T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的方法及相应的体外高效鉴定与流程

本发明涉及分子免疫学领域，具体涉及一种体外高效鉴定t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法。

背景技术：

t细胞是传染性和免疫性疾病研究的核心，在宿主抗胞内病原体感染免疫和内源性病变如肿瘤免疫，以及调度不同的免疫细胞功能中发挥着极其重要的作用。

slp-76是t细胞特异的免疫接头蛋白(immuneadaptors)，本身无酶活性，但在结构上常包含多种结构域功能区(domain)，通过这些功能区介导slp-76和其它蛋白信号分子相互作用，实现一系列tcr信号传导的调控功能。其一级结构主要功能区包括一个酸性的n末端区、中部的脯氨酸和精氨酸富集区和c末端相对保守的sh2结构域。n末端区包含一个sam功能区和三个酪氨酸磷酸化(活化)位点(tyr-113、tyr-128和tyr-145)，能分别结合nck、vav和itk的sh2区；而sam功能区能介导slp-76自身的聚合形成二聚体或多聚体并调控slp-76微聚体的形成。slp-76中部含有脯氨酸富集区和精氨酸富集区，前者与plcγ1组成性结合，后者与grb2相关的下游接头蛋白gads关联。c末端的sh2结构域介导slp-76与与下游adap的酪氨酸结合，对tcr介导的整合素活化和细胞的黏附有重要作用。slp-76是tcr信号传导核心信号轴(tcrp56lckzap-70latgadsslp-76)关键的“节点”枢纽分子,不仅能整合tcr近端(proximal)信号和远端(distal)信号，而且在tcr信号转导中发挥重要的调控作用。slp-76介导的tcr近端信号事件包括重要信号分子的酪氨酸磷酸化、相互作用和激活；而远端(distal)信号则包括erk、nf-b等重要信号路径的激活，细胞骨架重排，免疫粘附及细胞因子il-2分泌增加等。这些tcr信号级联反应最终导致t细胞分化、增殖、活化和效应免疫反应的获得。除此之外，slp-76对t细胞的发育也有重要作用，slp-76缺失小鼠胸腺细胞完全被阻滞在双阴性(cd4-cd8-)发育阶段。

泛素化(ubiquitination)和类泛化(smallubiquitin-likemodifier(sumo)ylation)是在多种细胞内实现对信号传导精细调控的两种蛋白质翻译后修饰的重要方式，广泛参与调节蛋白质功能和细胞生命活动各个环节。sumo分子和ubiquitin都是在结构上很相似的蛋白小分子。并且二者与底物的作用靶点都是赖氨酸(lysine),目前在真核生物中发现有四种sumo分子即sumo1-4,其介导的蛋白翻译后修饰即类泛素sumo化。尽管泛素化和sumo化二者修饰化学反应过程非常类似，而且作用的靶点都是赖氨酸(lys)，但是它们对被修饰蛋白功能的调控却截然不同。在多数情况下,泛素化和sumo化以拮抗性的方式调控底物蛋白的功能。不仅如此，在很多细胞中泛素化与类泛素化可作为一对相互制约的调控机制同时存在，并可修饰同一个靶标蛋白甚至竞争性修饰同一个蛋白上的同一个赖氨素残基如ib的k21位点，从而实现对靶标蛋白介导的信号传导路径一正一反的平衡调控。目前，泛素化通路在t细胞信号传导中的调控作用及其机制的研究已十分清楚：主要通过c-cbl、cbl-b和itch等泛素连接酶介导的泛素化修饰导致的降解作用。这些泛素连接酶在t细胞中的靶标分子包括包括lck、fyn、zap-70和slp-76等这些在t细胞激活信号传导中有重要作用的信号分子。这些分子被泛素化修饰后而被降解，从而下调tcr信号传导强度和t细胞免疫反应水平。

尽管类泛素化修饰过程与泛素化有诸多共同点，但到目前为止，t细胞中重要的靶标分子如何被类泛素化修饰仍知之甚少，尤其是关键的接头蛋白slp-76，目前尚无关于slp-76被类泛素化修饰的报道。并且当前缺少一种能直接检测判定slp-76类泛素化水平的分析方法，用传统方法鉴定slp-76是否被类泛素化修饰，并无法得到阳性结果。从技术上分析，可能的原因：一是类泛素化是可逆的过程，加上的类泛素分子可以被很快的去除，由senp1酶催化介导，且细胞内被类泛素化修饰的丰度普遍偏低，对检测方法的敏感度要求高；二是slp-76本身分子内作用牵制影响类泛素化的水平。

传统的鉴定类泛素化修饰的方法主要包括蛋白免疫印迹法、重组蛋白体外反应法、以及蛋白质谱学分析法：

1)蛋白免疫印迹法一般与蛋白共沉淀法联用，用需要被鉴定的蛋白的特异性的抗体富集该目标蛋白，再利用蛋白免疫印迹法，分析检测到的目标蛋白条带，如果在比目标蛋白分子量大的区域观察到能被此抗体检测到的条带，则可能为类泛素化修饰的蛋白。蛋白免疫印迹法直接简便，但技术影响因素较多，对操作者要求高，重复性不佳，蛋白免疫印迹法一般需与其他方法联用，增加鉴定的准确性。

2)重组蛋白体外反应法依托蛋白免疫印迹法，利用重组蛋白的具有蛋白(酶)活性的特点，把参与类泛素化修饰流程的各种酶和目标蛋白混合，在试管内进行体外修饰反应，再利用免疫印迹法，结合分析蛋白条带分子量大小，确定该蛋白是否被修饰。重组蛋白体外反应法成本高，对反应条件和蛋白样本的要求高(ph、缓冲液成分、温度、离子强度等)，与蛋白免疫印迹法相似，得到假阳性的可能比较大。

