连钱草中的三萜苷类化合物及其提取分离方法与流程

本发明涉及医药
技术领域：
，特别是以连钱草为原料，首次分离到的三萜苷类化合物及其提取方法和用途。上述化合物对肿瘤细胞株具有抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为研制治疗多种临床常见多发癌症的药物。
背景技术：
：连钱草为唇形科植物活血丹(glechomalongituba(nakai)kupr)的地上部分。质量标准收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部。味辛、微苦，性微寒，归肝、肾、膀胱经；具有清热解毒，利尿排石，散瘀消肿的功效，临床用于热淋、石淋、湿热黄疸、疮痈肿痛、跌打损伤。现代药理表明，连钱草具有利尿利胆、降脂、溶石、降血糖、抗炎、抗菌等作用，但未见其对癌细胞抑制作用的报道。连钱草所含化学成分复杂且结构多样，目前已经从连钱草分离出来的三萜类化合物有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂醇、白桦脂酸，但未有对其三萜苷成分的报道。技术实现要素：本发明的一个方面涉及式(i)和式(ii)的三萜苷类化合物，其能够从连钱草中提取得到。在本文中，式(i)的化合物可命名为连钱草皂苷a，式(ii)的化合物可命名为连钱草皂苷b。连钱草皂苷a和连钱草皂苷b的分子式为均为c48h78o20，其化学结构式如下：本发明的另一方面涉及一种制备式(i)和/或式(ii)的化合物的方法。所述方法包括以下步骤：(1)乙醇回流提取；(2)浓缩乙醇提取液；(3)氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取；(4)浓缩水饱和正丁醇萃取液；(5)柱层析分离；以及任选地(6)纯化。具体而言，所述方法包括以下步骤：(1)用乙醇对连钱草药材进行加热回流，过滤后得乙醇提取液；(2)浓缩所述乙醇提取液，得乙醇浸膏；(3)乙醇浸膏用水溶解后，再用氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取，保留水饱和正丁醇萃取相，得水饱和正丁醇萃取液；(4)浓缩水饱和正丁醇萃取液，得正丁醇浸膏；(5)对正丁醇浸膏进行柱层析分离，得式(i)和式(ii)的化合物的粗品；(6)任选地对所述粗品进行单体化合物的纯化。在所述方法的一种实施方式中，在步骤(1)中，优选以阴干的连钱草药材为原料，经粉碎后用乙醇加热回流提取，过滤后得乙醇提取液。其中所用乙醇优选高浓度乙醇水溶液，例如大于70％，大于80％、大于90％，也可以采用100％纯乙醇，更优选70％-80％的乙醇水溶液，最优选为75％。在一种实施方式中，在步骤(2)中，浓缩优选减压浓缩。在一种实施方式中，在步骤(3)中，所述水优选蒸馏水。在一种实施方式中，在步骤(4)中，浓缩优选减压浓缩。在一种实施方式中，在步骤(5)中，柱层析分离优选包括以下步骤：(a)将正丁醇浸膏用水溶解，转入大孔树脂柱，用乙醇-水溶液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似(在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点)洗脱馏分，得6个馏分；(b)将第3个馏分与硅胶拌样，转入柱层析，用氯仿-甲醇混合液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似(在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点)洗脱馏分，得10个馏分；(c)将第8个馏分与c18拌样，转入c18反相柱层析，用甲醇-水溶液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似(在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点)洗脱馏分，得式(i)和式(ii)的化合物的粗品。其中所述术语“大孔树脂”采本领域公知的涵义，是具有大孔结构的树脂，又称全多孔树脂。其中，在步骤(5)(a)中作为洗脱剂的乙醇-水中，乙醇体积浓度可以为0％～100％；在步骤(5)(b)中作为洗脱剂的氯仿-甲醇混合液中，氯仿-甲醇体积配比可以为从20:1到1:1，例如20:1或10:1或5:1或3:1或1:1；在步骤(5)(b)的柱层析中所用硅胶粒度优选100～200目；步骤(5)(c)中作为梯度洗脱剂的甲醇-水溶液中，甲醇体积浓度可以为20％～80％。在一种实施方式中，所述方法的步骤(6)包括：将步骤(5)得到的粗品以乙腈-水为洗脱剂经制备液相色谱进行单体化合物的纯化。其中，乙腈水溶液的体积浓度可以为21％。步骤(6)也可以额外包括其他进一步的提纯步骤，例如重结晶等。