一株诱变尖角突脐孢菌及其在防治稗草中的应用的制作方法

本发明属于微生物领域，特别涉及一株诱变尖角突脐孢菌及其在防治稗草中的应用。
背景技术：
：稗草(echinochloacrusgalli(l.)beauv.)为稗属一种禾本科植物。原产于欧洲和印度，主要分布在北纬50°到南纬40°之间，基本为田间杂草，现为世界十大恶性杂草之一。稗草分布于广泛，其中对水稻的危害最为严重，危害面积高达2.1亿亩，在秧田、直播田和移栽田稗草均能为害，成为水稻田最主要的杂草之一。除此之外，稗草还危害其他作物，对大豆的危害面积达到了2000万亩；其中在玉米田、小麦田、绿豆田、果园以及蔬菜田都已发现稗草的为害。稻田稗草主要与水稻争夺养分、水分、光照及生长空间，抑制水稻的正常生长，是危害水稻生产的重要有害生物。由于水田稗草为害比较严重，所以在生产中化学防治仍然是防治稗草的重要措施，如丙草胺、苄嘧磺隆和二氯喹啉酸等，这些药剂除稗快，但是会对环境造成二次污染，存在化学物质残留和超标，危害公众健康，同时多次使用的化学农药会让稗草产生相应的抗性，这是现如今农业生产上不可避免的问题。然而微生物除稗剂绿色环保对人体无害并对水稻安全性极高，稗草不易产生抗药性。因此，目前开发微生物除稗剂已经引起了各杂草学家们的广泛关注。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株诱变尖角突脐孢菌。本发明的另一目的在于提供所述诱变尖角突脐孢菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一株诱变尖角突脐孢菌，分类命名为exserohilummonoceras(尖角突脐孢菌)x27-uv148，保藏编号为gdmccno:60513，于2018年12月7日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)。一种上述诱变尖角突脐孢菌的孢子。所述的诱变尖角突脐孢菌的孢子的制备方法，包括如下步骤：将诱变尖角突脐孢菌接种到pda培养基上，于28℃～30℃下进行培养，然后过滤去除菌丝，得到诱变尖角突脐孢菌的孢子。所述的培养的温度优选为28℃。所述的培养的时间优选为14天。所述的过滤为用纱布进行过滤；优选为用四层纱布进行过滤。所述的诱变尖角突脐孢菌或所述的诱变尖角突脐孢菌的孢子在制备生物除草剂中的应用。所述的草为稗属杂草；优选为水稻田稗草。一种用于稗草生物防治的生物制剂，其活性成分为上述诱变尖角突脐孢菌和/或上述诱变尖角突脐孢菌的孢子。所述的生物制剂中诱变尖角突脐孢菌的孢子的浓度为105～107孢子/ml；优选为106孢子/ml。所述的生物制剂中还可以含有农药学上可以接受的载体；所述的载体包括乳化剂和水等。所述的乳化剂优选为吐温80。所述的乳化剂在所述生物制剂中的浓度为体积百分比0.05％。所述的诱变尖角突脐孢菌，诱变尖角突脐孢菌的孢子，和/或用于稗草生物防治的生物制剂在防治稗草中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)为了解决现有技术中化学防治存在的污染环境、不安全的问题，本发明提供一种尖角突脐孢菌菌株x27-uv148，该菌株是从水稻田稗草叶片上分离的x27菌株通过紫外诱变得到，对水稻等作物安全无害，且对稗草具有防治作用，在运用中具有安全性，适用于稻田稗草的生物防治。(2)使用方法简单实用：将尖角突脐孢菌x27-uv148制成水乳剂，工艺简单实用。(3)防治效果显著且稳定：尖角突脐孢菌x27-uv148菌株孢子悬液对处于二叶一心时期的稗草具有显著地防除效果，盆栽试验防效为99％以上。附图说明图1是本发明的尖角突脐孢菌菌株x27-uv148与出发菌株x27的孢子形态图；其中，图a为尖角突脐孢菌菌株x27-uv148；图b为尖角突脐孢菌菌株x27。图2是本发明的尖角突脐孢菌菌株x27-uv148与出发菌株x27的菌丝形态图；其中，图a为尖角突脐孢菌菌株x27-uv148；图b为尖角突脐孢菌菌株x27。图3是本发明的尖角突脐孢菌菌株x27-uv148与出发菌株x27的菌落形态图；其中，图a为尖角突脐孢菌菌株x27-uv148；图b为尖角突脐孢菌菌株x27。图4是本发明的尖角突脐孢菌菌株x27-uv148与出发菌株x27的对稗草防治效果图；其中，图a为尖角突脐孢菌菌株x27；图b为尖角突脐孢菌菌株x27-uv148；图c为对照。图5是本发明的尖角突脐孢菌菌株x27-uv148与出发菌株x27的对水稻安全性图；其中，图a为尖角突脐孢菌菌株x27；图b为尖角突脐孢菌菌株x27-uv148；图c为对照。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂、培养基等均可通过市售获得；其中：pda培养基配方为：马铃薯葡萄糖琼脂(pda)40.1g，5g琼脂，用1l水溶解。