3)蛋白质谱法先利用蛋白沉淀法富集目标蛋白，利用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离，切胶将蛋白消化成小分子肽段，对肽段库进行数据库检索，匹配比较检测到的肽段质荷比与理论值的差别，从而判定该肽段是否存在修饰，并且得到修饰的肽段丰度判断目的蛋白被类泛素化修饰的可能性，方法灵敏度高，对于极低丰度的修饰亦可检测出。除去成本高昂、技术壁垒严重外，该方法用于类泛素化修饰最大的技术缺陷在于，类泛素化修饰发生于目标蛋白的赖氨酸残基，而用于消化的胰蛋白酶其酶切位点之一也是赖氨酸，因此该方法必须使用的胰酶消化会将sumo蛋白从赖氨酸位点上特异性地切下来，易产生假阴性结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法及相应的体外高效鉴定法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法，包括以下步骤：

1)、构建slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒：

将编码slp-76蛋白的序列插入pcdna3-mcs-ubc9质粒的多克隆位点内，从而构建slp-76-ubc9融合表达质粒(产生的融合蛋白分子量在100kd左右)；

编码slp-76-ubc9融合蛋白的序列为：

atggcactgaggaatgtgccctttcgctcagaggtcctgggctgggaccccgacagccttgctgactatttcaagaagctcaactataaggactgtgagaaggcagtgaagaagtaccacatcgatggggctcgcttcttgaacctgacagaaaatgacatccagaagttccccaagctccgggtgccgattctcagtaagttaagtcaggaaatcaacaagaacgaagagaggaggagcatcttcacacgcaaaccccaagtcccgcggtttcctgaagagacagaaagccacgaagaggacaatgggggctggtcgtcctttgaagaagacgattatgaaagtcccaatgatgaccaggatggggaggatgatggagactatgagtcccccaatgaggaggaagaggcacccgtggaagatgacgcggattatgagccgccaccctccaatgacgaggaagctctgcagaactccatcctgcctgccaagcctttccccaactccaactccatgtacatcgaccggcccccctctgggaaaaccccccagcagcctcctgtgcccccccagagaccgatggccgccctcccgcccccaccagccggccggaatcactcgccactgcccccaccccagaccaaccacgaagaacccagcagaagcagaaaccacaaaacggcaaagctccctgctccttcaatagacagaagcacgaaacctcccctagatcgttcattagctccgtttgatagagaacccttcacactaggaaagaaaccaccattttctgacaagccctcgattccagcgggaaggtcactcggggagcatttacccaagattcaaaagcctcctttaccaccgaccacggaaagacatgaaaggagcagccccctgccagggaagaagccacctgtgccaaagcatggatggggaccagacagaagagagaatgatgaagatgatgtgcatcagagacctttgccccagccagcactacttcctatgagctccaacactttcccttcaagatctactaagccaagtcccatgaaccctctcccatcctctcacatgcctggagcattctcagaaagtaacagcagttttccacagagtgcctccctgccaccatacttctctcaaggccctagcaacagaccacctatcagagccgaaggcagaaacttccccttgccacttccaaacaaacctcggcccccatcccccgcggaggaagagaattcattaaatgaagagtggtacgtttcttatattacccgaccagaggcagaagctgctcttagaaagataaaccaggatggcacatttctggtcagagacagctctaaaaaaacaacaaccaatccatatgtcctcatggtgttgtacaaagataaagtttacaacatccagatccgttatcagaaggaaagtcaagtttacttgttgggaactggactccgagggaaagaggactttctgtctgtgtcagatattattgactacttcaggaaaatgccacttctgctcattgatgggaaaaaccgaggttccagataccagtgcacattaacgcatgctgcagggtacccacgaggaggatcggggatcgccctcagccgccttgcgcaggaaaggaaagcctggaggaaggaccacccttttggctttgtagctgtcccaacaaagaaccctgatggcacaatgaacctgatgaactgggagtgcgctatccctggaaagaaggggactccatgggaaggaggcttgttcaagctacggatgcttttcaaagatgactatccgtcctcaccaccaaaatgtaaatttgagcccccactgtttcatccaaacgtgtatccttctggcacagtgtgcctgtccatcctggaggaagacaaggactggaggccagctatcaccatcaaacagatcttattaggaatacaagaacttctaaatgaaccaaatattcaagacccagctcaagcagaggcctacacaatttactgccaaaacagagtggaatatgagaaaagggtccgagcacaagcgaagaagtttgccccctcataa；

2)、提供slp-76羧基端改造质粒(通过解除slp-76本身分子内作用，降低对类泛素化的水平的影响)；

3)、将步骤2)所得的改造质粒与sumo1表达质粒在hek293t细胞内共表达；得到slp-76类泛素化修饰蛋白(可被检测到的slp-76类泛素化修饰蛋白)。

即，通过提高slp-76类泛素化修饰的丰度，实现t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的鉴定和检测。

作为本发明的t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法的改进：

所述步骤1)中，在slp-76序列的3‘端续接ubc9的编码序列(优选)，从而构建slp-76-ubc9融合表达质粒。

作为本发明的t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法的进一步改进：

所述步骤2)中，slp-76羧基端改造质粒为slp-76上438-516位氨基酸剔除的ubc9融合蛋白表达质粒。

注：被剔除的438-516位氨基酸，为步骤1)编码slp-76-ubc9融合蛋白的序列中的下划线所述的序列。

作为本发明的t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法的进一步改进：

slp-76438-516位氨基酸截短体的构建方法为：以步骤1)所得slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒为模版，设计438-516位氨基酸剔除的特异引物，使用quikchange^tm定点突变试剂盒(agilent,#200524)；

