一种提高可得然胶高产菌株筛选效率的方法与流程

本发明涉及微生物育种技术领域，具体涉及一种能够提高可得然胶高产菌株筛选效率的方法。

背景技术：

可得然胶(curdlan)是一种微生物发酵生产的胞外多糖，同时具备植物多糖与合成高分子物质的独特性质且安全无毒，经过几十年的研究与发展，已被应用于多个工业领域。可得然胶在国内外具有巨大的市场需求，食品、化工、保健、医疗等领域的应用需求与日俱增，主要的市场份额被美国和日本占领，而我国的可得然胶研究水平主要在实验室研究阶段，虽然已有工厂开始进行大规模工业生产，但其产量和品质与国外的产品相比仍有一定差距，所以采取有效的研究方法来提升可得然胶的产量和品质并达到商业化生产标准是很有必要的。

人工诱变育种是一种可有效获得高产菌株的育种方式，它以不定向的基因突变为基础，对野生型菌种进行改良，获得可稳定遗传且产生更多可用产物的优良菌种。诱变育种过程中突变株的平板筛选是非常重要的环节，传统的平板筛选具有盲目性、随机性，对筛选到高产菌株有较大的阻碍和限制，因此，建立有效的平板筛选方法以提高筛菌效率、缩短筛菌周期至关重要。

苯胺蓝是一种生物染色剂，它可以和可得然胶专一性结合形成蓝色复合物，同时，在酸性条件下苯胺蓝也会显示蓝色。在使用平板培养基筛选可得然胶高产菌株时，利用苯胺蓝与可得然胶结合显蓝色的原理，用该染色剂作为指示剂，可以提高筛选效率。

产可得然胶菌株在产胶的同时会产酸，产酸会消耗培养基的碳源，影响可得然胶的产量，产酸减少或不产胶会提高可得然胶的产量，因此本发明提出通过在苯胺蓝筛选平板上进一步添加nai和naio3浓度，碘离子和碘酸根离子在酸性的有质子(h⁺)参与的条件下，反应生成碘单质(i2)，碘单质对菌体细胞有致命的毒害作用，能够杀死产酸产质子(h⁺)的菌体，因此产生h⁺越多，即产酸越多的菌体会在含有的碘单质(i2)的培养基中被杀死，而产酸少或不产酸的菌体则可以在该环境中存活下来，而对于产可得然胶的菌体，产酸越少，产量越高的概率越大，因此，通过这一方法，可以大大提高筛选到高产可得然胶菌株的效率。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种有效的平板筛选方法，能够提高可得然胶高产菌株筛选效率，提高可得然胶高产菌株的诱变筛选效率，缩短筛菌周期。

本发明提出了一种提高可得然胶高产菌株筛选效率的方法，包括以下步骤：

(1)产可得然胶出发菌株的培养；

(2)出发菌株的ntg诱变；

(3)配制苯胺蓝平板筛选培养基；

(4)在苯胺蓝筛选培养基中加入nai和naio3；

(5)诱变菌液在苯胺蓝和nai和naio3双筛选平板培养基上的初筛；

(6)50ml/250ml摇瓶发酵复筛，根据测定粗产量筛选高产菌株；

(7)75ml/500ml摇瓶发酵二次复筛，根据测定可得然胶产量筛选高产菌株。

步骤(1)中，所述产可得然胶出发菌株为产可得然胶杆菌atcc31749，任何能产可得然胶且能产酸的土壤杆菌均能用于本发明所述的方法，本发明没有特别的限制。

步骤(2)中，所述产可得然胶出发菌株的ntg诱变方法为：取适量震荡培养好的种子液离心，od600控制在0.2～0.8，缓冲液重悬菌体沉淀，稀释后加入等体积0.1～1mg/ml的ntg溶液，反应20～40min，然后加入硫代硫酸钠溶液终止反应，将上述反应物离心，使用无菌水洗涤并重悬菌体沉淀，得到诱变菌液。

