一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖及其制备方法及基因载体与流程

本发明涉及基因载体
技术领域：
，特别涉及一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖及其制备方法及基因载体。
背景技术：
：裸露的外源基因dna难以进入细胞且容易被机体或细胞降解，因而难以表达，所以应寻找对病变组织具有选择性、高转染率及低毒性的载体协助目的基因进入靶细胞，用于转运目的基因进入靶细胞的载体即为基因载体，选择合适的基因载体是基因治疗的成功关键。基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两类。聚乙烯亚胺是目前最具代表性的高效基因载体之一，但其存在生物兼容性差、细胞毒性较高的缺点，尚需改进。技术实现要素：本发明的主要目的是提出一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖及其制备方法及基因载体，旨在制备一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖，具有较低的细胞毒性和良好的生物兼容性，可以作为一种优质的基因载体应用。为实现上述目的，本发明提出一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖，所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖具有以下结构式(1)所示结构。结构式(1)：为实现上述目的，本发明还提出了一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法，所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法包括以下步骤：向米糠多糖的水溶液中加入高碘酸钾，避光搅拌形成反应液后，对所述反应液进行透析，得透析液；将聚乙烯亚胺溶于缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液；将所述透析液加入到所述聚乙烯亚胺溶液中搅拌反应形成反应溶液，并在搅拌过程中控制反应溶液呈碱性；将硼氢化钠加入到所述反应溶液中，搅拌反应形成初样液；对所述初样液进行透析，取透过液醇沉、离心、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。优选地，所述向米糠多糖的水溶液中加入高碘酸钾，避光搅拌形成反应液后，对所述反应液进行透析，得透析液的步骤中，所述避光搅拌时间为24～48h；和/或，所述透析的时间为36～48h。优选地，所述将聚乙烯亚胺溶于缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液的步骤中，所述缓冲液为ph9.0磷酸盐缓冲液。优选地，将所述透析液加入到所述聚乙烯亚胺溶液中搅拌反应形成反应溶液，并在搅拌过程中控制反应溶液呈碱性的步骤包括：将所述透析液滴加到所述聚乙烯亚胺溶液中搅拌反应30～36h形成反应溶液，并在滴加过程中，向所述反应溶液中滴加氢氧化钠溶液以控制所述反应溶液的ph值在8.8～9.2范围内；其中，所述将所述透析液滴加到所述聚乙烯亚胺溶液中的时间不大于1h。优选地，米糠多糖、高碘酸钾、聚乙烯亚胺和硼氢化钠的质量比为1：(1.5～2.0):(2.5～4.0)：(1.5～4)。优选地，所述将硼氢化钠加入到所述反应溶液中，搅拌反应形成初样液的步骤，包括：将硼氢化钠加入到所述反应溶液中，搅拌反应40～48h形成第一混合液；将硼氢化钠加入到所述第一混合液中，搅拌反应22～24h形成初样液。优选地，所述将硼氢化钠加入到所述反应溶液中的步骤中的硼氢化钠的加入量与米糠多糖加入量的质量比为(1～1.5)：1；和/或，所述将硼氢化钠加入到所述第一混合液中的步骤中的硼氢化钠的加入量与米糠多糖加入量的质量比为(0.5～2.5)：1。优选地，所述对所述初样液进行透析，取透过液醇沉、离心、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的步骤中，所述透析时，使用的透析袋的截留分子量为3000～3200；和/或，所述透析时间为24～48h；和/或，所述醇沉时间为48～50h。此外，本发明还提出了一种基因载体，所述基因载体包括上述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。本发明技术方案中，通过以聚乙烯亚胺对米糠多糖进行阳离子改性制得一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖，可以凝聚dna并通过细胞膜的内吞作用进入细胞内后释放，因此，可以用作基因载体。由于米糠多糖在我国资源丰富，来源广泛，且具有良好的生物相容性、可生物降解性，因此以米糠多糖为底物接枝聚乙烯亚胺，可以降低细胞毒性，提高生物相容性，进而提高以聚乙烯亚胺接枝米糠多糖为原料的基因载体的品质。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明提供的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法的一实施例的流程示意图；图2为实施例1～6制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖凝聚dna后的产物的凝胶电泳图；图3为实施例1～6制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖生物相容性检测的荧光显微镜照片。