特异引物为：

delete538-516正向引物5’-3’:gctgctcttagaaaccgaggttccagataccagtgca

delete538-516反向引物5’-3’:cctcggtttctaagagcagcttctgcctctggtcg。

注：参照试剂盒说明书操作，突变后质粒序列以桑格测序法验证。

本发明还同时提供了一种t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

一、准备蛋白裂解缓冲液：

配制1％triton-x-100裂解缓冲液：20mmtris-hclph8.0，50mmnacl，1％triton-x-100，1％proteaseinhibitor,20mm碘乙酰胺；

取待测细胞(hek293t或jurkatt)6x10⁶cells，加入1±0.1ml的1％triton-x-100裂解缓冲液；于冰上放置30±5分钟，离心(20000xg15分钟)，收集上清蛋白液；

二、用蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转膜，孵育(依次孵育)sumo1特异性地抗体和标签蛋白/slp-76蛋白抗体；匹配蛋白条带位置，判定(观察)slp-76是否发生了类泛素化修饰。

作为本发明的t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的检测方法的改进，所述步骤二中：

slp-76蛋白条带上方(大于75kd)出现上移条带，且该条带可同时被sumo1抗体和标签蛋白/slp-76蛋白抗体识别；判定成slp-76发生类泛素化修饰；

反之，当slp-76条带上方并无slp-76蛋白条带；或sumo1条带不与slp-76条带重合，则判定成slp-76没有发生类泛素化修饰。

注：质粒在细胞内表达后产生蛋白，除slp-76蛋白本身外还会表达质粒骨架上的标签蛋白，因此用标签蛋白抗体和slp-76蛋白抗体均能检测到slp-76蛋白；类似的当表达flag-sumo1质粒，用flag标签蛋白抗体可识别sumo1蛋白。

作为本发明的t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的检测方法的进一步改进：

当以sumo1特异性抗体孵育后，在高分子量区域(100kd以上)观察到sumo1蛋白条带，并且同一张膜擦除后孵育slp-76蛋白抗体，在slp-76条带上方(一般为100kd-180kd)，出现slp-76蛋白条带，且该条带与sumo1蛋白条带重合的条件时，判定成slp-76已发生了类泛素化修饰；

反之，当slp-76条带上方(100kd-180kd)并无slp-76蛋白条带；或100kd-180kd之间sumo1条带不与slp-76条带重合，则判定成slp-76没有发生类泛素化修饰。

作为本发明的t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的检测方法的进一步改进：

当以flag抗体(flag为sumo1质粒上标签蛋白，指示sumo1蛋白)孵育后，在高分子量区域(100kd以上)观察到sumo1蛋白条带，并且同一张膜擦除后孵育ubc9蛋白抗体(ubc9为slp-76-ubc9融合质粒共有蛋白，可作为标签蛋白指示slp-76融合蛋白)，在slp-76条带上方(一般为100kd-180kd)，出现slp-76蛋白条带，且该条带与sumo1蛋白条带重合的条件时，判定成slp-76已发生了类泛素化修饰；

反之，当slp-76条带上方(100kd-180kd)并无slp-76蛋白条带；或100kd-180kd之间sumo1条带不与slp-76条带重合，则判定成slp-76没有发生类泛素化修饰。

即，标签蛋白为flag和ubc9，分别指示的是sumo1蛋白和slp-76-ubc9融合蛋白。

本发明解决了现有技术存在的如下2个问题：一、类泛素化修饰的蛋白丰度一般偏低，传统方法无法检测到slp-76类泛素化修饰，因此急需提高slp-76类泛素化修饰的丰度，以达到使用常规生物化学方法即可检测的目的；二、slp-76本身分子内作用牵制影响类泛素化的水平。即，本发明提供了体外高效鉴定t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法；该方法确保slp-76类泛素化修饰鉴定的特异性、高效性和正确性，且简单快捷，成本低廉，可重复性好。

本发明的具体步骤如下：

(1)构建蛋白表达质粒；其中，所述蛋白表达质粒包括slp-76表达质粒、slp-76功能域截短体、slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒、几个类泛素化修饰反应中关键的酶和分子的表达质粒。这些质粒插入所述蛋白的编码序列，并且在氨基端或羧基端带有编码标签蛋白的序列。ubc9是目前已知的类泛素化修饰反应中唯一的e2连接酶，它通过共价作用将sumo蛋白连接到目的蛋白的赖氨酸残基上。将ubc9蛋白与目的蛋白融合表达将显著地提高类泛素化修饰的蛋白丰度。本发明提供了一种slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒，插入序列为slp-76的编码序列，以及在slp-76序列的3‘端续接ubc9的编码序列。

优选地，所述目的蛋白表达质粒为slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒。

(2)提供slp-76羧基端改造质粒，通过解除slp-76本身分子内作用，降低对类泛素化的水平的影响。

优选地，所述slp-76羧基端改造质粒为slp-76上438-516位氨基酸剔除的ubc9融合蛋白表达质粒。

(3)将slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒及改造质粒与sumo1表达质粒在细胞内共表达；

(4)准备蛋白裂解缓冲液，该缓冲液在常见的去污剂基础上加入适量的水解酶senp抑制剂碘乙酰胺，使可逆的类泛素化修饰反应停滞在水解之前，可保存和积聚类泛素化修饰的蛋白，防止其被水解。收集蛋白裂解液，以抗slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒上的标签蛋白的抗体联用蛋白琼脂糖g小珠富集slp-76-ubc9融合蛋白，收集蛋白洗脱液；

