与胰腺神经内分泌肿瘤相关的分子标记物及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤分子生物学
技术领域：
，具体涉及与胰腺神经内分泌肿瘤相关的分子标记物及其应用，具体地所述分子标记物为人源klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因。
背景技术：
：神经内分泌肿瘤(neuroendocrineneoplasms，nen)起源于多潜能神经内分泌干细胞，其具有神经内分泌标记物、能够产生生物活性胺和/或多肽激素，并具有显著异质性。过去30年间，nen患病率从1.09/10万上升至5.25/10万。相比其他肿瘤，nen的增加更为迅速，这可能与诊断技术进步、肿瘤筛查更加频繁，以及环境因素等有关。胰腺神经内分泌肿瘤(pancreaticneuroendocrinetumors，pnet)约占所有神经内分泌肿瘤的1/3，在胰腺肿瘤中所占百分率约为2％～5％。pnet尽管少见，但往往因有激素分泌而作用于全身多系统，严重影响病人的健康和生活质量，且较易发生肝转移，常因肝功能衰竭而死亡。随着影像学技术的进步，检出率亦呈现升高趋势。由于临床表现、病理特征、恶性程度及预后差异较大，目前临床上对pnet的认识尚不充分，易误诊和漏诊。对于各种pnet，2017版内分泌肿瘤who分类分为：①分化型pnet(胰腺神经内分泌肿瘤)，又分为g1、g2和g3三个级别；②未分化型pnec(胰腺神经内分泌癌)，又分为小细胞型和大细胞型，属于高度恶性；③混合型神经内分泌-非神经内分泌肿瘤。从临床表现方面看，pnet可分为功能性和非功能性两类，功能性可产生典型的临床症状，最常见的有胰岛素瘤和胃泌素瘤。非功能性近年明显升高，它们仅分泌多肽片段，较少或不分泌激素，不产生临床内分泌异常征象。功能性pnet因早期即可产生症状而获得及时治疗；非功能性者则常延误诊断，肿瘤常生长很大，产生局部侵袭或远处转移。目前pnet的治疗以外科手术为主，适用于肿瘤比较局限的患者，但预后差异较大。药物治疗可应用生长抑素类似物如奥曲肽和善的定，能部分缓解症状。分子靶向药物舒尼替尼已被批准用于pnet的治疗，但临床观察显示，舒尼替尼治疗pnet，在短暂获益后，肿瘤侵袭能力显著增强，更易发生转移。抗血管生成及抗生长因子的靶向药物治疗是新近尝试的治疗方法，但疗效有待确定。通过寻找pnet相关基因并研究它们在pnet组织或细胞中的表现，是探索进行基因治疗及相关药物治疗的方向。人klkb1(激肽释放酶b1)基因具有ncbi(genbank)基因id3818，其位于染色体4的nc_000004.12位置，klkb1的参考包括ncbi(genbank)参考序列转录变体1(nm_000892.5)及其编码的较长蛋白同种型1(np_000883.2)；ncbi(genbank)参考序列转录变体2(nm_001318394.1)及其编码的较短蛋白同种型2(np_001305323.1)；以及ncbi(genbank)参考序列转录变体3(nm_001318396.1)及其编码的较短蛋白同种型2(np_001305325.1)，与变体1相比，该变体3在5'utr中不同，其缺少5'编码区的一部分并在交替的起始密码子处启动翻译，其编码的同种型3更短并且相比同种型1具有不同的n-末端。klkb1基因编码参与血液凝固、纤维蛋白溶解、激肽产生和炎症的表面依赖性激活的糖蛋白。该编码的前原蛋白作为与高分子量激肽原的非共价复合物而存在于血浆中，经历由活化的凝血因子xii介导的蛋白水解加工，以产生由重链和轻链组成的经二硫键连接的异二聚体丝氨酸蛋白酶。该基因的某些突变导致前激肽释放酶缺乏。其选择性剪接导致编码不同同种型的多种转录物变体。人il13ra2(白细胞介素13受体亚基α2)基因具有ncbi(genbank)基因id3598，其位于x染色体的nc_000023.11位置，il13ra2的参考包括ncbi(genbank)参考序列转录体(nm_000640.3)及其编码的白细胞介素13受体亚基α2前体(np_000631.1)。由该基因编码的蛋白与il13ra1密切相关，il13ra1是白细胞介素13受体复合物的一个亚基。该蛋白质以高亲和力结合il13，但缺乏细胞质结构域，并且似乎不起信号介质的作用。据报道，它在il13的内化中发挥作用。人abcc8(atp结合盒亚家族c成员8)基因具有ncbi(genbank)基因id6833，其位于染色体11的nc_000011.10位置，abcc8的参考包括ncbi(genbank)参考序列转录变体1(nm_001287174.1)及其编码的较短蛋白同种型1(np_001274103.1)；ncbi(genbank)参考序列转录变体2(nm_000352.4)及其编码的较短蛋白同种型2(np_000343.2)；ncbi(genbank)参考序列转录变体3(nm_001351295.1)及其编码的最长蛋白同种型3(np_0013338224.1)；ncbi(genbank)参考序列转录变体4(nm_001351296.1)及其编码的较短蛋白同种型4(np_001338225.1)；以及ncbi(genbank)参考序列转录变体5(nm_001351297.1)及其编码的较短蛋白同种型5(np_001338226.1)。该基因编码的蛋白是atp结合盒(abc)转运蛋白超家族的成员。abc蛋白通过细胞外和细胞内膜运输各种分子。abc基因分为七个不同的亚家族(abc1、mdr/tap、mrp、ald、oabp、gcn20，白色)。该蛋白是mrp亚家族的成员，其参与多药抗性。该蛋白作为atp敏感性钾通道和胰岛素释放的调节剂起作用。已经在患有婴儿期高胰岛素血症低血糖症的患者中观察到该蛋白质的突变和缺陷，这是一种不受调节的高胰岛素分泌的常染色体隐性遗传疾病。