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。聚乙烯亚胺是目前最具代表性的高效基因载体之一，但其存在生物兼容性差、细胞毒性较高的缺点，尚需改进。鉴于此，本发明提出一种基因载体，所述基因载体包括聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。同时，本发明还提出了上述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖，所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖具有下述结构式(1)的结构：其中，x，y，n均为整数，应当理解，上述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖为具有上述结构式结构的聚合物，凡具有上述结构式结构的化合物均在本发明的保护范围内。我国稻谷产量极为丰富，在稻谷的颖果皮层里存在一种米糠多糖，具有良好的生物相容性和可生物降解性，且能够有效压缩dna并将其转染至细胞内，但由于米糠多糖不含有阳离子基团，米糠多糖凝聚dna的效果不佳；聚乙烯亚胺的结构上含有大量氨基，即携带大量正电荷，可以加强聚乙烯亚胺与带负电荷的dna的结合，使二者形成稳定的纳米复合物，且能够通过细胞膜的内吞作用进入细胞内，同时在细胞内通过质子海绵效应释放dna，达到转运dna的目的，但聚乙烯亚胺生物兼容性差且具有较高的细胞毒性。在米糠多糖的结构中接枝聚乙烯亚胺，不仅可以使产物富有正电荷，从而可以稳定凝聚dna、转运基因，提高转染效率，而且具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性，是一种优质的基因载体的材料，也就是说，可以将聚乙烯亚胺接枝米糠多糖作为一种基因载体使用，也可以以聚乙烯亚胺接枝米糠多糖为核，添加其它原辅料(例如聚乙二醇、粘多糖、聚谷氨酸等)构建包覆外壳，制成基因载体。上述基因载体具有原料来源广泛、价格低廉、转染效率高、生物相容性好、细胞毒性低的优点。此外，本发明还提出了一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法，结合图1所示的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法的一实施例的流程示意图，所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法包括以下步骤：步骤s10、向米糠多糖的水溶液中加入高碘酸钾，避光搅拌形成反应液后，对所述反应液进行透析，得透析液。步骤s20、将聚乙烯亚胺溶于缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液。步骤s30、将所述透析液加入到所述聚乙烯亚胺溶液中搅拌反应形成反应溶液，并在搅拌过程中控制反应溶液呈碱性。步骤s40、将硼氢化钠加入到所述反应溶液中，搅拌反应形成初样液。其中，米糠多糖、高碘酸钾、聚乙烯亚胺和硼氢化钠的质量比为1：(1.5～2.0):(2.5～4.0)：(1.5～4)。步骤s10中，所述避光搅拌时间为24～48h，所述透析的时间为36～48h；步骤s20中，所述缓冲液为ph9.0磷酸盐缓冲液。在上述步骤中，高碘酸钾溶于水时具有强氧化性，可以氧化米糠多糖，得到含醛基的米糠多糖，缓冲液可以为反应体系提供稳定的酸碱环境，便于聚乙烯亚胺顺利接枝到氧化处理过的米糠多糖结构上，硼氢化钠为还原剂，用以对接枝产物进行还原处理，以形成聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。为保证反应正向、充分进行，高碘酸钾以及硼氢化钠应该超过参与氧化或还原反应的理论重量，故在本实施例中，米糠多糖、高碘酸钾、聚乙烯亚胺和硼氢化钠的质量比优选为1：(1.5～2.0):(2.5～4.0)：(1.5～4)。过量的高碘酸钾及硼氢化钠在反应结束后清理掉，在步骤s10中，对所述反应液进行透析，即是为了清除掉高碘酸钾。同时，步骤s20和s30中，上述接枝反应的适宜ph为9.0，故在本实施例中，溶解聚乙烯亚胺的溶剂优选为ph9.0的磷酸盐缓冲液，且在接枝反应过程中，控制反应溶液呈碱性，在具体实施时，步骤s30可以包括：将所述透析液滴加到所述聚乙烯亚胺溶液中搅拌反应30～36h形成反应溶液，并在滴加过程中，向所述反应溶液中滴加氢氧化钠溶液以控制所述反应溶液的ph值在8.8～9.2范围内；其中，所述将所述透析液滴加到所述聚乙烯亚胺溶液中的时间不大于1h。这是因为，聚乙烯亚胺与透析液接触后，聚乙烯亚胺会迅速包裹在米糠多糖结构表面，如果一次性加入量较多，会导致里面的部分米糠多糖无法参与反应，进而使合成产率降低，且透析液单次加入量过大会致使聚乙烯亚胺溶液的ph降低，因此，在本实施例中，选用滴加的方式以促进反应顺利进行，提高产率。同时，为提高生产效率，滴加速度不宜过慢，因此，将所述透析液滴加到所述聚乙烯亚胺溶液中的时间优选为不超过1h。进一步地，步骤s40中，为使还原反应进行充分，在具体实施时，还原剂的加入步骤可以包括：步骤s410、将硼氢化钠加入到所述反应溶液中，搅拌反应40～48h形成第一混合液；步骤s420、将硼氢化钠加入到所述第一混合液中，搅拌反应22～24h形成初样液。即将硼氢化钠分成两次加入以确保还原反应进行充分。