优选地，所述senp抑制剂碘乙酰胺终浓度为20mmol/l。

用蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转膜，依次孵育sumo1特异性地抗体和标签蛋白抗体。匹配蛋白条带位置，观察slp-76是否发生了类泛素化修饰。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的蛋白质slp-76类泛素化修饰的鉴定方法，通过将slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒与sumo1表达质粒在hek293t细胞内共表达，在蛋白裂解液中加入水解酶senp抑制剂，提高类泛素化修饰蛋白的丰度。

(2)构建截短体表达载体，删除slp-76蛋白上羧基端438至516位氨基酸，结合(1)中所提改进，显著提高可检测到的slp-76类泛素化修饰水平，实现slp-76类泛素化修饰。

即，针对现有存在的技术问题，本发明通过改造slp-76羧基端的区域，利用简便的蛋白免疫沉淀-印迹法，优化蛋白裂解条件，使slp-76的sumo化修饰水平显著提高，首次实现体外高效鉴定t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化修饰。

综上，本发明提供的slp-76类泛素化修饰的鉴定方法操作简单，借助简便的传统蛋白免疫沉淀-免疫印迹法，改良蛋白表达方式和裂解方法，改造slp-76蛋白结构，现对于现有技术，本发明快速在体外鉴定slp-76类泛素化修饰，成本低、结果可靠、可重复性好。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为传统蛋白裂解缓冲液成分对jurkatt细胞系中对鉴定slp-76类泛素化修饰的影响。

图2为改良蛋白裂解缓冲液成分对jurkatt细胞系中对鉴定slp-76类泛素化修饰的影响。

图2中，左图为以sumo1抗体孵育的结果图，右图为slp-76抗体孵育的结果图。

图3为使用改良蛋白裂解缓冲液检测anti-cd3刺激对jurkatt细胞系slp-76类泛素化修饰的影响。

图4为采用slp-76-ubc9融合蛋白表达体系鉴定slp-76可被类泛素化修饰。

上图为ubc9抗体孵育结果，下图为flag抗体孵育结果。

图5为slp-76类泛素化修饰蛋白分离后考马斯亮蓝染色图。

图6为高分子量的slp-76类泛素化修饰蛋白的蛋白质谱学分析结果图(赖氨酸修饰位点1)。

图7为高分子量的slp-76类泛素化修饰蛋白的蛋白质谱学分析结果图(赖氨酸修饰位点2)。

图8为hek293t细胞共表达ha-slp-76质粒和flag-sumo1、ubc9质粒对鉴定slp-76类泛素化修饰的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，例如具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook,j.,russell,davidw.,molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition,2001,ny,coldspringharbor)。所用引物由上海生工有限公司合成。表达载体pcdna3.1购自invitrogen公司，质粒psra-ubc9、psra-sumo1和psra-slp-76，以及jurkatt细胞、hek293t细胞在发表于《molecularcell》的“theimmuneadaptorslp-76bindstosumo-rangap1atnuclearporecomplexfilamentstoregulatenuclearimportoftranscriptionfactorsintcells”一文中有明确提及，且名称一致。

实施例1、在改良的蛋白裂解条件下，slp-76类泛素化修饰在jurkatt细胞中的鉴定；包括以下步骤：

1)、t细胞系jurkat悬浮在2％fcs-rpmi1640培养液中(细胞浓度为6x10⁶/ml)，先加抗cd3单克隆抗体(okt3，用于人源性t细胞激活)或同型igg作阴性对照(抗cd3单克隆抗体或同型igg的终浓度均为2μg/ml)在4℃孵育30分钟，然后加1μg/ml的二抗(抗t细胞抗体)在37℃条件下交联作用60分钟以激活t细胞。然后用pbs(pbs缓冲液)洗二次以去除未结合的抗体(可采用蛋白免疫印迹的方式进行检测，从而确定抗体已被去除)，细胞沉淀后备用。

所述2％fcs-rpmi1640即含2％胎牛血清的rpmi-1640培养基。

注：阴性对照为经igg阴性对照刺激的细胞，即非激活t细胞。

2)、配制1％triton-x-100裂解缓冲液：

1％triton-x-100裂解缓冲液的成分为：20mmtris-hclph8.0，50mmnacl，1％triton-x-100(v/v)，1％proteaseinhibitor(v/v),20mm碘乙酰胺。

即，该1％triton-x-100裂解缓冲液的配制方法为：在1l20mmtris-hclph8.0中，加入50mmolnacl、10mltriton-x-100、10mlproteaseinhibitorcocktail(edta-free,100x,罗氏，货号0469313200120)、20mmol碘乙酰胺。

取步骤1所得的细胞6x10⁶cells，加入1ml的上述1％triton-x-100裂解缓冲液；于冰上放置30分钟，20000xg离心15分钟，收集上清蛋白液。

3)、以单克隆抗体anti-slp-76免疫沉淀全蛋白:

在步骤2)所得的上清蛋白液中加入2uganti-slp-76单克隆抗体或者2ug同源对照igg(即兔源igg)，4℃缓慢摇晃孵育2小时，然后再加入25ul蛋白a琼脂糖珠，4℃孵育45分钟使抗体(单克隆抗体anti-slp-76)与蛋白a琼脂糖珠偶连。在4℃以6,000rpm速度离心30秒，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用裂解缓冲液(1％triton-x-100裂解缓冲液)洗3次(每次的用量为1ml)；最后加入15μl的3×sds上样缓冲液，沸水煮5分钟；作为蛋白样品；

