一种基于Fmoc二肽的合成醋酸德舍瑞林的方法与流程

本发明涉及德舍瑞林的合成方法，特别涉及一种基于Fmoc二肽的合成醋酸德舍瑞林的方法。

背景技术：

中国专利201510735214.8公布了一种德舍瑞林的合成方法，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt在缩合剂的存在下缩合而成。采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四肽片段D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt在缩合剂的存在下缩合成德舍瑞林，这一反应两个片段分子结构比较大，不经过纯化纯度偏低，影响两个片段缩合后的纯度，要是经过纯化，这又增加了操作步骤，增加了溶剂和人工成本，不利于产业化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于Fmoc二肽的合成醋酸德舍瑞林的合成方法。主要解决现有合成方法步骤复杂，固相合成杂质多，粗品纯度低，合成周期长等技术缺陷。

本发明的技术方案为：一种基于Fmoc二肽的合成醋酸德舍瑞林的方法，包括如下步骤：

第一步，合成H-Arg(pbf)-Pro-NHEt 片段

H-Pro-OH 与Boc酸酐反应后 经过浓缩，重结晶和干燥得Boc-Pro-OH；

Boc-Pro-OH 和乙胺搅拌反应得H-Pro-NHEt ，（H-Pro-NHEt与Z-arg(pbf)-OH 的物料摩尔比为1:(0.9-1.2)，优选：1:1.1）再和Z-Arg(pbf)OH用 DCC 缩合重结晶得Z-Arg(pbf)-Pro-NHEt，再氢化得H-Arg(pbf)-Pro-NHEt，结构式I：

结构式I。

第二步，合成Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH片段，

Z-Tyr（tBu）-OH和H-D-Trp（Boc）-ome.Hcl（物料摩尔比为1:(09.-1.2)，优选：1:1.1）通过DCC在THF中进行缩合反应，再用醋酸乙酯溶解，用水重结晶，蒸干醋酸乙酯，加入甲醇溶剂， 滴加NaOH 溶液，水解甲酯得Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH，结构式II：

结构式II。

第三步，合成Fmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH片段，

Z-Trp（Boc）-OH和H-Ser（tBu）-ome.Hcl（物料摩尔比为1:(09.-1.2)，优选：1:1.1）通过DCC在THF中进行缩合反应，再用醋酸乙酯溶解，用水重结晶，蒸干醋酸乙酯，加入甲醇溶剂， 滴加NaOH 溶液，水解甲酯得Fmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH片段；

结构式III。

第四步，合成德舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt

1）以H-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂（取代度0.4-0.8mmol/g）为起始树脂，优选0.6mmol/g,用DCM浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH，NMM，选用HBTU、TBTU或HATU中的一种与HOBT作为缩合剂,以DMF作为溶剂，反应1-2小时，用茚三酮法检测反应终点，用DMF洗涤3-5次，抽干，得Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂，然后再加入脱帽试剂（脱帽试剂为体积比20%的哌啶/DMF的混合溶液）反应30分钟，用DMF洗涤5-6次，再依次偶联Fmoc-Trp（Boc）-Ser(tBu)-OH片段,Fmoc-His(Trt)-OH,Pyr,合成得到侧链全保护的肽链树脂Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂，并用DCM或乙醚抽干；

2) 对肽链片段的树脂进行切割，得到全保护的肽链片段

把上述树脂加入到体积比1%-2%的TFA的DCM溶液中，或者体积比20%的三氟乙醇的DCM溶液中，或者三氟乙醇与醋酸与DCM按体积比1:2:7的混合液，优选体积比1%-2%的TFA的DCM溶液，室温反应30分钟，过滤收集液体，再重复2次，减压蒸馏，加入乙醚析出并重结晶，得到全保护的Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu；

3）德舍瑞林全保护片段的合成

Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu和Arg(pbf)-Pro-NHEt按摩尔比（1-1.2）:1在DMF溶液中,加入缩合剂DIC,NMM,反应2-3h后，用茚三酮法检测反应终点，再用水和乙醚重结晶得到Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)

