本发明涉及生物领域，尤其涉及一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法
背景技术：
罗汉果为葫芦科，是罗汉果属的雌雄异株植物，具有重要的医疗和保健价值。罗汉果果实营养价值高，含有丰富的果糖、葡萄糖、蛋白质和多种维生素，其性凉味甘，具有清热解毒、止咳润肺等功效，已广泛应用于医药、饮料和调味品中。罗汉果甜度高、热量低、无毒，可作为肥胖病人、糖尿病人、高血压病人理想的食品添加剂。在历届《中国药典》中均有记载，具有清热润肺、滑肠通便的功效，用于治疗肺火燥咳。现代药理研究，其药理有效成分主要是罗汉果皂普。目前，罗汉果优良品种稀少、种性退化、混杂严重、产量低、品质差。迄今为止，国内对罗汉果的研究主要集中在选育品种方面，对于罗汉果的发育机理研究较少，植株的蛋白质有效成分研究尚未见报道。
由于罗汉果植物叶片本身蛋白含量低，且常含有大量色素、酚类、有机酸、脂类及其他次生代谢产物，蛋白质提取有一定的难度，获得的蛋白质样品溶液粘稠，由于蛋白质样品中含有大量的多糖类物质，在使用丙酮等有机溶剂沉淀蛋白的同时，多糖类物质也沉淀下来。多糖类物质可溶于水，从而导致蛋白质样品溶液粘稠并影响蛋白质的溶解，进而影响了蛋白质样品的上样量和电泳的质量。传统方法主要采用酚法进行了植物叶片蛋白质提取，利用多糖类物质不溶于酚相这一特征，可使用饱和酚萃取蛋白，从而除去样品中的多糖类及其他不溶于酚的物质，但酚法无法有效去除多酚类和盐类物质。因此，酚法提取得到的罗汉果叶片蛋白质质量不佳，无法用于下一步蛋白质组学分离，进而无法进行蛋白质组学分析。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，本发明方法能够解决传统的酚提取法提取植物叶片蛋白质产生时无法有效去除多酚类和盐类物质的问题，实现了罗汉果叶片总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于蛋白质组学分析。
本发明的具体技术方案为：一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，包括以下步骤：
s1：将经过预处理的罗汉果叶片粉末与蛋白质提取液混合，于-15~-25℃中静置，离心，取下层沉淀；所述蛋白质提取液为：每300ml蛋白质提取液中含有40-50ml1mtris-hcl，70-80ml甘油和5-7g聚乙烯吡咯烷酮。
本发明利用蛋白质提取液对罗汉果叶片细胞进行有效破碎，得到蛋白质、糖类、脂类、细胞器、色素、昌醇等，而离心可以使得蛋白质和脂类物质进行有效分离，蛋白质主要集中在沉淀层，而多数的糖类、脂类、色素、昌醇等物质都溶解于所述蛋白质提取液，也就是溶于上层清液，被带走；若蛋白质提取液的加入量不足，会导致细胞破碎效果差，进而影响提纯效果，而加入量多，则造成不必要的浪费。
s2：将所述沉淀经冷冻干燥后粉碎得到沉淀粉末，保存备用。
s3：将所述沉淀粉末与蛋白质裂解液混合，于-6~-1℃下裂解11-13h，得罗汉果叶片裂解溶液。
所述蛋白质裂解液的制备方法为：按质量比96:30-31:6-9:1-2将尿素、硫脲、3-[（3-胆酰胺基丙基）二甲基铵基]-1-丙磺酸盐以及二硫苏糖醇混合均匀，加入双蒸水，于-15~-25℃保存备用。
将沉淀粉末中的蛋白质进行溶解，以实现可溶蛋白质与不可溶杂质的进一步分离。
蛋白质裂解液中，尿素可以降低蛋白质的活度系数促进其溶解，尿素添加不易过多，否则会使蛋白质变性，硫脲也可以促进蛋白质溶解。
s4：将所述罗汉果叶片裂解溶液离心，取上层清液，干燥即得罗汉果叶片总蛋白质。
作为优选，s1中，所述蛋白质提取液的加入量为每1g罗汉果叶片粉末添加2-4ml。
作为优选，s1中，静置时间为10-14h；离心条件为：1-5℃，10000-14000r/min，20-40min。
作为优选，s1中，所述预处理为：将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯毗咯烷酮，研磨，得罗汉果叶片粉末。
本发明用液氮研磨罗汉果叶片，可以研磨得更细，更充分，而且液氮低温使得细胞内的酶钝化，能够更好的保持蛋白质的完整性，防止或被破坏，为后续的组学分析做准备。
作为优选，预处理时，将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1:16-20混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为18-22mpa，萃取温度为30-33℃，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1:80-120混合，搅拌5-15min，加入摩尔浓度为0.4-0.6mol/l的碳酸氢钠溶液直至ph值为9.2-9.6，20-25℃下静置2-4h，清水洗至ph值为6.8-7.1，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末。
作为优选，s2中，在冷冻干燥之前将所述沉淀与质量分数为6-10％的氯化钠溶液按照质量比1:3-5混合，置于微波装置微波处理30-40s，微波功率为400-500w。
作为优选，s2中，保存温度为-15~-25℃。
作为优选，s3中，所述蛋白质裂解液的加入量为每1g沉淀粉末添加1ml。
作为优选，s3中，所述双蒸水的加入量为每0.48g尿素1ml。
作为优选，s4中，离心条件为：1-5℃，10000-14000r/min，28-32min。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1、解决了传统的酚提取法提取植物叶片蛋白质产生时无法有效去除多酚类和盐类物质的问题，实现了罗汉果叶片总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于蛋白质组学分析。
2、通过采用微波装置进行微波处理，工艺简单，节能、污染小，进一步提高了蛋白质提取效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