注：类泛素化修饰因为在细胞内丰度极低，因此需要用免疫沉淀的方法富集本底蛋白slp-76，再检测该蛋白上的类泛素化修饰。

取20μg蛋白样品，4-12％梯度胶sds-page电泳。然后50ma转移1h至硝酸纤丝素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1h；一抗slp-76抗体或抗sumo1抗体4℃过夜反复洗膜后，将膜与远红外荧光基团标记的抗igg二抗孵育(孵育条件为室温轻摇45分钟)，采用pbst缓冲液洗膜后，于oddyssey远红外成像仪(该远红外成像仪的设定参数为默认初始参数)中成像。

封闭液为：5g牛血清白蛋白溶于100mlpbst缓冲液中；pbst缓冲液为1mltween-20溶于1l1xpbs。

如图2所示，

孔道1-3分别为以兔源igg为免疫沉淀对照抗体样本，同型igg作阴性对照刺激jurkatt细胞的样本，抗cd3单克隆抗体刺激jurkatt细胞的样本，孵育sumo1抗体的结果；

即，具体为：

孔道1为：步骤1)中使用同型igg，步骤3)中使用兔源igg做免疫沉淀，一抗为抗sumo1抗体；

孔道2为：步骤1)中使用同型igg，步骤3)中使用anti-slp-76单克隆抗体，一抗为抗sumo1抗体；

孔道3为：步骤1)中使用抗cd3单克隆抗体、步骤3)中使用anti-slp-76单克隆抗体、一抗为抗sumo1抗体；

孔道4-6分别为以兔源igg为免疫沉淀对照抗体样本，同型igg作阴性对照刺激jurkatt细胞的样本，抗cd3单克隆抗体刺激jurkatt细胞的样本，孵育slp-76抗体的结果。

在该实施例1中，

孔道3高分子量区域(一般为100kd以上)观察到sumo1蛋白条带---为两条上移带(约110kd左右)，孔道6除了出现slp-76蛋白条带(约75kd)，还在slp-76条带上方出现与sumo1蛋白条带相重合的2个条带，因此，判定成slp-76已发生了类泛素化修饰。

即，slp-76蛋白分子量约75kd，在75kd上方，以一抗slp-76抗体孵育，在110kd左右的位置出现两条上移带，并且这两条带可以同时被抗slp-76抗体或抗sumo1抗体识别，表明该条件下slp-76能被类泛素化修饰。

而，孔道1、孔道4均没有出现任何条带，因此说明：以兔源igg为免疫沉淀对照抗体样本并不能产生类似的条带；

孔道2-3除100kd上方出现两条sumo1蛋白条带外，在130kd下方(约125kd)有一条弱的sumo1条带，而孔道5-6除了出现slp-76蛋白条带(约75kd)，还在slp-76条带上方(100kd左右)出现2个条带，130kd下方(约125kd)并未有条带与sumo1蛋白条带重合，因此说明：100kd左右条带为slp-76特异的类泛素化修饰条带，而130kd下方(约125kd)位置的并非为slp-76的类泛素化修饰条带。

对照1、选用传统的免疫沉淀-免疫印迹法(不加碘乙酰胺)，即，相对于上述实施例1而言，改变了蛋白裂解液成分，不加碘乙酰胺(取消1％triton-x-100裂解缓冲液中“20mm碘乙酰胺”的使用，其余同实施例1的蛋白裂解缓冲液的制备)，所得结果为：

如图1所示，孔道1-3分别为以兔源igg为免疫沉淀对照抗体样本，同型igg作阴性对照刺激jurkatt细胞的样本，抗cd3单克隆抗体刺激jurkatt细胞的样本，孵育slp-76抗体的结果；孔道4-6分别为以兔源igg为免疫沉淀对照抗体样本，同型igg作阴性对照刺激jurkatt细胞的样本，抗cd3单克隆抗体刺激jurkatt细胞的样本，孵育sumo1抗体的结果。

在孔道3中，在75kd上方，抗体孵育，并未见上移带出现在slp-76上方，表明传统方法的条件无法使slp-76的类泛素化修饰被检出。

实施例2、在改良的蛋白裂解条件下，在jurkatt细胞中slp-76类泛素化修饰水平随抗cd3单克隆抗体刺激时间增长而升高：

相对于实施例1而言，作如下更改：

将步骤1)中的“然后加1μg/ml的二抗(抗t细胞抗体)在37℃条件下交联作用60分钟以激活t细胞”改成为以下内容：然后加1μg/ml的二抗(抗t细胞抗体)在37℃条件下交联作用，时间分别为2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟不等，以激活t细胞。

在步骤3)中取消“2ug同源对照igg(即兔源igg)”，即，在步骤2)所得的上清蛋白液中加入2uganti-slp-76单克隆抗体；

其余等同于实施例1。

所得结果如图3显示，孔道1-6分别为同型igg作阴性对照刺激jurkatt细胞的样本、抗cd3单克隆抗体刺激jurkatt细胞2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟的样本。

在图3中，

孔道1为同型igg作阴性对照刺激jurkatt细胞的样本，即未刺激的t细胞，同实施例1中的孔道2和5。在75kd上方，以一抗slp-76抗体孵育，在110kd左右的位置出现两条上移带，并且这两条带可以同时被抗slp-76抗体或抗sumo1抗体识别。因此说明：同实施例1，在未刺激的jurkatt细胞内slp-76能被类泛素化修饰；