其中，所述适量的震荡培养好的种子液可以是2ml震荡培养好的种子液。

本发明中，所述“产可得然胶菌株”指所有能产生可得然胶的菌株。

本发明中，所述“种子液”是指摇瓶培养的产可得然胶菌株的菌液。

优选地，所述种子液的培养条件为：30℃，250rpm，18h。

本发明中，缓冲液为20mmtris马来酸缓冲液，ph值为8.5。

本发明中，所述诱变方法的反应条件为30-35℃，180-220rpm，20-60min；优选地，所述诱变反应条件为：30℃，200rpm，30min。

所述步骤(3)中，所述苯胺蓝平板筛选培养基的组分包括：6-9％的乙二醇，0.1-0.4％的酵母粉，1-2％的琼脂粉，和0.003-0.005％的苯胺蓝，ph值为7.0；优选地，所述苯胺蓝平板筛选培养基的组分包括：7％的乙二醇，0.2％的酵母粉，2％的琼脂粉，以及0.005％的苯胺蓝，ph值为7.0。

其中，所述苯胺蓝平板筛选培养基组分中的所述苯胺蓝为菌落显色剂，它可以和可得然胶特异性结合形成蓝色复合物。同时，在酸性条件下苯胺蓝也会显示蓝色。

步骤(4)中，所述nai和naio3为两种化学反药物，在酸性条件下可发生应产生碘单质，杀死产酸的菌体细胞。

步骤(4)中，根据所需的药物浓度比例配制nai溶液与naio3溶液，单独灭菌后加入到已灭菌的苯胺蓝培养基中，混匀，倒平板。其中，所述培养基中加入的nai终浓度(nai终浓度，即，加入培养基后，培养基中nai的浓度)范围是0.05-0.2mol/l，naio3终浓度(naio3终浓度，即，加入培养基后，培养基中naio3的浓度)范围是0.01-0.04mol/l。

步骤(5)中，将通过步骤(2)得到的诱变菌液倍比稀释后涂布于添加nai和naio3的平板筛选培养基上，培养4～10天，作为实验组；同时涂布未添加nai和naio3的平板筛选培养基作为对照组。

其中，实验组和对照组所涂布的诱变菌液稀释倍数一致，菌液体积一致。

优选地，所有添加药物如nai、naio3的平板筛选培养基中，nai含量的数值范围为0.05-0.2mol/l；naio3含量的数值范围为0.01-0.04mol/l。进一步优选地，所含有的nai与naio3浓度(mol/l)比例为某一确定值。

优选地，平板菌落培养条件为30-35℃；进一步优选地，平板菌落培养条件为30℃静置培养。

优选地，平板菌落培养时间为4-10天；进一步优选地，平板菌落培养时间为6天。

步骤(6)中，所述摇瓶发酵复筛的方法为：挑选筛选平板培养基上长出的菌落，接种于50ml/250ml(50ml/250ml指250ml摇瓶中发酵培养基的体积为50ml)摇瓶发酵培养基内，250rpm，30℃，恒温振荡培养96h，得到发酵液。根据测定粗产量优选高产菌株。

其中，对照组平板上挑选的菌落样本总数应与实验组平板上挑选的菌落样本总数一致。

优选地，所述摇瓶发酵培养条件的范围为30-35℃，200-250rpm，48-96h；进一步优选地，所述摇瓶发酵培养条件为：30℃，250rpm，96h。

步骤(6)中，所述发酵液中可得然胶的粗产量测定方法为：取10ml发酵液于50ml离心管中，9000rpm，离心5min，沉淀用95％乙醇清洗，充分混匀后静置，离心，重复乙醇清洗过程2次，离心，沉淀于60℃烘箱中过夜烘干，称重m，计算粗提产量：粗提产量g/l＝m/10×1000。

步骤(7)中，所述摇瓶二次发酵复筛的方法为：挑选筛选平板培养基上长出的菌落，接种于50ml/250ml(50ml/250ml指250ml摇瓶中发酵培养基的体积为50ml)或75ml/500ml(75ml/500ml指500ml摇瓶中发酵培养基的体积为75ml)摇瓶发酵培养基内，250rpm，30℃，恒温振荡培养96h，得到发酵液，根据测定可得然胶产量优选高产菌株。