经步骤(6)纯化后，所得的化合物的纯度可以为，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、或99％，或更高。以上工艺步骤(1)-(6)是相对独立的，所以上述各种实施方式可以任意组合，其组合所得技术方案和工艺条件都在本公开范围内。本申请的式(i)和式(ii)化合物的制备方法的一个示例性实施方案示于附图1中。根据式(i)和式(ii)的结构，有机合成技术人员也可以适当地设计合成路线，通过有机合成的方法来制备式(i)和式(ii)的化合物。发明人已经通过实验(例如测定抑制肿瘤细胞增殖的mtt法等)证明，本发明的化合物对人癌症细胞具有明显的抑制作用，例如对人胃癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞均有明显的抑制作用。因此，本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含作为活性成分的式(i)和/或式(ii)的化合物以及可药用载体和/或赋形剂。对于可药用载体和赋形剂并无特殊要求，只要其满足相关药品监管规定并且与本发明的化合物相容即可。本领域技术人员可以根据给药途径、剂型等等来选择合适的可药用载体或赋形剂。本文所用之“可药用载体”旨在包括与药物施用相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、等渗剂和延缓吸收剂等。可药用载体可以是固体或液体的。示例性的固体载体是乳糖、蔗糖、云母、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性的液体载体是糖浆、花生油、橄榄油、水、药用缓冲液等。示例性的可药用赋形剂的例子包括下述这些：填料，例如淀粉(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉等)、糖(包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇等)；粘合剂，例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、褐藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；保湿剂，例如甘油；崩解剂，例如聚维酮、乙醇酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、琼脂、碳酸钠和碳酸氢钠；用于延迟分解的试剂，例如石蜡；再吸收加速剂，例如季铵化合物；表面活性剂，例如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯；吸附性载体，例如，高岭土和斑脱土以及润滑剂，例如，滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙以及固体聚乙二醇。所述的药物组合物可以被配置为任何合适的剂型，例如液体剂型(例如溶液剂、悬浮剂、糖浆、乳剂等)或半固体剂型(例如软膏剂、凝胶剂等)或固体剂型(例如片剂、丸剂、颗粒、胶囊等)。根据需要，所述药物组合物的施用方式可以为，例如口服、肠胃外、皮内、皮下、肌内、腹膜内等。本发明化合物可以与其他药物活性物质联合使用。所述其他药物活性物质可以与本发明的化合物同时施用或分别以任何合适次序施用。或者，本发明的药物组合物可含有超过一种活性成分。其它的活性物质可以为，例如抗有丝分裂作用的药物(例如紫杉醇或长春新碱等)、抗代谢药(例如吉西他滨等)、针对dna的药物(例如阿霉素等)、针对拓扑异构酶的药物(如依托泊苷等)、针对肿瘤细胞中生物靶点的药物(例如郝赛酊等)。所述药物组合物可以通过将至少一种本发明化合物(作为活性成分)与一种或多种药物上合适的载体或赋形剂组合来制备，所述载体和赋形剂能协助将活性化合物加工成最终的药物制剂。本发明进一步涉及一种用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的方法，所述方法包括如下步骤：施予所述哺乳动物治疗有效量的式(i)和/或式(ii)的化合物。本发明进一步涉及一种用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的方法，所述方法包括如下步骤：施予所述哺乳动物治疗有效量的本发明的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的式(i)和/或式(ii)的化合物以及可药用载体和/或赋形剂。本发明还涉及式(i)和/或式(ii)化合物用于治疗哺乳动物(特别是人)的疾病的用途，优选地，所述疾病为癌症。本发明还涉及式(i)和/或式(ii)的化合物在制备用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的药物中的用途。