实施例1尖角突脐孢菌菌株的诱变筛选和鉴定一、尖角突脐孢菌的诱变筛选取尖角突脐孢菌x27(出发菌株，可参考文献获得：“li,q.y.,shen,x.f.,li,g.x.,liu,x.g.,andchen,y.(2012).purification,identificationandbioactivityofphytotoxiccompoundsfromthefungusexserohilummonoceras.allelopathyjournal.30:143-151”)的分生孢子配成1×104个孢子/ml的孢子悬浮液，200r/min震荡20min，分散孢子。取2～3ml孢子悬浮液于无菌培养皿中紫外照射(功率15w，距离为15cm)25分钟，然后分别取出100μl孢子悬浮液用涂布器接种于pda培养基平板上，重复3次，以未经紫外照射的孢子悬浮液作对照，28℃黑暗条件下培养至少3d(天)，选育出300个菌株，编号为x27-uv001、x27-uv002、x27-uv003……x27-uv298、x27-uv299、x27-uv300。将300个诱变株在pda上培养14天后，配制成1.0×106孢子/ml的孢子悬浮液，喷于两至三叶一心期的活体稗草(稗原变种e.crus-gallivar.crus-galli，e.crus-gallivar.formosensis，稻稗e.oryzicola，光头稗e.colona和硬稃稗e.glabrescens)上，用出发菌株作为对照，将处理过的活体稗草保湿培养48h后，再移入温室中生长，每个处理4次重复。7d后分级并调查发病情况，最后计算病情指数并记录，作为菌株活体致病力的测定结果。如表1所示(表中仅列出致病力显著高于出发菌株的数据)。稗草病害分级标准：0级：全株无病，叶片上无斑点；1级：仅有小的针尖大小的褐点；2级：全株叶片上有较大褐点，并有约1～2mm的典型或椭圆形坏死病斑均匀分布在叶片上，大约占叶面积2％；3级：全株有典型病斑，侵染面积小于10％；4级：全株有典型病斑，侵染面积约占10％～50％；5级：全株有典型病斑，侵染面积约占51％～75％；6级：全株有典型病斑，全部叶片死亡。式中，i表示病级，n表示植株发病为i级的株数，n表示调查总株数，6表示植株发病最高级。表1诱变菌株与出发菌株对活体稗草的致病性(室内测定)序号诱变株编号病情指数序号诱变株编号病情指数1x27-uv14879.86±2.37a9x27-uv15073.61±1.79abcdef2x27-uv04878.89±2.95a10x27-uv18472.22±1.13abcdefg3x27-uv04577.78±4.39ab11x27-uv24870.14±3.83abcdefgh4x27-uv28677.78±2.27ab12x27-uv11466.67±2.54bcdefghi5x27-uv24777.08±3.08abc13x27-uv29866.67±3.59bcdefghi6x27-uv21576.39±2.66abcd14x27-uv04165.97±4.59cdefghi7x27-uv27775.70±1.75abcde15ck65.97±3.08cdefghi8x27-uv28475.00±3.00abcdef注：表中数据均为平均值±标准误，不同小写字母代表有显著性差异p<0.05(下同)。如表1所示，室内活体稗草致病性结果表明，出发菌株经过诱变后对稗草的致病性明显增强。高致病力诱变菌株x27-uv148的致病力较x27(ck)极显著，对稗草的致病力最强。二、尖角突脐孢菌菌株鉴定1、尖角突脐孢菌菌株x27-uv148的形态特征(1)采用培养皿培养法，将菌株x27-uv148接种于pda培养基上，28℃培养，待组织长出菌落后，进行单孢分离，挑取单菌落在pda培养基上纯化，用于分类鉴定。挑取纯化好的菌株于有适量无菌水的载玻片上，在显微镜线观察菌株形态，以出发菌株x27作为对照，其孢子及菌丝形态如图1和图2所示，从图中可以看到，菌丝淡褐色，光滑，分隔，有分枝，分生孢子大小为(100～160)×(15～20)μm，隔膜大多为6～8个。(2)挑取纯化好的菌株于新的pda培养基上，28℃培养14天，观察菌丝落形态及菌落颜色。尖角突脐孢菌x27和x27-uv148菌落表面呈灰黑色绒毛状，初期菌丝为白色后变为淡褐色，7d左右开始产孢，随时间的推移菌落中央孢子逐渐增多直至向边缘扩散，菌落边缘依旧为灰黑色；菌落背面也是灰黑色，菌丝呈现放射状，不同的是x27的气生菌丝呈现放射状，较长，而x27-uv148的气生菌丝较短，密集于菌落周围(图3a、3b)。