孔道2～6均为抗cd3单克隆抗体刺激jurkatt细胞，且slp-76被类泛素化修饰均能检测出，但是孔道6(为刺激60分钟的jurkatt细胞)，slp-76被类泛素化修饰条带强度显著升高；因此说明：即，37℃条件下交联作用60分钟为优选方案。

根据该实施例2，可得知：以一抗sumo1抗体孵育，在110kd左右的位置出现两条上移带，该上移带的强度随刺激时间延长而升高，表明该条件下slp-76的类泛素化修饰可被重复，且修饰受抗cd3单克隆抗体刺激的时间延长而水平上调，体现类泛素化修饰的动态变化。即，修饰水平随刺激时间延长而增高。

注：tubulin仅作为显示各孔道蛋白上样量是一致的内参蛋白，tubulin条带强度相似，显示各孔道蛋白上样量一致，slp-76类泛素化水平变化并非由上样量不同引发。

实施例3、改良的slp-76-ubc9融合蛋白体系在体外鉴定其泛素化修饰；包括以下步骤：

1)、构建融合蛋白表达质粒：

根据《naturemethods》“ubc9fusion-directedsumoylation(ufds):amethodtoanalyzefunctionofproteinsumoylation”中的记载，将编码slp-76蛋白的序列(ncbi基因数据库，编号nm_005565.5)插入pcdna3-mcs-ubc9质粒的多克隆位点内，即优选地在slp-76序列的3‘端续接ubc9的编码序列，成功构建slp-76-ubc9融合表达质粒，产生的融合蛋白分子量在100kd左右。

编码slp-76蛋白的序列为：

atggcactgaggaatgtgccctttcgctcagaggtcctgggctgggaccccgacagccttgctgactatttcaagaagctcaactataaggactgtgagaaggcagtgaagaagtaccacatcgatggggctcgcttcttgaacctgacagaaaatgacatccagaagttccccaagctccgggtgccgattctcagtaagttaagtcaggaaatcaacaagaacgaagagaggaggagcatcttcacacgcaaaccccaagtcccgcggtttcctgaagagacagaaagccacgaagaggacaatgggggctggtcgtcctttgaagaagacgattatgaaagtcccaatgatgaccaggatggggaggatgatggagactatgagtcccccaatgaggaggaagaggcacccgtggaagatgacgcggattatgagccgccaccctccaatgacgaggaagctctgcagaactccatcctgcctgccaagcctttccccaactccaactccatgtacatcgaccggcccccctctgggaaaaccccccagcagcctcctgtgcccccccagagaccgatggccgccctcccgcccccaccagccggccggaatcactcgccactgcccccaccccagaccaaccacgaagaacccagcagaagcagaaaccacaaaacggcaaagctccctgctccttcaatagacagaagcacgaaacctcccctagatcgttcattagctccgtttgatagagaacccttcacactaggaaagaaaccaccattttctgacaagccctcgattccagcgggaaggtcactcggggagcatttacccaagattcaaaagcctcctttaccaccgaccacggaaagacatgaaaggagcagccccctgccagggaagaagccacctgtgccaaagcatggatggggaccagacagaagagagaatgatgaagatgatgtgcatcagagacctttgccccagccagcactacttcctatgagctccaacactttcccttcaagatctactaagccaagtcccatgaaccctctcccatcctctcacatgcctggagcattctcagaaagtaacagcagttttccacagagtgcctccctgccaccatacttctctcaaggccctagcaacagaccacctatcagagccgaaggcagaaacttccccttgccacttccaaacaaacctcggcccccatcccccgcggaggaagagaattcattaaatgaagagtggtacgtttcttatattacccgaccagaggcagaagctgctcttagaaagataaaccaggatggcacatttctggtcagagacagctctaaaaaaacaacaaccaatccatatgtcctcatggtgttgtacaaagataaagtttacaacatccagatccgttatcagaaggaaagtcaagtttacttgttgggaactggactccgagggaaagaggactttctgtctgtgtcagatattattgactacttcaggaaaatgccacttctgctcattgatgggaaaaaccgaggttccagataccagtgcacattaacgcatgctgcagggtacccacgaggaggatcggggatcgccctcagccgccttgcgcaggaaaggaaagcctggaggaaggaccacccttttggctttgtagctgtcccaacaaagaaccctgatggcacaatgaacctgatgaactgggagtgcgctatccctggaaagaaggggactccatgggaaggaggcttgttcaagctacggatgcttttcaaagatgactatccgtcctcaccaccaaaatgtaaatttgagcccccactgtttcatccaaacgtgtatccttctggcacagtgtgcctgtccatcctggaggaagacaaggactggaggccagctatcaccatcaaacagatcttattaggaatacaagaacttctaaatgaaccaaatattcaagacccagctcaagcagaggcctacacaatttactgccaaaacagagtggaatatgagaaaagggtccgagcacaagcgaagaagtttgccccctcataa。

2)、构建slp-76分子域截短体融合蛋白表达质粒：

对步骤1)所得的slp-76-ubc9融合表达质粒，截短删除438位氨基酸至516位氨基酸。

具体为：以步骤1)所得slp-76-ubc9融合蛋白表达质粒为模版，设计438-516位氨基酸剔除的特异引物(如下所述)，使用quikchange^tm定点突变试剂盒(agilent,#200524)，参照试剂盒说明书操作。突变后质粒序列以桑格测序法验证。