上文所述“癌症”例如为乳癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、喉癌、肝癌、结肠癌、甲状腺癌、黑素瘤、肾癌、睾丸癌、白血病、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌等等。优选地，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌。术语“治疗有效量”在本文中使用时表示：当施用给需要治疗的哺乳动物(特别是人)时，足以起到有效治疗效果的本发明化合物的量。因此，本发明的化合物的治疗有效量可以是足以抑制、减少或消除癌细胞的量。发明人已发现：本发明化合物对人胃癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞均有明显的抑制作用。在具体治疗时，医生可以根据发病对象、病情严重程度、并发症的存在与否、是否联合用药等情况来调整并具体确定适合于病人使用的具体剂量。术语“治疗”在本文中使用时表示：预防、缓解、消除或治愈相应的病症。除非另有声明，本文中提到的化合物包括其无定形体、其各种晶型、其立体异构体、其互变异构体和经同位素标记的形式。所有这些以不同形式存在的化合物都落入本发明和给出的结构式的范围内。术语“立体异构体”指具有相同化学组成但是其原子或基团空间排列不同的化合物。除非另有声明，本文所公开的化合物的所有立体异构体(例如对映异构体和非对映异构体及其外消旋混合物)都包含在本发明的化合物的范围内。此外，本文所公开的化合物的所有互变异构体或顺反异构体也都包含在本发明的化合物的范围内。可通过本领域技术人员公知的传统技术(例如分级分离结晶、手性色谱拆分等)来分离本发明化合物的各种异构体。本发明还涵盖经同位素标记的本发明化合物，其中，一个或多个原子被具有相同原子序数但是原子量或质量数不同于在自然界中通常发现的原子量或质量数的原子替换。适于包括进本发明化合物的同位素的例子包括氢的同位素，例如2h和3h，碳的同位素，例如11c、13c和14c，氧的同位素，例如15o、17o和18o。例如，掺入了放射性同位素的本发明化合物，可用于药物的组织分布研究。放射性同位素氚(即3h)和碳-14(即14c)特别适用于该目的，因为它们易于掺入并且容易被检测。通常可通过本领域技术人员已知的传统技术，来制备经同位素标记的本发明化合物。附图说明图1为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a和连钱草皂苷b的提取分离的一个示例性实施方案的流程图。图2为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的紫外光谱图。图3为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的高分辨质谱图。图4为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的1h-nmr光谱图。图5为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的13c-nmr光谱图。图6为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的核磁共振hsqc光谱图。图7为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的核磁共振hmbc光谱图。图8为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的核磁共振1h-1hcosy光谱图。图9为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷a的核磁共振noesy光谱图。图10为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷b的紫外光谱图。图11为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷b的高分辨质谱图。图12为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷b的1h-nmr光谱图。图13为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷b的13c-nmr光谱图。图14为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷b的核磁共振hsqc光谱图。