-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt的全保护片段；

4）把全保护的德舍瑞林H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt加入裂解试剂（V/V%,三氟乙酸:对甲苯酚:水:Tis:硫醇=82.5:5:5:5:2.5，或者三氟乙酸:水:Tis=95:2.5:2.5；裂解试剂优选V/V%,三氟乙酸：对甲苯酚：水：Tis:硫醇=82.5:5:5:5:2.5），室温下反应2-3小时，再加乙醚重结晶，去除侧链保护基团，得到德舍瑞林粗品肽：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt。

本发明的有益效果是：本发明具备大规模化生产能力，操作简易、工艺稳定、生产成本低，同时减少了气味大的哌啶的使用。相比于Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu）-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-OH与H-Pro-NHEt,和Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)

-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH进行乙胺化修饰，或者运用常规Fmoc二肽合成Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)

-Pro-OH片段，然后再进行乙胺化修饰的这三种方法，本发明三个化合物可以同时安排合成，合成周期短，片段纯度高，有利于实现产业化，粗品收率可达86%。粗品纯度可以达到87.83%。

附图说明

图1为德舍瑞林粗产物色谱图。

具体实施方式

实施例1，按照本发明，分别同时合成三个片段，H-Arg(pbf)-Pro-NHEt,Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH,Fmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH。

以H-Leu-2Cl-Trt-Cl树脂为起始树脂采用Fmoc固相合成法逐一偶联Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH，Fmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH，Fmoc-His（trt）-OH，Pyr，其间依次脱除Fmoc-保护基团，合成得到侧链全保护的肽链树脂Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂，再把侧链带保护的全保护多肽从树脂上裂解下来，得到的Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-OH,再用这个全保护片段和H-Arg(pbf)-Pro-NHEt按照摩尔比=1:1进行反应，再结晶出全保护的德舍瑞林，裂解脱除掉侧链的保护基团，用乙醚析出德舍瑞林的粗品，经过纯化转醋酸盐得到醋酸德舍瑞林。方法包括如下步骤：

1，合成H-Arg(pbf)-Pro-NHEt 片段

1)H-Pro-OH 1kg（6.88mol）与2.5kg（Boc）2（11.47mol）在丙酮5L和水5L中反应，调pH=8-9，反应16小时后 浓缩掉丙酮，用石油醚5L重结晶两次，加入5L醋酸乙酯和 2N HCl酸化到pH=2-3，分去水相，水相用醋酸乙酯再重结晶一次，合并乙酯相，用水洗和饱和盐水洗两次，再用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，滤饼乙酯洗涤，浓缩得1.25kg的Boc-Pro-OH（5.85mol）。

2) 将Boc-Pro-OH 加入8LTHF 中溶解，冷却到0摄氏度，滴加621g（6.13mol）N-甲基吗啡啉，滴完30分钟再滴加666g（6.13mol）氯甲酸乙酯， 滴完30分钟滴加乙胺500g，搅拌反应24h，浓缩至干，加入乙酯溶解，饱和盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤浓缩至干，加入乙醚盐酸气，得到800g（5.06mol） H-Pro-NHEt。

3)3.223kg Z-Arg(pbf)-OH（5.566mol）溶于15L的THF, 加入800g（5.06mol） H-Pro-NHEt搅拌溶解，冷却, DCC 用THF 溶解,在0-5摄氏度条件下滴加到反应液中，反应24h，浓缩除去THF，加入乙酯溶解，再用饱和盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤, 浓缩至干，得到3.15kg（4.5mol）Z-Arg(pbf)-Pro-NHEt。

4)Z-Arg(pbf)-Pro-NHEt 加入30kg甲醇溶解，加入钯炭和甲酸铵进行氢化反应，氢化完成过滤， 浓缩至干得2.1kg（3.7mol）的H-Arg(pbf)-Pro-NHEt ，纯度：98%。

2，合成Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH片段

1）Z-Tyr（tBu）-OH（1mol，371.4g）溶于5升THF加入H-D-Trp（Boc）-OMe.HCL（1.1mol，406g）搅拌溶解，冷却, DCC（230g）用THF溶解,在0-5摄氏度条件下滴加到反应液中，反应24h，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准），浓缩掉THF，加入乙酯溶解，饱和盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤，浓缩至干得到538g（0.8mol）Z-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OMe。

