化合物3的¹h-¹hcosy图谱；

图23是化合物3的tocsy图谱；

图24是化合物3的noesy图谱；

图25是化合物4的hresims图谱；

图26是化合物4的¹hnmr图谱；

图27是化合物4的¹³cnmr图谱；

图28是化合物4的hmbc图谱；

图29是化合物4的hsqc图谱；

图30是化合物4的¹h-¹hcosy图谱；

图31是化合物4的tocsy图谱；

图32是化合物4的noesy图谱；

图33是化合物5的hresims图谱；

图34是化合物5的¹hnmr图谱；

图35是化合物5的¹³cnmr图谱；

图36是化合物5的hmbc图谱；

图37是化合物5的hsqc图谱；

图38是化合物5的¹h-¹hcosy图谱；

图39是化合物5的tocsy图谱；

图40是化合物5的noesy图谱；

图41是化合物6的hresims图谱；

图42是化合物6的¹hnmr图谱；

图43是化合物6的¹³cnmr图谱；

图44是化合物6的hmbc图谱；

图45是化合物6的hsqc图谱；

图46是化合物6的¹h-¹hcosy图谱；

图47是化合物6的tocsy图谱；

图48是化合物6的noesy图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。

实施例1：

化合物1-6的分离纯化：

紫花苜蓿(7.0kg)用70%乙醇水加热回流提取三次，每次2小时。提取液减压浓缩得到粗体物，将粗体物用水分散，用二氯甲烷萃取三次，得到水层(1.5kg)。水层经减压大孔树脂柱色谱，分别用乙醇水(0,30%,50%,70%和95%,v/v)洗脱，得到组分1-5。薄层色谱分析后，4和5组分合并(600.0g)过减压硅胶柱用ch2cl2/meoh(50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1,v/v)洗脱，得到组分a-h。c组分(43.0g)过硅胶开放柱用ch2cl2/meoh(50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1,v/v)洗脱，得到组分c1-c4。接着c3组分(14.0g)再过硅胶开放柱用ch2cl2/meoh(30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1,v/v)洗脱，得到组分c3-1-c3-4。c3-3组分(4.7g)经ods柱色谱用meoh-h2o(40%,60%,80%和100%,v/v)洗脱，得到组分c3-3a-c3-3e。组分c3-3c用半制备hplc(示差折光检测器)制备，得到化合物2(4.9mg,tr=51.2min)和4(6.1mg,tr=38.9min)，流动相为70%meoh-h2o。组分c3-3b用上述所示方法得到化合物3(33.0mg,tr=26.5min)和6(4.5mg,tr=20.8min)。组分c3-3d用示差hplc制备(72%meoh-h2o)得到化合物5(5.5mg,tr=36.7min)和1(4.2mg,tr=40.5min)。

化合物1-6的结构确证：

化合物1-6的结构式如下所示：

化合物1：3-o-[β-d-xylopyranosyl(1→3)-β-d-glucopyranosyl]-28-o-[β-d-xylopyranosyl(1→4)-α-l-rhamnopyranosyl(1→2)-α-l-arabinopyranosyl]hederagenin,白色无定形粉末，易溶于甲醇等有机溶剂，hresimsm/z1211.5417[m+cl]⁻(calcdforc57h92o25cl,1211.5611)。¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据见下表；

化合物2：3-o-[α-l-arabinopyranosyl(1→2)-β-d-glucopyranosyl(1→2)-β-d-xylopyranosyl]hederagenin28-o-β-d-glucopyranosylester,白色无定形粉末。hresimsm/z1059.5387[m−h]⁻(calcdforc52h83o22,1059.5371)。¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据见下表；

化合物3：3-o-[β-d-xylopyranosyl(1→2)-β-d-glucopyranosyl(1→2)-β-d-glucopyranosyl]hederagenin28-o-β-d-glucopyranosylester,白色无定形粉末。hresimsm/z1089.5474[m−h]⁻(calcdforc53h85o23,1089.5476)。¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据见下表；

化合物4：3-o-[β-d-glucopyranosyl(1→2)-β-d-glucopyranosyl(1→2)-α-l-arabinopyranosyl]hederagenin28-o-β-d-glucopyranosylester,白色无定形粉末。hresimsm/z1089.5476[m−h]⁻(calcdforc53h85o23,1089.5476)。¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据见下表。

化合物5：3-o-[β-d-glucopyranosyl(1→2)-β-d-glucopyranosyl-(1→2)-β-d-glucopyranosyl]medicagenicacid,白色无定形粉末。hresimsm/z1011.4778[m+na]⁺(calcdforc48h76o21na,1011.4771)。¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据见下表。

化合物6：3-o-[β-d-xylopyranosyl(1→2)-β-d-glucopyranosyl(1→2)-β-d-glucopyranosyl]-28-o-β-d-glucopyranoside-2β,3β-dihydroxyolean-12-en-23-ale-28-oicacid,白色无定形粉末。hresimsm/z1103.5303[m−h]⁻(calcdfor1103.5269)。¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据见下表。

表1：化合物1-6苷元部分的结构鉴定¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据：

表2：化合物1-6糖部分的结构鉴定¹h(600mhz,c5d5n)和¹³cnmr(150mhz,c5d5n)数据：

实施例2：

本发明化合物及其与药用辅料组成的药物组合物的神经退行性疾病的药理作用。

化合物1-6的神经细胞保护活性实验。

实验原理：

cck-8试剂中含有wst–8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。sh-sy5y细胞系是人神经母细胞瘤细胞，采用h2o2诱导其凋亡作为神经退行性疾病模型。加药后如果有神经细胞保护活性，可以检测到细胞活力显著上升。

化合物1-6样品溶液的配制：准确称取样品1mg，用dmso溶解成高浓度的母液，4^oc保存，实验时用培养液稀释至所需的浓度。

h2o2：用去离子水将h2o2配成浓度为10mmol/l的母液，4^oc避光保存，实验时用培养液稀释至600μmol/l。

实验操作步骤：采用h2o2诱导神经母细胞瘤sh-sy5y细胞株损伤模型，以cck-8法对化合物1-6进行神经保护活性测试。sh-sy5y细胞传代进行常规培养后，接种于96孔板，细胞密度为1×10⁴个/ml在37°c、5%co2培养箱中静置培养24h至细胞贴壁。加入至每孔终浓度为25,50,100μmol/l的化合物，放置于培养箱中培养1h，再加入600μmol/l的h2o2作用4h，cck-8检测细胞活性。阴性对照组：细胞在传代进行常规培养接种于96孔板后，不用药物及h2o2做任何处理，其它实验步骤与给药组相同。阳性对照组：以trolox为阳性对照药代替给药组中的药物，其它实验步骤与给药组相同。空白对照组：孔内不接种细胞，不用药物及h2o2做任何处理，其它实验步骤与给药组相同。用graphpadprism5统计软件进行统计，数据以均数±标准差(mean±sd)表示，并进行one-wayanova的newman-keulsmultiplecomparison检验。

存活率(%)=[a450(给药组)-a450(空白对照)]/[a450(阴性对照)-a450(空白对照)]×100%

结果表明，化合物1-6可以作为抑制过氧化氢诱导的sh-sy5y神经细胞损伤保护作用的先导化合物进行后续衍生化开发

表3：化合物1-6对h2o2诱导的sh-sy5y细胞氧化损伤的保护作用(means±sd,n=3)

^*p<0.05,^**p<0.01and^***p<0.001与h2o2诱导损伤组比较。