本发明中，所述摇瓶发酵复筛和摇瓶发酵二次复筛培养基的组分包括：9％的蔗糖，0.5％的(nh4)2hpo4，0.15％的kh2po4，0.1％的mgso4·7h2o，0.3％的酵母粉，ph调至7.0。

步骤(7)中，所述测定可得然胶产量方法为：取5ml发酵液，加入3mol/lnaoh溶液75ml，充分搅拌至胶完全溶解。静置30min，9000rpm，离心10min，取上清。用3mol/lhcl溶液75ml与碱溶胶混合，搅拌混合均匀。静置10min后，9000rpm，离心5min。沉淀用150ml蒸馏水洗涤三次，每次9000rpm，离心5min。沉淀于60℃干燥箱过夜烘干，称重m，计算可得然胶产量：产量g/l＝m/5×1000。

本发明中，所述优选高产菌株的标准为可得然胶粗产量或产量高于出发菌株。

将可得然胶粗提产量高于出发菌株的突变菌株作为正突变菌株，正突变率的计算方式为：正突变率(％)＝(筛选菌株样本中正突变菌株个数÷筛选菌株样本总数)×100％。计算实验组和对照组的正突变率，分析比较其差异，实验组正突变率应大于对照组。

本发明中，所述“正突变菌株”是指可得然胶粗提产量高于出发菌株的所有突变菌株。

本发明创新性地提出，产可得然胶菌株在产胶的同时会产酸，产酸越多会在一定程度上影响可得然胶的分泌量，在平板筛选培养基中加入化学药物nai和naio3，碘离子和碘酸根离子在有质子(h+)参与的条件下，反应生成碘单质(i2)，单质碘对菌体细胞有致命的毒害作用，能够杀死细胞，由上可知，产生h+越多，即产酸越多的细菌会在含有i-io3^-的培养基中被杀死，而产酸越少的细菌越有可能在该环境中存活下来，对于产可得然胶杆菌，产酸少的菌株产胶多的可能性更大。

本发明有益效果还包括：缩短筛菌周期、提高平板筛菌效率、建立有效工业育种的新方法、改善苯胺蓝平板底色变蓝的情况。

附图说明

图1表示本发明中培养基ph梯度为7.0，6.5，6.0，5.5，nai与naio3浓度(mol/l)比例为0.05/0.01，0.075/0.015，0.1/0.02的菌落生长情况。

图2表示本发明中培养基ph梯度：7.0，6.0，nai与naio3浓度(mol/l)比例为0.1/0.02，0.15/0.03，0.2/0.04的菌落生长情况。

图3表示本发明中ntg浓度为0.3mg/ml，平板筛选培养基ph为6.0，添加的nai与naio3浓度比为0.1/0.02mol/l时诱变菌株的可得然胶粗提产量，横坐标代表对照组与实验组菌株的菌株编号(图3a为对照组，图3b为实验组)。

图4表示本发明中ntg浓度为0.5mg/ml，平板筛选培养基ph为6.0，添加的nai与naio3浓度比为0.1/0.02mol/l时诱变菌株的可得然胶粗提产量，横坐标代表对照组与实验组菌株的菌株编号(图4a为对照组，图4b为实验组)。

图5表示本发明中ntg浓度为0.7mg/ml，平板筛选培养基ph为6.0，添加的nai与naio3浓度比为0.1/0.02mol/l时诱变菌株的可得然胶粗提产量，横坐标代表对照组与实验组菌株的菌株编号(图5a为对照组，图5b为实验组)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1平板筛选培养基nai和naio3浓度的确定