2）加入5倍重量的甲醇，滴加氢氧化钠溶液（1.3当量），回流2小时，加水适量酸化至pH=2-3。用体积是反应液5倍量的醋酸乙酯重结晶两次，合并有机相，盐水洗涤两次，浓缩至干得Z-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH 473g（0.72mol），加入40Kg甲醇溶解，加入钯炭和甲酸铵氢化，氢化完成过滤 浓缩至干得H-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH 300g（0.576mmol）。

3）加入10倍重量二氧六环，碳酸钠（49g）搅拌，冷却到0摄氏度加入Fmoc-osu（164g），反应完全加入适量水，用乙醚重结晶4次，酸化pH=2-3，用醋酸乙酯重结晶2次，合并有机相，盐水洗涤干燥，浓缩至适量结晶 的Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH （340g），纯度95%

3，合成Fmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH片段，

1）Z-Trp（Boc）-OH(435g,1mol)溶于10倍重量THF加入H-Ser（tBu）-OMe.HCL(232.9g,1.1mol)搅拌溶解，冷却, DCC(230g,1.1mol)用THF溶解,在0摄氏度条件下滴加到反应液中，反应过夜，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准），浓缩掉THF，加入乙酯溶解，饱和盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤，浓缩至干得到Z-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OMe(474g)。

2）加入5倍重量的甲醇，滴加1.3当量氢氧化钠溶液，回流2小时，加水适量酸化pH=2-3。用体积是反应液5倍量的醋酸乙酯重结晶两次，合并有机相，盐水洗涤两次，浓缩至干Z-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH(369g)，加入40Kg甲醇溶解，加入钯炭和甲酸铵氢化，氢化完成过滤浓缩至干得H-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH(216g)。

3）加入10倍重量二氧六环，碳酸钠（52g），水搅拌，冷却到0摄氏度加入Fmoc-osu（135g），反应完全加入适量水，用乙醚重结晶4次，酸化pH=2-3，用醋酸乙酯重结晶2次，合并有机相，盐水洗涤干燥，浓缩至适量，结晶得Fmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH (262g），纯度95%。

4, Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-OH的合成

1）H-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂的合成

以50gH-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂（取代度0.6mmol/g，30mmol）树脂为起始树脂，用400mlDCM浸泡30min，使树脂充分溶胀，抽干，以400mlDMF做溶剂，加入44.72g Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-OH(MW:745.3g/mmol,60mmol)、13.5mlNMM(MW:102.1g/mmol,60mmol)，用22.8gHBTU（MW:379.2g/mmol）,HOBT(MW:135.1g/mmol,60mmol)8.1g为缩合剂，反应1-2小时，茚三酮法检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂；加入脱帽试剂500ml（脱帽试剂为体积比20%的哌啶/DMF的混合溶液）反应30分钟，抽干，500mlDMF洗涤5-6次，得H-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂；

2) H-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂的合成

在H-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂中加入600mlDMF,40.16gFmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-OH(MW:669.3g/mmol,60mmol)、13.5mlNMM(MW:102.1g/mmol,60mmol)，用22.8gTBTU和8.1g HOBT为缩合剂，反应1-2小时，茚三酮法检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂；加入脱帽试剂600ml（脱帽试剂为体积比20%的哌啶/DMF的混合溶液）反应30分钟，抽干，500mlDMF洗涤5-6次，得H-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂。

3） H-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂的合成

在H-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂中加入700mlDMF,37.18gFmoc-His（trt）-OH(MW:619.71g/mmol,60mmol)、13.5mlNMM(MW:102.1g/mmol,60mmol)，用22.8gHATU和8.1g HOBT为缩合剂，反应1-2小时，茚三酮法检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂；加入脱帽试剂700ml（脱帽试剂为体积比20%的哌啶/DMF的混合溶液）反应30分钟，抽干，700mlDMF洗涤5-6次，得H-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂。