图15为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷b的核磁共振hmbc光谱图。图16为本发明的三萜苷化合物连钱草皂苷b的核磁共振noesy光谱图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。仪器和试剂岛津2010系列高效液相色谱仪(日本岛津公司)和aglienttechnologies1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，安捷伦1200型制备高效液相色谱仪，buchi中压制备液相色谱仪，uv-260紫外分光光度计(日本岛津公司)，perkin-elmer341旋光仪(美国perkinelmer有限公司)，watersacquityuplc/xevog2qtof质谱仪(美国waters有限公司)，varianunityinova600型超导核磁共振仪(美国varian有限公司)，eyelasb-1000旋转蒸发仪(日本eyela公司产品)，ry-ig型熔点测定仪(中国天津天光光学仪器有限公司)，c18反相填料为ymc生产，柱层析硅胶、薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产。乙腈为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。实施例1：连钱草中三萜苷类化合物连钱草皂苷a、b的提取和分离连钱草药材于2016年6月12日采自安徽省六安市霍山县，经江西省药品检验检测研究院万林春副主任中药师鉴定为唇形科植物活血丹glechomalongituba(nakai)kupr的全草。标本保留在江西省药品检验检测研究标本室(标本号jxsyjy2016012)三萜苷类化合物连钱草皂苷a、b的提取分离步骤依次如下：(1)乙醇加热回流提取：连钱草阴干后粉碎，经粉碎后的连钱草药材50.0kg，用75％用乙醇加热回流提取3次，过滤，得75％乙醇提取液；(2)浓缩75％乙醇提取液：将75％乙醇提取液(eyelasb-1000旋转蒸发仪(日本eyela公司产品))减压浓缩得乙醇浸膏10.0kg，在减压浓缩过程中回收乙醇；(3)萃取：把75％乙醇浸膏用蒸馏水溶解，再依次用用氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分别萃取3次，得正丁醇萃取液；(4)浓缩正丁醇萃取液：将正丁醇提取液(eyelasb-1000旋转蒸发仪(日本eyela公司产品))减压浓缩得正丁醇浸膏520g，在减压浓缩过程中回收正丁醇；(5)柱层析分离：将正丁醇浸膏用水溶解，转入大孔树脂柱，用乙醇-水洗脱液梯度洗脱，乙醇-水体积配比为0:100、30:70、50:50、70:30、100:0；收集乙醇-水(30:70)部位，(eyelasb-1000旋转蒸发仪(日本eyela公司产品))浓缩洗脱馏分与硅胶拌样，转入柱层析，硅胶粒度100～200目，用氯仿-甲醇洗脱液梯度洗脱，氯仿-甲醇体积配比为20:1、10:1、5:1、3:1、1:1；将洗脱液进行薄层检验，(eyelasb-1000旋转蒸发仪(日本eyela公司产品))浓缩合并在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点的洗脱馏分，得10个馏分，第8个馏分与c18拌样，转入c18反相柱层析(buchi中压制备液相色谱仪)，用甲醇-水洗脱液梯度洗脱，甲醇体积浓度为20％、30％、40％、50％、80％，，将洗脱液进行薄层检验，(eyelasb-1000旋转蒸发仪(日本eyela公司产品))浓缩合并在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点的洗脱馏分，得连钱草皂苷a、b粗品。(6)单体化合物的纯化：连钱草皂苷a、b粗品经(岛津2010系列高效液相色谱仪(日本岛津公司)或aglienttechnologies1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司))确定制备流动相的比例为乙腈-水(21:79，v/v)，以乙腈-水(21:79，v/v，7ml/min)为洗脱液，经(安捷伦1200型制备高效液相色谱仪)制备液相得本发明的连钱草皂苷a和连钱草皂苷b。实施例2：三萜苷类化合物连钱草皂苷a、b的结构鉴定鉴定得到两种新三萜苷类化合物，分子式均为c48h78o20，命名为连钱草皂苷a和连钱草皂苷b，其化学结构式分别为：表1为该两种新三萜苷化合物的核磁数据(varianunityinova600型超导核磁共振仪(美国varian有限公司))，：1h-nmr与13c-nmr在pyridine-d5中。表1：本发明的三萜苷类化合物连钱草皂苷a和连钱草皂苷b的核磁数据。recordedinpyridine-d5.