其中，步骤s410中使用的硼氢化钠加入量与米糠多糖加入量的质量比优选为(1～1.5)：1；步骤s420中使用的硼氢化钠加入量与米糠多糖加入量的质量比优选为(0.5～2.5)：1。步骤s50、对所述初样液进行透析，取透过液醇沉、离心、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。其中，所述透析时，使用的透析袋的截留分子量为3000～3200；透析时间为24～48h；醇沉时间为48～50h。由于初样液中除聚乙烯亚胺接枝米糠多糖外还含有过量的硼氢化钠等杂质成分，因此，需要进行纯化，本实施例中，优选为透析，透析时，使用的透析袋的截留分子量优选为3000～3200；透析时间优选为24～48h。透析后，经过醇沉处理，可以使不溶于有机醇的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖沉淀分离，在具体实施时，选用的有机醇可以为无水乙醇，醇沉时间优选为48～50h。且为了进一步分离彻底，可以对醇沉沉淀进行离心，离心时，转速可以为8000～10000r/min，离心时间为5～10min，离心次数可以为一次或者多次，且为了更进一步地将附着在沉淀表面的杂质洗涤干净，可以在相邻两次离心之间，用无水乙醇洗涤沉淀。以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1将1g米糠多糖加入到装有10ml去离子水的圆底烧瓶中，边搅拌边加入1.5g高碘酸钾，避光搅拌24h后将反应液装入透析袋中透析48h，得透析液。将30g聚乙烯亚胺溶于100ml的ph9.0磷酸盐缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液。向透析液中滴加10ml上述聚乙烯亚胺溶液，并于1h内滴加完毕，然后室温搅拌34h，形成反应溶液。将1g硼氢化钠加入到上述反应溶液中，搅拌40h形成第一混合液。再次将2.5g硼氢化钠加入到上述第一混合液中，继续搅拌23h，形成初样液。将初样液置于截留分子量为3000的透析袋中透析48h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉48h后，经离心、冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。实施例2将1g米糠多糖加入到装有10ml去离子水的圆底烧瓶中，边搅拌边加入1.6g高碘酸钾，避光搅拌30h后将反应液装入透析袋中透析40h，得透析液。将25g聚乙烯亚胺溶于100ml的ph9.0磷酸盐缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液。向透析液中滴加10ml上述聚乙烯亚胺溶液，并于1h内滴加完毕，然后室温搅拌31h，形成反应溶液。将1.1g硼氢化钠加入到上述反应溶液中，搅拌42h形成第一混合液。再次将2g硼氢化钠加入到上述第一混合液中，继续搅拌24h，形成初样液。将初样液置于截留分子量为3200的透析袋中透析36h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉50h后，经离心、冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。实施例3将1g米糠多糖加入到装有10ml去离子水的圆底烧瓶中，边搅拌边加入1.7g高碘酸钾，避光搅拌35h后将反应液装入透析袋中透析37h，得透析液。将26g聚乙烯亚胺溶于100ml的ph9.0磷酸盐缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液。向透析液中滴加10ml上述聚乙烯亚胺溶液，并于1h内滴加完毕，然后室温搅拌32h，形成反应溶液。将1.2g硼氢化钠加入到上述反应溶液中，搅拌48h形成第一混合液。再次将1g硼氢化钠加入到上述第一混合液中，继续搅拌22h，形成初样液。将初样液置于截留分子量为3100的透析袋中透析24h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉49h后，经离心、冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。实施例4将1g米糠多糖加入到装有10ml去离子水的圆底烧瓶中，边搅拌边加入1.8g高碘酸钾，避光搅拌40h后将反应液装入透析袋中透析45h，得透析液。将40g聚乙烯亚胺溶于100ml的ph9.0磷酸盐缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液。向透析液中滴加10ml上述聚乙烯亚胺溶液，并于1h内滴加完毕，然后室温搅拌36h，形成反应溶液。将1.3g硼氢化钠加入到上述反应溶液中，搅拌46h形成第一混合液。再次将1.5g硼氢化钠加入到上述第一混合液中，继续搅拌22.5h，形成初样液。将初样液置于截留分子量为3000的透析袋中透析30h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉48h后，经离心、冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。实施例5将1g米糠多糖加入到装有10ml去离子水的圆底烧瓶中，边搅拌边加入1.9g高碘酸钾，避光搅拌45h后将反应液装入透析袋中透析36h，得透析液。将28g聚乙烯亚胺溶于100ml的ph9.0磷酸盐缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液。向透析液中滴加10ml上述聚乙烯亚胺溶液，并于1h内滴加完毕，然后室温搅拌35h，形成反应溶液。