s1：将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯毗咯烷酮，研磨；将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1:16-20混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为18-22mpa，萃取温度为30-33℃，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1:80-120混合，搅拌5-15min，加入摩尔浓度为0.4-0.6mol/l的碳酸氢钠溶液直至ph值为9.2-9.6，20-25℃下静置2-4h，清水洗至ph值为6.8-7.1，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末。
将预处理得到的罗汉果叶片粉末与蛋白质提取液混合，于-20℃中静置10h，4℃下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，其中，所述蛋白质提取液的加入量为每1g罗汉果叶片粉末添加2ml。
所述蛋白质提取液为：每300ml蛋白质提取液中含有45ml1mtris-hcl，75ml甘油和6g聚乙烯吡咯烷酮。
s2：将所述沉淀与质量分数为8％的氯化钠溶液按照质量比1:4混合，置于微波装置微波35s，微波功率为450w，经冷冻干燥后粉碎得到沉淀粉末，于-20℃保存备用。
s3：将所述步骤s2得到的沉淀粉末与蛋白质裂解液混合，于4℃裂解11h，得罗汉果叶片裂解溶液，其中，所述蛋白质裂解液的加入量为每1g所述沉淀粉末添加1ml。
所述蛋白质裂解液的制备方法为：按质量比96:30:6:1将尿素、硫脲、3-[（3-胆酰胺基丙基）二甲基铵基]-1-丙磺酸盐以及二硫苏糖醇混合均匀，加入双蒸水，于-20℃保存备用，所述双蒸水的加入量为每0.48g尿素需1ml。
s4：将所述罗汉果叶片裂解溶液于4℃离心28min，转速为12000r/min，取上层清液，干燥后即为罗汉果叶片总蛋白质，所得物质纯度为81.3％，收率83.2％。
实施例2
s1：将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯毗咯烷酮，研磨；将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1:16混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为18mpa，萃取温度为30℃，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1:80混合，搅拌15min，加入摩尔浓度为0.4mol/l的碳酸氢钠溶液直至ph值为9.2，20℃下静置4h，清水洗至ph值为6.8，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末。
将预处理得到的罗汉果叶片粉末与蛋白质提取液混合，于-20℃中静置10h，4℃下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，其中，所述蛋白质提取液的加入量为每1g罗汉果叶片粉末添加3ml。
所述蛋白质提取液为：每300ml蛋白质提取液中含有45ml1mtris-hcl，75ml甘油和6g聚乙烯吡咯烷酮。
s2：将所述沉淀与质量分数为8％的氯化钠溶液按照质量比1:4混合，置于微波装置微波35s，微波功率为450w，经冷冻干燥后粉碎得到沉淀粉末，于-20℃保存备用。
s3：将所述步骤s2得到的沉淀粉末与蛋白质裂解液混合，于4℃裂解11h，得罗汉果叶片裂解溶液，其中，所述蛋白质裂解液的加入量为每1g所述沉淀粉末添加1ml。
所述蛋白质裂解液的制备方法为：按质量比96:31:8:1将尿素、硫脲、3-[（3-胆酰胺基丙基）二甲基铵基]-1-丙磺酸盐以及二硫苏糖醇混合均匀，加入双蒸水，于-20℃保存备用，所述双蒸水的加入量为每0.48g尿素需1ml。
s4：将所述罗汉果叶片裂解溶液于4℃离心28min，转速为12000r/min，取上层清液，干燥后即为罗汉果叶片总蛋白质，所得物质纯度为85.3％，收率85.2％。
实施例3
s1：将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯毗咯烷酮，研磨；将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1:20混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为22mpa，萃取温度为33℃，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1:120混合，搅拌5min，加入摩尔浓度为0.6mol/l的碳酸氢钠溶液直至ph值为9.6，25℃下静置2h，清水洗至ph值为7.1，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末。
将预处理得到的罗汉果叶片粉末与蛋白质提取液混合，于-20℃中静置10h，4℃下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，其中，所述蛋白质提取液的加入量为每1g罗汉果叶片粉末添加4ml。
所述蛋白质提取液为：每300ml蛋白质提取液中含有45ml1mtris-hcl，75ml甘油和6g聚乙烯吡咯烷酮。
s2：将所述沉淀与质量分数为8％的氯化钠溶液按照质量比1:4混合，置于微波装置微波35s，微波功率为450w，经冷冻干燥后粉碎得到沉淀粉末，于-20℃保存备用。
s3：将所述步骤s2得到的沉淀粉末与蛋白质裂解液混合，于4℃裂解11h，得罗汉果叶片裂解溶液，其中，所述蛋白质裂解液的加入量为每1g所述沉淀粉末添加1ml。
所述蛋白质裂解液的制备方法为：按质量比96:31:9:2将尿素、硫脲、3-[（3-胆酰胺基丙基）二甲基铵基]-1-丙磺酸盐以及二硫苏糖醇混合均匀，加入双蒸水，于-20℃保存备用，所述双蒸水的加入量为每0.48g尿素需1ml。
s4：将所述罗汉果叶片裂解溶液于4℃离心28min，转速为12000r/min，取上层清液，干燥后即为罗汉果叶片总蛋白质，所得物质纯度为90.5％，收率91.9％。
为说明本发明的效果，将实施例提取的罗汉果总蛋白质双向电泳图与传统酚法提取的罗汉果总蛋白质双向电泳图进行对比，结果表明传统酚法提取的罗汉果总蛋白质的双向电泳图中，有较多拖尾现象，斑点呈现较少，说明该方法杂质多，干扰了蛋白质的分析而本方法提取总蛋白质的双向电泳图斑点拖尾较少，斑点呈现较多，说明该方法杂质少，蛋白质分析效果好。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。