按照不同的药物配比将nai与naio3加入ph为6.0的苯胺蓝筛选培养基，筛选培养基成分为：乙二醇7％，酵母粉0.2％，苯胺蓝0.005％；nai与naio3浓度(mol/l)比例：0.05/0.01，0.075/0.015，0.1/0.02，0.15/0.03，0.2/0.04，琼脂2％ph调至7.0；将未诱变的出发菌株菌液倍比稀释后涂布于上述条件的平板及未添加药物的平板，菌落生长情况如图1所示，不同条件平板上的菌落个数统计情况如表1所示。对照组平板菌落数比实验组平板菌落数多，说明实验组平板有一定的致死作用；对照组平板菌落不仅变蓝，底板也大面积变蓝，而实验组平板菌落虽然已全部变蓝，但底板并无变蓝现象，所以加入nai/naio3可解决菌落生长显色过程中苯胺蓝平板底板变蓝的问题，从而排除菌种因产酸导致底板变蓝的现象。

随着药物浓度的升高，平板上的菌落个数越少，药物致死作用越强，nai与naio3浓度比例为0.1/0.02mol/l时致死作用适宜，且菌落生长速度及生长状态相对合适，所以可选择在该条件下进行诱变菌落的平板筛选。

表1不同条件平板上菌落生长个数

实施例2ntg浓度为0.3mg/ml时nai和naio3对诱变菌株筛选结果的影响

用ph值为8.5的20mmtris马来酸缓冲液配制0.3mg/ml的ntg进行化学诱变，平板筛选培养基为：乙二醇7％，酵母粉0.2％，苯胺蓝0.005％，添加的nai与naio3浓度比为0.1/0.02mol/l，琼脂2％，ph调至7.0，诱变菌液同时涂布对照组平板(未添加药物)和实验组平板(添加药物)，对照组和实验组各挑菌50株，根据挑选菌株后期发酵粗提产量情况计算出对照组正突变菌16株，正突变率为31％；实验组正突变菌24株，正突变率为47％。实验组正突变率高于对照组正突变率，说明在该实验条件下，筛选平板添加nai和naio3可将部分产酸多的菌株杀死，使筛选到高产胶能力菌株的可能性变大。

诱变菌株后对照组和实验组挑选的菌株后期发酵液粗提产量如图3所示，由图3可知，对照组突变率仅为31％，而实验组正变率为47％，差异显著(p＜0.05)。

实施例3ntg浓度为0.5mg/ml时nai和naio3对诱变菌株筛选结果的影响

ntg浓度0.5mg/ml，平板筛选培养基ph为7.0，添加的nai与naio3浓度比为0.1/0.02mol/l，诱变菌液同时涂布对照组平板(未添加药物)和实验组平板(添加药物)，对照组和实验组各挑菌50株，对照组正突变菌14株，正突变率为28％；实验组正突变菌23株，正突变率为46％。

诱变菌株在上述条件平板上的菌落个数统计情况如表3所示，对照组和实验组挑选的菌株后期发酵液粗提产量如图4所示，由图4可知，对照组突变率仅为28％，而实验组正变率为46％，差异显著(p＜0.05)。

实施例4ntg浓度为0.7mg/ml时nai和naio3对诱变菌株筛选结果的影响

ntg浓度为0.7mg/ml，平板筛选培养基ph为7.0，添加的nai与naio3浓度比为0.1/0.02mol/l，诱变菌液同时涂布对照组平板(未添加药物)和实验组平板(添加药物)，对照组和实验组各挑菌50株，对照组正突变菌17株，正突变率为34％；实验组正突变菌28株，正突变率为56％。筛选平板添加nai和naio3可提升筛选到高产菌株的几率。

诱变菌株在上述条件平板上的菌落个数统计情况如表5所示，对照组和实验组挑选的菌株后期发酵液粗提产量如图5所示，由图5可知，对照组突变率仅为34％，而实验组正变率为56％，差异显著(p＜0.05)。

综合分析上述实验结果，利用在平板筛选培养基中添加适宜浓度(nai浓度范围是0.05-0.2mol/l，naio3浓度范围是0.01-0.04mol/l)nai和naio3的方法，可以抑制产酸较多菌落的生长，由于菌株产酸与产胶成一定的负相关性关系，从该筛选平板上筛菌时可以增大挑选出高产菌的几率，从而提高正突变率，达到提高可得然胶高产菌株筛选效率的目的。

本发明保护内容不局限以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。