连钱草皂苷a的结构鉴定与推导请参阅图2-9。连钱草皂苷a：白色粉末，溶于甲醇。经ry-ig型熔点测定仪(中国天津天光光学仪器有限公司)测定熔点为219-221℃，perkin-elmer341旋光仪(美国perkinelmer有限公司)测定[α]20d26.7(c0.045，meoh)；uv-260紫外分光光度计(日本岛津公司)测定uv(meoh)λmax(logε)：205.0(0.67)nm。通过watersacquityuplc/xevog2qtof质谱仪(美国waters有限公司)测定hresimsm/z973.5031[m–h]–，(calcdforc48h77o20，973.5008)。确定其分子式为c48h78o20。1hnmr谱高场区显示6个三萜类特征甲基单峰信号δh1.19，1.06，0.96，0.84，0.83和0.77(each3h，s)，高场区可见一个宽单峰乙烯基质子信号δh5.44(1h，brs)，2个连氧次甲基信号δh4.28(1h，m)和4.15(1h，m)，一个羟甲基信号3.83(1h，d，j＝10.8hz)，3.67(1h，d，j＝10.8hz)；以及3个糖上端基质子信号δh6.21(1h，d，j＝8.4hz)，5.70(1h，d，j＝7.8hz)，5.19(1h，d，j＝7.2hz)。13cnmr谱显示48个碳信号，除去糖的18个碳信号，剩余30个碳，同时13cnmr谱还给出2个烯碳信号δ122.6(c-12)、δ145.2(c-13)，表明该化合物为齐墩果烷-12-烯型五环三萜。在tof-ms谱图上，显示特征的碎片离子峰m/z:811.4482[m–h-162]–，为脱掉1个六碳糖(162)的碎片负离子峰；m/z:649.3965[m–h-162-162]–，为脱掉2个六碳糖(162)的碎片负离子峰；m/z:487.3434[m–h-162-162-162]–，为脱掉3个六碳糖(162)的碎片负离子峰。推测该化合物含有3个六碳糖基，该化合物用5％h2so4酸水解并将单糖分离，经与标准品进行tlc对照及比旋光度对比，证明所得到的3个糖均为d-葡萄糖，由其端基质子耦合常数分别为(j＝8.4hz)、(j＝7.8hz)和(j＝7.2hz)，判断其相对构型均为β构型。hmbc谱显示，glc1-1(δh6.21)与c-28(δ177.2)相关，glc2-1(δh5.70)与glc1-2(δ78.8)相关，glc3-1(δh5.19)与glc2-6(δ71.8)相关，表明葡萄糖1与三萜母核的c-28位相连，葡萄糖2与葡萄糖1的2位相连，葡萄糖3与葡萄糖2的6位相连。母核δh1.94、δh1.81(δc43.3)与δc17.7(c-25)、δc38.8、δc79.7、δc66.8和δc43.8相关，δh4.15(δc79.7)与δc18.2、δc42.2、δc66.8相关，δh0.77(δc18.2)与δc79.7、δc71.8、δc42.2、δc43.8相关，得知δc43.3为c-1，δc66.8为c-2，δc79.7为c-3，δc42.2为c-4，δc43.8为c-5，δc71.8为c-23。noesy谱显示h-2/h-24，h-2/h-25，h-3/h-24均分别有相关，说明2，3位羟基均为α构型，24位甲基为β构型。根据以上信息，可确定此新三萜苷为上述结构。连钱草皂苷b的结构鉴定与推导请参阅图10-16。连钱草皂苷b：白色粉末，溶于甲醇。经ry-ig型熔点测定仪(中国天津天光光学仪器有限公司)测定熔点为216-217℃，perkin-elmer341旋光仪(美国perkinelmer有限公司)测定[α]20d-54.5(c0.077，meoh)；uv-260紫外分光光度计(日本岛津公司)测定uv(meoh)λmax(logε)：205.5(0.90)nm。通过watersacquityuplc/xevog2qtof质谱仪(美国waters有限公司)测定hresimsm/z973.4966[m–h]–，(calcdforc48h77o20，973.5008)。确定其分子式为c48h78o20。1hnmr谱高场区显示6个三萜类特征甲基信号，其中2个分裂的甲基信号δh0.94(3h，d，j＝6.0hz)，0.83(3h，d，j＝6.0hz)和4个甲基单峰信号δh1.11，1.10，0.96和0.77(each3h，s)，高场区可见一个宽单峰乙烯基质子信号δh5.44(1h，brs)，2个连氧次甲基信号δh4.28(1h，m)和4.15(1h，m)，一个羟甲基信号3.84(1h，d，j＝10.8hz)，3.68(1h，d，j＝10.8hz)；以及3个糖上端基质子信号δh6.16(1h，d，j＝8.4hz)，5.64(1h，d，j＝7.8hz)，5.16(1h，d，j＝7.8hz)。