本发明涉及氨基酸生产技术领域，具体涉及一种发酵生产l-异亮氨酸的方法。
背景技术：
l-异亮氨酸(l-isoleucine)是人体八种必需氨基酸之一，与l-亮氨酸、l-缬氨酸同为支链氨基酸，1904年首次从甜菜糖浆中分离出来。l-异亮氨酸是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用。现已被广泛运于生物医药、食品工业、化妆品、电化学、组织工程、光化学等领域。
目前，l-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，由于提取法和化学合成法生产的l-异亮氨酸与它的异构体分离困难、原料来源受限制、生产成本高、污染环境，因此未能实现工业化生产。而微生物发酵法条件温和、环境友好、产品质量稳定，最具有发展前途，因此广泛应用于工业生产。现有的以微生物直接发酵法生产l-异亮氨酸生产菌主要包括黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、粘质赛氏杆菌(sarratiamarcescens)、乳糖发酵短杆菌(brevibacteriumlactofermentum)、钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)、大肠杆菌(escherichiacoli)等。
从发酵液中提取氨基酸的方法主要有：沉淀法、离子交换法、萃取法和膜分离法等。其中离子交换法最为常用，但当混合氨基酸之间的等电点相差较小时，不易分离，且耗盐量大、产生过量的再生废液、操作周期较长。膜分离法是根据分子体积大小、亲水性等原因所引起的选择性透过或带电分子与荷膜之间的电荷效应等实现混合溶液的分离。依据其孔径的不同(或称为截留分子量)可以分为：微滤膜(mf)、超滤膜(uf)、纳滤膜(nf)、反渗透膜(ro)等。对于分子量相近、物化性质相似的多肽或氨基酸很难用超滤膜进行分离，纳滤膜分离技术则对多肽和氨基酸的分级分离具有明显的优势。
在l-异亮氨酸微生物发酵生产过程中，菌种、发酵培养的培养基和培养条件等均会影响l-异亮氨酸的产量。中国专利公布cn108796003a公开了一种提高l-异亮氨酸产量的方法，该方法在发酵培养基中增加了脂肪酸和/或氯高铁血红素将以钝齿棒杆菌产l-异亮氨酸的产量从15g/l提高到了19.2g/l，l-异亮氨酸的产量仍旧较低。中国专利公告cn103409476b公开了一种l-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，该方法对乳糖发酵短杆菌进行了诱变育种和抗性筛选，经优化发酵培养基、壳聚糖预处理和超滤等分离纯化方法后获得l-异亮氨酸，其产酸率在32.7g/l以下，纯度不超过99.2％，该方法操作复杂，其纯度和产酸率仍有待提高。另外，在l-异亮氨酸的发酵过程中，需要流加氨水以调节ph和补充氮源，但由于发酵中后期的氨水仅起到调节ph的作用，未被及时利用，导致发酵液中铵氮含量偏高，对环境污染较大。
本发明为了解决现有技术中存在的问题，对l-异亮氨酸的发酵培养基、培养条件以及对发酵液中l-异亮氨酸提取工艺等的优化，提高了l-异亮氨酸产量、糖酸转化率以及纯度、减少了发酵液中的铵氮含量，在l-异亮氨酸提取过程中，避免了大量废水的产生、工艺简单易控制、成本较低、非常具有工业实用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种发酵生产l-异亮氨酸的方法。克服了现有技术中存在的问题，提高了l-异亮氨酸产量、糖酸转化率以及纯度、减少了发酵液中的铵氮含量。
本发明提供了一种发酵生产l-异亮氨酸的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)活化培养：将钝齿棒杆菌接种至平板培养基上进行活化培养，得到活化菌；
(2)种子培养：将步骤(1)得到的活化菌接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；
所述的种子培养基包括：葡萄糖、豆粕水解液、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾，ph＝6.8-7.0；
(3)发酵培养：按照6-12％的接种量将步骤(2)得到的种子液，接种至发酵培养基中培养，期间加入补料培养基2次，得到发酵液；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖、豆粕水解液、硫酸铵、天冬酰胺、硫酸镁、磷酸二氢钾，ph＝6.8-7.0；
所述的补料培养基包括：葡萄糖、豆粕水解液、天冬酰胺、硫酸镁、磷酸二氢钾，ph＝6.8-7.0；
(4)l-异亮氨酸的提取：将发酵结束后的发酵液离心，收集上清液，将上清液经过超滤、纳滤、反渗透过滤得到反渗透浓缩液，将反渗透浓缩液真空干燥、结晶，得到l-异亮氨酸。
具体地，上述步骤(1)的操作包括：将钝齿棒杆菌接种至平板培养基上，培养箱中30℃活化培养12h，得到活化菌；
所述的平板培养基包括：葡萄糖1g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、nacl2.5g/l、琼脂粉20g/l，ph＝6.8-7.0。