突变也与非胰岛素依赖型ii型糖尿病有关，ii型糖尿病是胰岛素分泌缺陷的常染色体显性疾病。目前已经发现该基因的剪接转录物变体。人part1(前列腺雄激素调节的转录本1)基因具有ncbi(genbank)基因id25859，其位于染色体5的nc_000005.10位置，part1的参考包括ncbi(genbank)参考rna序列nr_024617.1、nr_028508.1和nr_028509.1。该基因由前列腺腺癌细胞中的雄性激素诱导。已描述了该基因的多个选择性转录物变体，预测其中没有一个变体编码蛋白产物。目前，关于klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因在胰腺神经内分泌肿瘤中的作用机制尚不清楚，其功能和表达变化的临床意义尚未有报道。因此，分析klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因与胰腺神经内分泌肿瘤发生发展的关系，探索针对klkb1、il13ra2、abcc8和part1途径的肿瘤治疗策略有利于改善针对胰腺神经内分泌肿瘤的检测和治疗。技术实现要素：为解决上述问题，本发明一个目的是提供胰腺神经内分泌肿瘤的分子标记物klkb1、il13ra2、abcc8和part1在制备胰腺神经内分泌肿瘤检测、预后或治疗产品中的应用，其中所述分子标记物为人源klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因，其中在ncbi数据库中klkb1的基因id:3818，il13ra2的基因id:3598，abcc8的基因id:6833，以及part1的基因id:25859。如本发明所用，术语klkb1、il13ra2和abcc8分别指klkb1、il13ra2和abcc8基因或蛋白、或其同源物、或具有其生物活性的变体形式。术语part1是指part1基因、或其同源物、或具有其生物活性的变体形式。本发明人利用icgc和ncbigeo来源的用于鉴定pannet中差异表达的基因(deg)，通过生物信息学方法预测到klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因有可能是pannet相关基因和潜在的生物标志物，从而确定针对klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因进行进一步的组织学和细胞学实验验证。本发明采用rt-pcr方法检测了klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因在人胰腺神经内分泌肿瘤组织或细胞和癌旁正常胰腺组织或细胞中的表达，并验证了klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因在胰腺神经内分泌肿瘤组织或细胞中表达上调。如本发明所用，术语“表达上调”是指所表达基因的序列量测量证明，相对于癌旁正常胰腺组织或细胞，所检测的患者胰腺神经内分泌肿瘤组织或细胞中测量的该基因表达量具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达增加，例如癌旁正常胰腺组织或细胞中该基因表达量为胰腺神经内分泌肿瘤组织中该基因表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或更低。本发明一个方面提供了胰腺神经内分泌肿瘤的分子标记物klkb1、il13ra2、abcc8和part1在制备用于胰腺神经内分泌肿瘤检测或预后的试剂盒中的应用。在本发明的一些实施方案中，所述检测或预后为根据所检测对象的生物样本中的klkb1、il13ra2、abcc8和part1表达水平来判断对象中胰腺神经内分泌肿瘤的疾病状况、进行疗效评估或转移复发监控，优选所述生物学样本为胰腺神经内分泌肿瘤组织或细胞。本发明另一个方面提供了用于胰腺神经内分泌肿瘤检测或预后的试剂盒，其包含特异性扩增人klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1基因的引物对，其中扩增klkb1基因的正向引物为如seqidno.1所示的序列，反向引物为如seqidno.2所示的序列；扩增il13ra2基因的正向引物为如seqidno.3所示的序列，反向引物为如seqidno.4所示的序列；扩增abcc8基因的正向引物为如seqidno.5所示的序列，反向引物为如seqidno.6所示的序列；以及扩增part1基因的正向引物为如seqidno.7所示的序列，反向引物为如seqidno.8所示的序列；另外，用于扩增内参gapdh的引物对为如seqidno.9所示的正向引物和如seqidno.10所示的反向引物。进一步地，所述试剂盒还包括rna提取试剂、反转录试剂，以及pcr反应常用试剂如逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、depc水和taq酶等，还可以含有标准品和/或对照品。本发明又一个方面提供了klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂在制备预防或治疗胰腺神经内分泌肿瘤的药物组合物中的应用，其中所述klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂为能降低klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1表达量的sirna、dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸；或者能表达或形成所述sirna、dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸的构建物。