13cnmr谱显示48个碳信号，除去糖的18个碳信号，剩余30个碳，同时13cnmr谱还给出2个烯碳信号δ126.1(c-12)、δ139.4(c-13)，表明该化合物为乌苏烷-12-烯型五环三萜。在tof-ms谱图上，显示特征的碎片离子峰m/z:811.4482[m–h-162]–，为脱掉1个六碳糖(162)的碎片负离子峰；m/z:649.3963[m–h-162-162]–，为脱掉2个六碳糖(162)的碎片负离子峰；m/z:487.3434[m–h-162-162-162]–，为脱掉3个六碳糖(162)的碎片负离子峰。推测该化合物含有3个六碳糖基，该化合物用5％h2so4酸水解并将单糖分离，经与标准品进行tlc对照及比旋光度对比，证明所得到的3个糖均为d-葡萄糖，由其端基质子耦合常数分别为(j＝8.4hz)、(j＝7.8hz)和(j＝7.8hz)，判断其相对构型均为β构型。hmbc谱显示，glc1-1(δh6.16)与c-28(δ176.9)相关，glc2-1(δh5.64)与glc1-2(δ79.3)相关，glc3-1(δh5.16)与glc2-6(δ71.8)相关，表明葡萄糖1与三萜母核的c-28位相连，葡萄糖2与葡萄糖1的2位相连，葡萄糖3与葡萄糖2的6位相连。母核δh1.93、δh1.80(δc43.3)与δc17.7(c-25)、δc38.8、δc79.7、δc66.8和δc43.8相关，δh4.15与δc18.2、δc42.2、δc71.8、δc66.8相关，δh0.77(δc18.2)与δc79.7、δc71.8、δc42.2、δc43.8相关，得知δc43.3为c-1，δc66.8为c-2，δc79.7为c-3，δc42.2为c-4，δc43.8为c-5，δc71.8为c-23。noesy谱显示h-2/h-24，h-2/h-25，h-3/h-24均分别有相关，说明2，3位羟基均为α构型，24位甲基为β构型。根据以上信息，可确定此新三萜苷为上述结构。实施例3：三萜苷类化合物连钱草皂苷a、b的体外抗肿瘤活性测试肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(试验孔测定值/对照孔测定值)×100％测试原理：mtt法：活细胞线粒体中存在着与napp(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶ⅱ)相关的脱氢酶，琥珀酸脱氢酶能使外源性黄色的噻唑蓝mtt(3-(4,5)-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，死细胞中此酶消失，mtt不被还原。用二甲亚砜(dmso)溶解甲瓒后可用酶标仪在570nm，630nm处检测吸光度，光密度值与活细胞数成正比。所用细胞株为：bgc-823(人胃癌细胞)、bel(人肝癌细胞)、hct-8(人结肠癌细胞)、a2780(人卵巢癌细胞)和a549(人肺癌细胞)(均购自atcc公司)。试验方法：mtt法：取对数生长细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×104细胞/ml，接种于96孔培养板中，每孔加入100μl细胞悬液，置于37℃/5％co2饱和湿度培养箱中培养24小时后，弃去原培养液。每一样品设计6个浓度梯度，然后在试验孔中加入100μl含有各浓度梯度的上述制备的化合物以及紫杉醇(阳性对照)的培养基，每一浓度平行6孔；对照组加入等体积溶剂。将96孔培养板置于37℃/5％co2饱和湿度培养箱中培养72小时后，每孔加入新鲜配置的含5mg/mlmtt的无血清培养基20μl，37℃下继续培养4小时后，去除上清液。每孔加入150μldmso溶解formazan沉淀，置微量震荡器上震荡5分钟使其充分溶解。在酶标仪上测定570nm，630nm处的吸光度，可反映活细胞数量。通过spss软件计算药物的抑制浓度(ic50)值。表2两种新化合物对bgc-823(人胃癌细胞)的抑制作用表3两种新化合物对bel(人肝癌细胞)的抑制作用样品浓度(μg/ml)抑制率(％)ic50(μg/ml)紫杉醇(阳性)1780.050.5800.1760.05420.01230.00112连钱草皂苷a100928.1715090258312.5606.25423.12311.56120.7810.392连钱草皂苷b1008210.935080257012.5626.25503.12201.56100.7810.391表4两种新化合物对hct-8(人结肠癌细胞)的抑制作用表5两种新化合物对a2780(人卵巢癌细胞)的抑制作用表6两种新化合物对a549(人肺癌细胞)的抑制作用结论：连钱草皂苷a、b对人bgc-823(人胃癌细胞)、bel(人肝癌细胞)、hct-8(人结肠癌细胞)、a2780(人卵巢癌细胞)和a549(人肺癌细胞)均有明显的抑制作用，可用作治疗或用于研究治疗癌症或肿瘤的药物。当前第1页12