具体地，上述步骤(2)的操作包括：取一环生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200ml/500ml，种子培养的条件为30℃，200r/min摇床培养24h，得到种子液。
优选地，所述步骤(2)中的种子培养基包括：葡萄糖92g/l、豆粕水解液83g/l、硫酸铵18g/l、硫酸镁3.5g/l、磷酸二氢钾3.2g/l，ph＝6.8-7.0。
优选地，所述步骤(3)中的发酵培养基包括：葡萄糖2200-2600g/l、豆粕水解液560-640g/l、硫酸铵320-360g/l、天冬酰胺5.2-6.4g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0；
进一步优选地，发酵培养基包括：葡萄糖2400g/l、豆粕水解液620g/l、硫酸铵340g/l、天冬酰胺5.8g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0。
优选地，所述步骤(3)的发酵培养基中葡萄糖：硫酸铵＝120:16-18；更优选地，葡萄糖：硫酸铵＝120:17。
优选地，所述步骤(3)中的补料培养基包括：葡萄糖2200-2600g/l、豆粕水解液560-640g/l、天冬酰胺5.2-6.4g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0。
进一步优选地，补料培养基包括：葡萄糖2400g/l、豆粕水解液620g/l、天冬酰胺5.8g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0。
优选地，所述步骤(3)发酵培养过程中分别在发酵16h和28h时添加补料培养基。
优选地，所述步骤(3)发酵培养的培养温度为28℃-32℃，搅拌转速500rpm/min，培养36-38h。
优选地，所述步骤(3)发酵培养的发酵前16h的通气量为86l/h，16h之后的通气量为105l/h，通过自动流加氨水控制发酵过程中ph＝6.8±0.05，
优选地，所述步骤(4)超滤所用的滤膜为截留相对分子质量为20000da的聚醚砜超滤膜；纳滤所用滤膜是截留相对分子质量为300da的聚酰胺纳滤膜；反渗透膜为醋酸纤维素膜。
具体地，所述步骤(4)l-异亮氨酸的提取操作如下：
将发酵结束后的发酵液10000rpm/min离心10min，收集上清液；将上清液经过超滤、纳滤、反渗透过滤得到得到反渗透浓缩液和纯净水，纯净水可再次用于工业生产；将反渗透浓缩液真空干燥5h，最后得到白色结晶，即为纯化的l-异亮氨酸。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供了一种发酵生产l-异亮氨酸的方法，优化了发酵培养的培养基、培养条件和过程。在发酵培养基中添加天冬酰胺，显著提高了糖酸转化率和l-异亮氨酸的产量；通过控制发酵培养基中葡萄糖和硫酸铵的比例，明显降低了发酵液中铵氮含量；另外，对发酵液中l-异亮氨酸提取工艺进行了优化，提高了l-异亮氨酸的纯度，避免了大量废水的产生。该方法工艺简单易控制，成本较低，非常具有工业实用价值。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例1：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
(1)活化培养：将钝齿棒杆菌接种至平板培养基上，培养箱中30℃活化培养12h，得到活化菌；
平板培养基：葡萄糖1g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、nacl2.5g/l、琼脂粉20g/l，ph＝6.8-7.0；
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200ml/500ml，种子培养的条件为30℃，200r/min摇床培养24h，得到种子液；
种子培养基：葡萄糖92g/l、豆粕水解液83g/l、硫酸铵18g/l、硫酸镁3.5g/l、磷酸二氢钾3.2g/l，ph＝6.8-7.0；
(3)发酵培养：按照6％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有发酵培养基的10l发酵罐中，装液量为6l/10l，培养温度为30℃，搅拌转速500rpm/min，分别在发酵16h和28h时添加补料培养基，发酵前16h的通气量为86l/h，16h之后的通气量为105l/h，通过自动流加氨水控制发酵过程中ph＝6.8±0.05，培养36-38h，得到发酵液。发酵结束时间以产酸不再增加为判断标准。发酵培养前后，用高效液相色谱法测定l-异亮氨酸含量；利用生物传感分析仪检测发酵液残糖的含量，计算糖酸转化率；
发酵培养基：葡萄糖2400g/l、豆粕水解液620g/l、硫酸铵340g/l、天冬酰胺5.8g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0(葡萄糖：硫酸铵＝120:17)。
补料培养基：葡萄糖2400g/l、豆粕水解液620g/l、天冬酰胺5.8g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0。