引物序列为：

delete538-516正向引物5’-3’:gctgctcttagaaaccgaggttccagataccagtgca

delete538-516反向引物5’-3’:cctcggtttctaagagcagcttctgcctctggtcg

注：被剔除的438-516位氨基酸，对应步骤1)中的带下划线的序列。

所得物为slp-76438-516位氨基酸剔除的ubc9融合质粒；从而实现slp-76蛋白的438位氨基酸至516位氨基酸被删除。

3)、在hek293t细胞内共转染融合质粒(步骤2)所得的slp-76438-516位氨基酸剔除的ubc9融合质粒)与flag-sumo1质粒(pcmv-flag-sumo1)，24小时后收取细胞，用pbs清洗2次；细胞沉淀后备用。

共转染方式为脂质体转染，参照脂质体转染试剂(lipofectamine2000,thermofisher,#11668019)说明书操作，4ugslp-76438-516位氨基酸剔除的ubc9融合质粒,4ugflag-sumo1质粒(pcmv-flag-sumo1)与20ul转染试剂混合制成dna-脂质体复合物，转染1个直径6cm培养皿的hek293t细胞。

4)、配制1％triton-x-100裂解缓冲液(同实施例1)。成分为：20mmtris-hclph8.0，50mmnacl，1％triton-x-100，1％proteaseinhibitor,20mm碘乙酰胺。

取步骤3)所得的细胞6x10⁶cells，加入1ml的上述1％triton-x-100裂解缓冲液；于冰上放置30分钟，20000xg离心15分钟，收集上清蛋白液。

5)、以单克隆抗体anti-ha免疫沉淀全蛋白：

在步骤4)所得的上清蛋白液中加入2uganti-ha(ha小鼠源单克隆抗体)，4℃缓慢摇晃孵育2小时；然后再加入25ul蛋白a琼脂糖珠，4℃孵育45分钟使抗体与蛋白a琼脂糖珠偶连。在4℃以6,000rpm速度离心30秒，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用裂解缓冲液洗3次(每次的用量为1ml)；最后加入15μl的3×sds上样缓冲液，沸水煮5分钟。作为蛋白样品。

取20μg蛋白样品，4-12％梯度胶sds-page电泳。然后50ma转移1h至硝酸纤丝素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1h；一抗ubc9抗体或抗flag抗体4℃过夜反复洗膜后，将膜与远红外荧光基团标记的抗igg二抗孵育(孵育条件为室温轻摇45分钟)，采用pbst缓冲液洗膜后，于oddyssey远红外成像仪(该远红外成像仪的设定参数为默认初始参数)中成像。

孔道1为：省去步骤2)，步骤3)中使用步骤1)所得质粒，不与flag-sumo1质粒(pcmv-flag-sumo1)共表达；

孔道2为：省去步骤2)，步骤3)中使用步骤1)所得质粒与flag-sumo1质粒(pcmv-flag-sumo1)共表达；

孔道7为：步骤3)中使用步骤2)所得slp-76438-516位氨基酸剔除的ubc9融合质粒与flag-sumo1质粒(pcmv-flag-sumo1)共表达；

所得结果如图4所述。

在图4中，

孔道1在ubc9抗体孵育后100kd以上的位置并未出现高分子条带，且flag抗体孵育后无条带；

孔道2在ubc9抗体孵育后在130kd以上出现了多条高分子条带，且与flag条带重合，判定成slp-76已发生了类泛素化修饰；

孔道7在ubc9抗体孵育后在130kd以上出现了多条高分子条带，且与flag条带重合，判定成slp-76已发生了类泛素化修饰。并且相较孔道2，条带数量多且强度高，因此说明：共表达slp-76融合蛋白与sumo1蛋白能显著提高slp-76类泛素化修饰水平，并且slp-76438-516位氨基酸剔除能进一步提高slp-76类泛素化修饰水平。

即，如图4孔道1-2显示，slp-76融合-ubc9蛋白分子量约100kd,在100kd上方，以一抗ubc9抗体孵育(上图)，在130kd左右的位置出现多条上移带可同时被抗flag抗体识别(下图)，表明融合蛋白slp-76-ubc9的类泛素化修饰可在hek293t内被重复。

如图4孔道7中所示，当slp-76蛋白的438位氨基酸至516位氨基酸被删除后，其类泛素化修饰条带的数量和强度均极大地提高(孔道7100kd-180kd之间的蛋白条带)。

对照2、

将实施例3中的步骤2)中的slp-76-ubc9融合表达质粒中的“截短删除438位氨基酸至516位氨基酸”分别改成“截短删除25位氨基酸至56位氨基酸”、“截短删除56位氨基酸至86位氨基酸”、“截短删除226位氨基酸至267位氨基酸”、“截短删除279位氨基酸至309位氨基酸”，从而相应的获得如图4所述的孔道3-6；即，孔道3-6所对应的构建的截短slp-76其他结构域的ubc9融合蛋白组。但是，这些结构域的删除并不能增强类泛素化修饰条带(100kd-180kd之间的蛋白条带)的数目和强度。

上述结果表明只有本发明所述的优选的slp-76羧基端改造质粒(即438位氨基酸至516位氨基酸删除的ubc9融合质粒)能进一步提高融合蛋白slp-76-ubc9的类泛素化修饰水平。

实施例4、蛋白质谱法验证改良的slp-76-ubc9融合蛋白体系在体外鉴定的可靠性；包括以下步骤：

载体构建、蛋白表达和提取同实施例3的步骤1)～步骤4)。

5)、以单克隆抗体anti-ha免疫沉淀全蛋白：

在步骤4)所得的上清蛋白液中加入2uganti-ha，4℃缓慢摇晃孵育2小时；然后再加入25ul蛋白a琼脂糖珠，4℃孵育45分钟使抗体与蛋白a琼脂糖珠偶连。在4℃以6,000rpm速度离心30秒，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用裂解缓冲液洗3次(每次的用量为1ml)；最后加入15μl的3×sds上样缓冲液，沸水煮5分钟。作为蛋白样品。