在本发明上述应用的一些实施方案中，所述klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂为sirna或shrna。在本发明上述应用的一些实施方案中，所述药物组合物包括有效量的klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂和药学上可接受的载体，进一步地所述药物组合物还包括预防或治疗胰腺神经内分泌肿瘤的其他药剂。如本文所用，所述“有效量”是指可对哺乳动物(优选人)产生功能或活性的且可被哺乳动物(优选人)所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂；所述载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。所述合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。所述药物组合物中的药学上可接受的载体可含有液体如水、盐水、缓冲液，并且还可能存在辅助性物质如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。所述载体中还可以含有细胞(如宿主细胞)转染试剂。本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂、或其编码基因、或其药物组合物施用于患者如哺乳动物，优选人。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。也可选择采用基因治疗的手段进行胰腺神经内分泌肿瘤的治疗，如直接将klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂通过诸如注射等方法施用于患者；或者，可通过一定的途径将携带klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂的表达单位如表达载体或病毒等递送到靶点上，并使之表达具有活性的klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂，具体情况需视所述的药剂类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种促进klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的药物组合物中的化疗剂，包括但不限于：dna-烷化剂、抗肿瘤抗生素剂、抗代谢剂、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、激素拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、hmg-coa抑制剂、cdk抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三链螺旋dna、核酸适体和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。在本发明中，“预后”是指癌症患者在通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。预后可以是通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理抑制或缓解胰腺神经内分泌肿瘤生长后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检测标志物来评估，所述标志物为一个或多个基因。预后评估可以这样进行：根据标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是否良好，或者确定良好预后或不良预后的概率。本发明的药物组合物还可与其他治疗胰腺神经内分泌肿瘤的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要活性成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。有益效果：本发明人发现分子标记物klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1在患者的胰腺神经内分泌肿瘤组织或细胞中相对于在癌旁正常胰腺组织或细胞中表达明显上调，因此可以将klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1用作胰腺神经内分泌肿瘤辅助诊断和预后的标志物，以及制备用于胰腺神经内分泌肿瘤检测和/或治疗的产品。本发明提供的用于检测胰腺神经内分泌肿瘤的试剂盒，可以用于胰腺神经内分泌肿瘤的辅助诊断和预后评估；另外，还可将klkb1、il13ra2、abcc8和/或part1抑制剂用来制备预防或治疗胰腺神经内分泌肿瘤的药物组合物以用于胰腺神经内分泌肿瘤的基因治疗、药物治疗等临床应用。附图说明图1显示klkb1(图a)、il13ra2(图b)和abcc8(图c)的mrna，以及part1(图d)的lncrna在患者胰腺神经内分泌肿瘤组织(patients)和癌旁正常胰腺组织(normal)中的相对表达量比较，其中相对于患者的癌旁正常胰腺组织，klkb1(图a)、il13ra2(图b)和abcc8(图c)的mrna，以及part1(图d)的lncrna在患者胰腺神经内分泌肿瘤组织中的表达水平明显上调；注：在7例作为阴性对照的癌旁正常胰腺组织(normal)样本和16例患者胰腺神经内分泌肿瘤组织(patients)样本中，因个别样本之间差别较大，因此在每个基因的表达情况中都有几例样本被剔除，以图中的实际点数为最终纳入的各组样本例数，每个小点代表一例样本。