(4)l-异亮氨酸的提取：将发酵结束后的发酵液10000rpm/min离心10min，收集上清液；将上清液经过超滤(20000da的聚醚砜超滤膜，操作温度40℃，操作压力0.16mpa)、纳滤(300da的聚酰胺纳滤膜，操作温度45℃，操作压力0.5mpa)、反渗透(醋酸纤维素膜，操作温度为32℃，操作压力0.7mpa，)过滤得到得到反渗透浓缩液和纯净水，纯净水可再次用于工业生产；将反渗透浓缩液真空干燥5h，最后得到白色结晶，即为纯化的l-异亮氨酸。
实施例2：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例1的区别仅在于，步骤(3)发酵培养的接种量为9％。
实施例3：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例1的区别仅在于，步骤(3)发酵培养的接种量为12％。
实施例4：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)的培养温度为发28℃。
实施例5：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)的培养温度为发32℃。
实施例6：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基中硫酸铵为320g/l，即葡萄糖：硫酸铵＝120:16。
实施例7：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基中硫酸铵为360g/l，即葡萄糖：硫酸铵＝120:18。
实施例8：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基中天冬酰胺为5.2g/l。
实施例9：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基中天冬酰胺为6.4g/l。
实施例10：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基为葡萄糖2200g/l、豆粕水解液560g/l、硫酸铵320g/l、天冬酰胺5.2g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0；
补料培养基：葡萄糖2200g/l、豆粕水解液560g/l、天冬酰胺5.2g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0。
实施例11：一种发酵生产l-异亮氨酸的方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基为葡萄糖2600g/l、豆粕水解液640g/l、硫酸铵360g/l、天冬酰胺6.4g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0；
补料培养基：葡萄糖2600g/l、豆粕水解液640g/l、天冬酰胺6.4g/l、硫酸镁5g/l、磷酸二氢钾13g/l，ph＝6.8-7.0。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，步骤(3)发酵培养的接种量为5％。
对比例2
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)的培养温度为发34℃。
对比例3
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)的所用的发酵培养基中不添加天冬酰胺。
对比例4
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基中硫酸铵为300g/l，即葡萄糖：硫酸铵＝120:15。
对比例4：一种提高l-异亮氨酸产量的方法
中国专利公布cn108796003a的实施例1，发酵液中l-异亮氨酸产量为19.2g/l。
对比例5：一种l-异亮氨酸的分离纯化方法
中国专利公告cn103409476b的实施例1，得到的l-异亮氨酸精品，纯度为99.2％。
对实施例1-11和对比例1-5的检测结果进行比较，见表1。
表1
注：“—”表示无测定值。
表1中的实验数据显示，使用所提供的方法生产l-异亮氨酸，发酵液中l-异亮氨酸的产量在25.35g/l以上；最高达到26.86g/l，糖酸转化率在25.36％以上，最高达到27.31％；铵氮含量在837.4mg/l以下；纯化后的l-异亮氨酸纯度高，达到99.5％以上。比较实施例1-3和对比例1可看出，接种量能够影响l-异亮氨酸的产量；比较实施例2,4-5和对比例2可看出，温度能够影响l-异亮氨酸的产量；比较实施例2,6-7,10-11和对比例4可看出，发酵培养基中葡萄糖和硫酸铵的比例能够影响发酵液中铵氮含量；比较实施例2,8-9和对比例3可看出，发酵培养基中天冬酰胺的含量能够影响糖酸转化率和l-异亮氨酸的产量。
综上，利用本发明所提供的法生产l-异亮氨酸，显著提高了糖酸转化率、l-异亮氨酸的产量以及纯度，且明显降低了发酵液中铵氮含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。