将1.4g硼氢化钠加入到上述反应溶液中，搅拌45h形成第一混合液。再次将0.8g硼氢化钠加入到上述第一混合液中，继续搅拌23.5h，形成初样液。将初样液置于截留分子量为3000的透析袋中透析40h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉50h后，经离心、冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。实施例6将1g米糠多糖加入到装有10ml去离子水的圆底烧瓶中，边搅拌边加入2.0g高碘酸钾，避光搅拌48h后将反应液装入透析袋中透析42h，得透析液。将35g聚乙烯亚胺溶于100ml的ph9.0磷酸盐缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液。向透析液中滴加10ml上述聚乙烯亚胺溶液，并于1h内滴加完毕，然后室温搅拌33h，形成反应溶液。将1.5g硼氢化钠加入到上述反应溶液中，搅拌44h形成第一混合液。再次将0.5g硼氢化钠加入到上述第一混合液中，继续搅拌24h，形成初样液。将初样液置于截留分子量为3200的透析袋中透析45h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉49h后，经离心、冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。对实施例1～6制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖进行检测，检测项目包括：dna凝聚及释放效果检测；生物相容性检测；以及，细胞毒性检测。具体检测过程及结果如下：(一)dna凝聚效果检测取实施例1～6制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖各0.005g，溶于1ml水中，作为样品溶液。将样品溶液和质粒dna按不同的质量比混合(样品溶液与质粒dna的质量比分别为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1和3:1)，混合反应30min，反应结束后加入上样缓冲液，形成点样溶液。取点样溶液进行琼脂糖凝胶电泳，其中凝胶为1％琼脂糖凝胶，电泳仪的电压为90v，电流为80ma。同时设置裸dna对照。电泳完成后在凝胶成像仪中观察并拍照，其凝胶电泳图如图2所示，图中，标记为0的加样孔对应裸dna对照，标记为1、2、3、4、5、6依次对应样品溶液与质粒dna的质量比分别为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1和3:1的点样溶液。从图2可知，实施例1～6对应的各组点样溶液中，随着点样溶液中样品溶液的浓度增大，凝胶孔中滞留效果越明显，这说明聚乙烯亚胺接枝米糠多糖带正电，当增大其浓度时，则与带负电的dna结合并将dna滞留在凝胶孔中。从图2中可显示出聚乙烯亚胺接枝米糠多糖均顺利与dna凝聚。(二)生物相容性检测从-80℃冰箱中取出冻存的hela细胞，待细胞复苏长好后，分别将实施例1～6制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖经过紫外杀菌处理后放入培养24h；随后对细胞用dapi进行染色，利用荧光显微镜观察hela细胞在材料表面生长的情况，并记录荧光显微镜照片如图3所示。从图3可知，各实施例制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖表面均附着了一定数量的hela细胞，且不呈现显著减少现象，说明聚乙烯亚胺接枝米糠多糖具有良好的细胞相容性和低毒性。(三)细胞毒性检测采用噻唑蓝(mtt)法测定同一浓度下实施例1～6中制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖对hela细胞存活率的影响。hela细胞在96孔板中的铺板密度为1x104/孔，置于37℃、5％co2条件下培养24h，待细胞生长达到70-80％汇合度时，分别向各孔中加入浓度为0.5mg/ml的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖溶液10μl，相同条件下刺激细胞24h后，吸走培养液后每孔加入100μl5mg/ml的mtt溶液，相同条件下继续放置4h后，吸去细胞培养液，各孔中加入100μl二甲基亚砜溶解细胞生成的晶体，用酶标仪测定570nm处的吸光度值a1。以未加样品孔的细胞存活率为100％，吸光度值为a0。细胞存活率按公式1计算，结果如表1所示。公式1：细胞存活率(％)＝a1/a0×100表1实施例1～6中制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的细胞毒性hela细胞存活率(％)实施例195.6实施例297.7实施例396.2实施例496.8实施例598.0实施例697.8由表1可以看出，各实施例制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖浓度为0.05mg/ml时，hela细胞的细胞存活率均为95％以上，说明通过此方法制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的细胞毒性很低，非常利于聚乙烯亚胺接枝米糠多糖运载基因进入细胞。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12