2、尖角突脐孢菌菌株x27-uv148的分子生物学鉴定(1)刮取pda培养基的菌丝，然后用真菌基因组dna提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取真菌dna，以dna为模板，用引物its1、its4(its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)进行its序列扩增，扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，pcr产物直接进行双向测序。其中，pcr扩增反应体系为20μl，含有ddh2o14.8ul、buffer2ul、dntp0.5ul、dmso0.5ul、primerf(引物its1)0.5ul、primerr(引物its4)0.5ul、dna模板1ul、transtarttaq0.2ul。扩增条件：95℃5min，95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min。(2)使用引物its1和its2进行its序列扩增，对单一条带pcr产物进行exosap-it纯化；对有非特异条带的pcr产物进行切胶纯化。经测序分析菌株扩增的its序列长为557bp。将菌株its序列进行blast分析后，结果显示，x27-uv148菌株与尖角突脐孢菌(exserohilummonoceras)相似度达到了98％，且通过图1和图2可以看出x27，x27-uv148菌株的分生孢子和菌丝形态相同，故鉴定该菌株为尖角突脐孢菌。其中，x27-uv148双向测序拼接序列(its序列)如下:ttattgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaaaatgtgagataaaaaaaaggcttaatggatgccgccctgggctgattgcaagcgcataattgtgctgcgctccaaaaccagtaggccggctgccaattgttttaaggcgagtcttcccaagacggagagacaacaagacgcccaacaccaagcaaagcttgagggtacaaatgacgctcgaacaggcatgccctttggaataccaaagggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacactacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttaataaattaaattattgtactgacgctgattgcaagaacaaaagcggtttatatgggggtcctggtggcgagcgaactcgcccaggaaacaaaaagtgcgcaaaagacatgggtgaaaataattcagcagagcactgttgccagcaccccacctgcatatctttgtgtaatgatccctcc。将尖角突脐孢菌命名为exserohilummonocerasx27-uv148，于2018年12月7日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，保藏编号为gdmccno:60513。实施例2尖角突脐孢菌菌株x27-uv148的除草效果1、x27-uv148菌株孢子悬液制备将x27-uv148菌株接种到9cm的含有pda培养基的培养皿中，在28℃下培养14天，用0.05％(v/v)的吐温80水溶液从培养皿中洗下，再过四层纱布滤除菌丝得到孢子悬液，配制孢子悬浮液的浓度为106孢子/ml(用血球计数板计数)。2、培养试验用稗草稗草采集于华南农业大学宁西试验基地，在28℃的恒温培养箱中培育到种子出苗，然后移栽至盆中，每盆移6株稗苗，4次重复，置于室外生长。3、试验方法用上述配置的孢子悬浮液喷施稗苗，同时以出发菌株和未喷任何菌液仅用含吐温的水(吐温水溶液的浓度为0.05％(v/v))处理的稗草为对照。等稗草长于二叶一心时期，进行茎叶喷雾(喷施量均为80ml/m2)，一次施药，喷完药的稗苗要保湿培养至少48h，之后移入温室进行自然生长，14天以后调查株防效，21天后调查株防效和鲜重防效(于药后14、21d调查每盆杂草株数，药后21d取样，称地上部鲜质量，计算株防效和鲜质量防效。根据调查数据，按式(1)计算各处理的株防效和鲜重防效(％)。根据调查数据，按式(1)计算各处理的株防效和鲜重防效(％)：式中：r为杂草生长抑制率，x0为对照的株数或鲜重，x1为处理的株数或鲜重。4、试验结果通过上述试验，测定了菌株x27和x27-uv148的除稗效果，试验结果见表2和图4，结果表明菌株x27-uv148的室内防效达到100％，显著高于出发菌株的防效。试验表明诱变菌株x27-uv148的防效比出发菌株防效要高。