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1本实施例证明，klkb1、il13ra2、abcc8和part1基因在胰腺神经内分泌肿瘤组织或细胞(patients)样本中的表达明显高于其在患者的癌旁正常胰腺组织或细胞(normal)样本中的表达。1、取样从中国医学科学院北京协和医院病理科获取石蜡样本23例，其中胰腺神经内分泌肿瘤患者癌旁正常胰腺组织(即，肿瘤周围的正常胰腺组织，其包含胰腺神经内分泌组织；作为阴性对照)样本7例，患者胰腺神经内分泌肿瘤组织样本16例。将石蜡组织切片，暴露于空气中的前部分弃去，切片厚度为10μm左右，每4个蜡卷放入一个1.5ml离心管中，每例样本6管并做好标记。如短时间内不进行rna提取，可加入rnalater试剂并将样本放于4℃短期保存。2、对组织样本进行总rna提取1)水浴锅需提前打开升温至56℃；2)每例样本准备3管待提，每管加入300μl脱蜡溶液，涡旋，将样品送至管底；3)56℃孵育3min，然后在室温下冷却；4)加入200μlbufferpkd，并通过涡旋混合；5)以10000rpm离心1min；6)将10μl蛋白酶k加入较低的澄清相中，通过颠倒混匀轻轻混合；7)在56℃孵育15min，然后在80℃孵育15min；8)将较低的未着色相转移到新的1.5ml离心管中；9)在冰上孵育3min，以13500rpm离心15min；10)将上清液转移到新的1.5ml离心管中，不要吸到沉淀和上层白膜；11)加入相当于总样品1/10的dnaseboosterbuffer(体积约为10μl)和5μldnasei储备液，通过倒置管混合，短暂离心收集来自管侧面的残余液体；12)在室温下孵育15min；13)孵育完毕后将3管合并为1管，加入600μlbufferrbc来调节结合条件，并彻底混合裂解液；14)向样品中加入1400μl乙醇(100％)，并通过移液器混合后立即进行下一步；15)将700μl样品转移到2ml收集管的rneasyminelute离心柱中，轻轻盖上盖子，以10000rpm离心10s，丢弃流动相；16)重复步骤15)直到整个样本通过rneasyminelute离心柱；17)向rneasyminelute离心柱中加入500μlbufferrpe，以10000rpm离心10s，丢弃流动相；18)向rneasyminelute离心柱中加入500μlbufferrpe，以10000rpm离心2min，以洗涤离心柱膜，丢弃收集管与流动相；19)将rneasyminelute离心柱放入新的2ml收集管中，全速离心5min；20)将rneasyminelute离心柱放入新的1.5ml收集管中，将10～14μl不含rnase的水直接加入离心柱膜，10000rpm离心5s以洗脱rna。3、rna浓度与纯度的测定1)rna浓度的测定：取rna样品1～2μl，用分光光度计genovanano-53820对rna在260nm下的吸光度进行定量；2)rna纯度的测定：用分光光度计genovanano-53820对rna在260nm和280nm下的吸光度a260和a280进行定量，记录od260/od280，所有样本的比值要求在1.8＜od260/od280＜2.1，低于此值表明其含有蛋白质杂质。4、逆转录合成cdna以总rna为模板，mrna使用转录物cdna第一链合成(transcriptfirst-strandcdnasynthesis)supermix反转录试剂盒进行cdna的合成；mirna使用转录物逆转录酶(transcriptreversetranscriptase)和核糖核酸酶抑制剂(ribonucleaseinhibitor)反转录试剂盒进行cdna的合成。取0.2mldepc处理的pcr管，在pcr管中配置下表中的反转录反应液，步骤在冰浴中进行。加完各种试剂后，轻轻混匀，然后稍微离心，以使反应液聚集在pcr管底部。然后放到pcr仪上进行反转录反应。反应结束后，产物贮于－20℃备用。mrna(或lncrna)常规rt-pcr实验流程：a.合成第一条cdna链1)使用微量ep管，依次加入以下体系(20μl)总rna(50ng～5μg)xμl(x≤8)随机引物(n9)(0.1μg/μl)1μl2xtsreactionmix10μlrt/rienzymemix1μl无rnase水8-xμl2)轻轻混匀，将混匀后的体系放入pcr仪中，扩增反应在生工公司的pcr仪上进行pcr反应，反应参数为：25℃10min；42℃15min；(80℃2min；4℃15min)×2个循环；4℃∞。3)得到rna逆转产物cdna溶液放于-20℃短期保藏。5、荧光定量pcr1)引物的设计与合成从ncbi获得目的基因klkb1(基因id:3818)、il13ra2(基因id:3598)和abcc8(基因id:6833)的mrna，以及part1(基因id:25859)的lncrna全长序列，内参选gapdh，利用酵母属(saccharomyces)基因组数据库设计引物序列。经过blast分析，引物序列具有特异性。所用的引物如以下表1所示。引物均委托生工(sangonbiotech)生物工程(上海)股份有限公司合成。引物的设计通常遵循如下原则：a.引物与模板的序列要严格互补；b.引物与引物之间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构；c.引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应(即错配)；d.引物长度通常在18～25bp，tm值在55～65℃，gc含量在40％～60％，产物大小在100～375bp之间；e.