取20μg蛋白样品，4-12％梯度胶sds-page电泳。然后以考马斯亮蓝染色蛋白胶。如图5所示，孔道1为空白质粒对照(即，以pcmv骨架质粒替代步骤3中的flag-sumo1质粒(pcmv-flag-sumo1)而得)，孔道2和3均为改良的slp-76-ubc9融合蛋白质粒与flag-sumo1共表达的样本。切出方框所示位置和大小的胶块，胰蛋白酶消化，进行常规蛋白质谱分析。匹配氨基酸序列和原始谱图，分析荷质比，可鉴定出优选的slp-76羧基端改造融合蛋白在两个位点上(蛋白肽段图谱分别如图6和图7所示)存在类泛素化修饰，提示本发明用简便及成本低的方法得出的结果可被蛋白质谱法重复，结果可靠。

本发明提供的体外快速鉴定slp-76类泛素化修饰的方法，通过提高类泛素化修饰的slp-76蛋白丰度，简单有效地、可重复地且可靠地得到鉴定结果。

对照3、将实施例3中的slp-76438-516位氨基酸剔除的ubc9融合质粒改成如同常规技术所述的全长slp-76单独表达质粒，且ubc9蛋白单独表达；其余等同，所得结果为图8。如图8所示，孔道1-5为在hek293t细胞内共表达图示质粒，孵育ha抗体的结果；孔道6-10为在hek293t细胞内共表达图示质粒，孵育sumo1抗体的结果。slp-76单独表达时分子量为75kd左右，在孵育ha抗体以及sumo1抗体的结果后，并未发现在75kd以上有上移条带，这说明单独表达slp-76和ubc9并未提高类泛素化修饰水平，此条件下slp-76的类泛素化修饰未被检出。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>西交利物浦大学

<120>t细胞特异接头蛋白slp-76类泛素化的方法及相应的体外高效鉴定

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2082

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggcactgaggaatgtgccctttcgctcagaggtcctgggctgggaccccgacagcctt60

gctgactatttcaagaagctcaactataaggactgtgagaaggcagtgaagaagtaccac120

atcgatggggctcgcttcttgaacctgacagaaaatgacatccagaagttccccaagctc180

cgggtgccgattctcagtaagttaagtcaggaaatcaacaagaacgaagagaggaggagc240

atcttcacacgcaaaccccaagtcccgcggtttcctgaagagacagaaagccacgaagag300

gacaatgggggctggtcgtcctttgaagaagacgattatgaaagtcccaatgatgaccag360

gatggggaggatgatggagactatgagtcccccaatgaggaggaagaggcacccgtggaa420

gatgacgcggattatgagccgccaccctccaatgacgaggaagctctgcagaactccatc480

ctgcctgccaagcctttccccaactccaactccatgtacatcgaccggcccccctctggg540

aaaaccccccagcagcctcctgtgcccccccagagaccgatggccgccctcccgccccca600

ccagccggccggaatcactcgccactgcccccaccccagaccaaccacgaagaacccagc660

agaagcagaaaccacaaaacggcaaagctccctgctccttcaatagacagaagcacgaaa720

cctcccctagatcgttcattagctccgtttgatagagaacccttcacactaggaaagaaa780

ccaccattttctgacaagccctcgattccagcgggaaggtcactcggggagcatttaccc840

aagattcaaaagcctcctttaccaccgaccacggaaagacatgaaaggagcagccccctg900

ccagggaagaagccacctgtgccaaagcatggatggggaccagacagaagagagaatgat960

gaagatgatgtgcatcagagacctttgccccagccagcactacttcctatgagctccaac1020

actttcccttcaagatctactaagccaagtcccatgaaccctctcccatcctctcacatg1080

cctggagcattctcagaaagtaacagcagttttccacagagtgcctccctgccaccatac1140

ttctctcaaggccctagcaacagaccacctatcagagccgaaggcagaaacttccccttg1200

ccacttccaaacaaacctcggcccccatcccccgcggaggaagagaattcattaaatgaa1260

gagtggtacgtttcttatattacccgaccagaggcagaagctgctcttagaaagataaac1320

caggatggcacatttctggtcagagacagctctaaaaaaacaacaaccaatccatatgtc1380

ctcatggtgttgtacaaagataaagtttacaacatccagatccgttatcagaaggaaagt1440

caagtttacttgttgggaactggactccgagggaaagaggactttctgtctgtgtcagat1500

attattgactacttcaggaaaatgccacttctgctcattgatgggaaaaaccgaggttcc1560

agataccagtgcacattaacgcatgctgcagggtacccacgaggaggatcggggatcgcc1620

ctcagccgccttgcgcaggaaaggaaagcctggaggaaggaccacccttttggctttgta1680

gctgtcccaacaaagaaccctgatggcacaatgaacctgatgaactgggagtgcgctatc1740

cctggaaagaaggggactccatgggaaggaggcttgttcaagctacggatgcttttcaaa1800

gatgactatccgtcctcaccaccaaaatgtaaatttgagcccccactgtttcatccaaac1860

gtgtatccttctggcacagtgtgcctgtccatcctggaggaagacaaggactggaggcca1920

gctatcaccatcaaacagatcttattaggaatacaagaacttctaaatgaaccaaatatt1980

caagacccagctcaagcagaggcctacacaatttactgccaaaacagagtggaatatgag2040

aaaagggtccgagcacaagcgaagaagtttgccccctcataa2082