表2高致病力诱变菌株对稗草防除(室内)效果实施例3尖角突脐孢菌菌株x27-uv148的安全性1、x27-uv148菌株孢子悬液制备将x27-uv148菌株接种到9cm的含有pda培养基的培养皿中，在28℃下培养14天，用0.05％(v/v)的吐温80水溶液从培养皿中洗下，再过四层纱布滤除菌丝得到孢子悬液，配制孢子悬浮液的浓度为106孢子/ml。2、培养试验用水稻水稻品种为软华优6100(购于广东华农大种业有限公司)，在28℃的恒温培养箱中培育到种子出苗，然后移栽至盆中，每盆移4株水稻，4次重复，置于室外生长。3、试验方法用上述配置的孢子悬浮液喷施水稻，同时用出发菌株和用未喷任何菌液仅用含吐温的水(吐温水溶液的浓度为0.05％(v/v))处理的水稻为对照(喷施量均为80ml/m2)。将处理过的活体水稻保湿培养至少48h后，再移入温室中生长，每个处理4次重复。7d后分级并调查发病情况，按处理后植株叶片病害程度的不同将病害分级赋值。水稻不同病害程度分级参照陈勇(2001)的分级标准，具体水稻病害分级标准如下：0级：水稻无病害，用ns表示；1级：水稻叶片有病斑但不超过整片叶的1/2，用hs表示；2级：水稻全叶枯死，用s表示。4、试验结果：通过上述试验，测定了菌株x27和x27-uv148对于水稻的安全性，试验结果见表3和图5，结果表明菌株x27-uv148和菌株x27均不侵染水稻。试验表明诱变菌株x27-uv148和菌株x27运用于水田时，其寄主范围专一。表3高致病力诱变菌株对水稻的安全性(室内)测定序号诱变株编号感病程度1x27ns2x27-uv148ns实施例4尖角突脐孢菌菌株x27-uv148的遗传稳定性将筛选出的尖角突脐孢菌的突变菌株转接到斜面上，待突变菌生长3～4天后，将其再转接到新鲜pda培养基上培养，以此作为第1代；重复以上步骤直到第7代，测定每一代菌株的菌落生长直径以及对稗草的防除效果(表4和表5)。表4尖角突脐孢菌菌株x27-uv148遗传后代菌落直径注：菌落直径单位为：cm。如表4所示，尖角突脐孢菌菌株x27-uv148经过7代传代培养后，每一代的菌落生长的速度稍高于出发菌株，并且菌落每一代的直径长度稳定。尖角突脐孢菌菌株x27-uv148每一代的第7天的菌落直径均为15cm。表5尖角突脐孢菌菌株x27-uv148遗传后代遗传稳定性如表5所示，尖角突脐孢菌菌株x27-uv148经过7代传代培养后，对稗草都有较好的抑制效果(方法同实施例2)，其中14天株防效为83.33％～100.00％，21天的鲜重防效为95.83％～100.00％，21天的鲜重防效为97.25％～100.00％。表5结果表明，尖角突脐孢菌菌株x27-uv148对于稗草的防除效果比较稳定。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一株诱变尖角突脐孢菌及其在防治稗草中的应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物its1<400>1tccgtaggtgaacctgcgg19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物its4<400>2tcctccgcttattgatatgc20<210>3<211>557<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>尖角突脐孢菌菌株x27-uv148的its序列<400>3ttattgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaaaatgtgagat60aaaaaaaaggcttaatggatgccgccctgggctgattgcaagcgcataattgtgctgcgc120tccaaaaccagtaggccggctgccaattgttttaaggcgagtcttcccaagacggagaga180caacaagacgcccaacaccaagcaaagcttgagggtacaaatgacgctcgaacaggcatg240ccctttggaataccaaagggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattct300gcaattcacactacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagat360ccgttgttgaaagttttaataaattaaattattgtactgacgctgattgcaagaacaaaa420gcggtttatatgggggtcctggtggcgagcgaactcgcccaggaaacaaaaagtgcgcaa480aagacatgggtgaaaataattcagcagagcactgttgccagcaccccacctgcatatctt540tgtgtaatgatccctcc557当前第1页12