引物的3’端避免出现三个以上连续相同的碱基；f.为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。表1：引物序列2)荧光定量pcr操作过程如下：在0.2mlpcr管内，按表2依次加入1μl反转录(rt)产物，各基因正向引物与反向引物各0.5μl，10μlpcr反应mix，用ddh2o水补足体积至20μl。混匀后立即置pcr仪中按下列程序反应，反应结束后，样品保存于-20℃备用。表2：rt-pcr反应体系组成加入量(μl)cdna1正向引物(20μm)0.5反向引物(20μm)0.52×mix10ddh2o8总体积20注：所有rt-pcr的扩增体系都是一样的。pcr循环参数：48℃预变性30min；95℃变性10min；(95℃变性15sec，60℃退火+延伸1sec)×40个循环；熔解阶段。3)熔解曲线制备在7500fast荧光定量pcr仪上选定溶解曲线程序。在爬坡过程中连续收集样品的荧光信号以获取熔解曲线，熔解曲线通过定量pcr仪自带的分析软件获取，程序结束后进行分析。实验结果显示，实时定量pcr扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬存在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qrt-pcr的相对定量公式：2-δδct×100％，比较基因在患者胰腺神经内分泌肿瘤组织和癌旁正常胰腺组织中的表达水平。结果显示：qrt-pcr扩增结果稳定，如图1所示，klkb1基因、il13ra2基因和abcc8基因的mrna，以及part1基因的lncrna在患者胰腺神经内分泌肿瘤组织(patients)中的相对表达量明显高于其在癌旁正常胰腺组织(normal)中的相对表达量，并且该差异具有统计学意义(p<0.05)；这表明klkb1、il13ra2基因和abcc8基因，以及part1基因在患者的胰腺神经内分泌肿瘤组织中表达上调。实施例2胰腺神经内分泌肿瘤检测或预后评估试剂盒基于实施例1中表1的引物组，组装本发明所述的用于检测胰腺神经内分泌肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增人klkb1基因的正向引物如seqidno.1所示的序列，反向引物如seqidno.2所示的序列；特异性扩增人il13ra2基因的正向引物如seqidno.3所示的序列，反向引物如seqidno.4所示的序列；特异性扩增人abcc8基因的正向引物如seqidno.5所示的序列，反向引物如seqidno.6所示的序列；以及特异性扩增人part1基因的正向引物如seqidno.7所示的序列，反向引物如seqidno.8所示的序列；以及特异性扩增管家基因(gapdh)的引物对(seqidno:9的正向引物和seqidno:10所示的反向引物)；还包括sybrgreen聚合酶链式反应体系，如pcr缓冲液、sybrgreen荧光染料、dntps。所述pcr缓冲液的成分为25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4；还包括正常胰腺组织cdna：作为阴性对照与待检测样本cdna共同定量pcr检测，每个反应体系使用与检测样本cdna相同量。优选pcr反应体系如表3所示：表3pcr反应体系组分加入量(μl)sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5正向引物(20μm)0.5反向引物(20μm)0.5模板cdna2.0加入灭菌蒸馏水至25最佳反应条件为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国医学科学院北京协和医院<120>与胰腺神经内分泌肿瘤相关的分子标记物及其应用<130>p190138<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgcgttctcagatgtggatgttg23<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgaggagtagaggaacttggtgtg24<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aacctggcataggtgtacttcttg24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cacactgtaatgcatgatccaagc24<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5caggatgaggaagaggaggaagag24<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggcggaggacaggtacttgg20<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7catccaaggccgtgtcagaactc23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gctaagtgattggctggctctgg23<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gaacgggaagctcactgg18<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gcctgcttcaccaccttct19当前第1页12