4） H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂的合成

在H-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂中加入800mlDMF,7.75gH-Pyr-OH(MW:129.1g/mmol,60mmol)、13.5mlNMM(MW:102.1g/mmol,60mmol)，用22.8gHBTU（MW:379.2g/mmol,60mmol）和8.1g HOBT为缩合剂，反应1-2小时，茚三酮法检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，获得H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂；加入脱帽试剂800ml（脱帽试剂为体积比20%的哌啶/DMF的混合溶液）反应30分钟，抽干，800mlDMF洗涤5-6次，再用无水乙醚抽干得H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂。抽干得树脂95g。

5)H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-OH的合成

将95gH-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂转移到2L的容器中，加入预先配置好1%TFA的DCM溶液(体积比）1L中，室温反应30分钟，过滤，收集滤液，再重复2次，将滤液减压蒸馏，获得43g全保护的H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-OH。

6)H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt的合成

H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-OH（43g，27.7mmol）和H-Arg(pbf)-Pro-NHEt（15.18g，27.7mmol）按照摩尔比1:1，加入400mlDMF，加入HOBT(27.7mmol），DIEA(54.4mmol），TBTU(27.7mmol）室温反应2-3h，用1.5L乙醚析出多肽,减压蒸馏得到全保护的德舍瑞林H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt（46.5g）。

7）H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

把全保护的德舍瑞林H-Pyr-His（trt）-Trp（Boc）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-D-Trp（Boc）-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt加入300ml裂解试剂（V/V%,三氟乙酸:对甲苯酚:水:Tis:硫醇=82.5:5:5:5:2.5）室温下裂解2-3小时，将裂解液倒入预先冷却好的2L无水乙醚中，搅拌，静至，离心，再用无水乙醚洗涤4次，真空干燥，得到白色粉末状的德舍瑞林粗品24.72g。

HPLC纯度，收率86%，HPLC纯度87.83%，色谱见图1。

实施例2：

第一步投料比选用H-Pro-NHEt与Z-arg(pbf)-OH 的物料摩尔比为1:1；2.93kg Z-Arg(pbf)-OH（5.06mol）溶于15L的THF, 加入800g（5.06mol） H-Pro-NHEt，得到

第二步投料比选用Z-Tyr（tBu）-OH和H-D-Trp（Boc）-ome.Hcl（物料摩尔比为1:1），Z-Tyr（tBu）-OH（1mol，371.4g）溶于5升THF加入H-D-Trp（Boc）-OMe.HCL（1.1mol，369.1g）

第三步投料比选用Z-Tyr（tBu）-OH和H-D-Trp（Boc）-ome.Hcl（物料摩尔比为1:1 其余同实施例1，最终得到德舍瑞林粗品22g，总收率：82%，HPLC纯度85.1%。色谱参见图1。

实施例3：

选用取代度是0.5mmol/g的H-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂为起始树脂，其余同实施例1，最终得到德舍瑞林粗品22.1g，总收率：82.3%，HPLC纯度85.4%。色谱参见图1。

实施例4：

裂解试剂选用（V/V%，三氟乙酸：水：Tis=95:2.5:2.5）其余同实施例1，最终得到德舍瑞林粗品23g，总收率：83.6%，HPLC纯度86.2%。色谱参见图1。

实施例5：

把Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂加入到体积比20%的三氟乙醇的DCM溶液中，其余同实施例1。

实施例6：

把Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-2-氯三苯甲基氯树脂加入到三氟乙醇与醋酸与DCM按体积比1:2:7的混合液中，其余同实施例1。

本发明中一些常用缩写具有以下含义

HBTU：O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

DCC：二环己基碳二亚胺

DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺

HOBt：1-羟基苯并三唑

DIEA：二异丙基乙胺

NMM：N-甲基吗啉

Fmoc：芴甲氧羰基

Pbf：2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5磺酰基

Trt：三苯甲基

Tbu：叔丁基

Boc：叔丁氧羰基

Pyr：焦谷氨酸

His：组氨酸

Trp：色氨酸

D-Trp：D-色氨酸

Ser：丝氨酸

Tyr：酪氨酸

Leu：亮氨酸

Arg：精氨酸

Pro：脯氨酸

Piperide：哌啶

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

TFA：三氟乙酸

EDT：乙二硫醇

Tis：三异丙基硅烷

Z:苄氧羰基

OMe：甲酯

Fmoc-OSU:9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯

THF:四氢呋喃。