羊种布鲁菌16MLPS的制备方法及其单克隆抗体的筛选鉴定方法和应用与流程

本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种羊种布鲁菌16mlps的制备方法及其单克隆抗体的筛选鉴定方法和应用。

背景技术：

布鲁氏菌病(brucellosis)也称为“马耳他热”，目前在世界范围内流行较广、危害较大。它是一种由革兰氏阴性菌布鲁菌(brucella)侵入机体后引发的变态反应性传染性人畜共患病，简称布病。布病的传播途径较广，且感染后不易治愈，在《中华人民共和国传染病防治法》中被列为乙类传染病。

布鲁菌可以在巨噬细胞中存活并繁殖，从而引起动物流产以及人类波状热、关节痛、不孕不育等临床症状。布鲁菌是一种球杆状的革兰氏阴性胞内寄生菌，没有鞭毛，不形成芽孢或荚膜，属于需氧兼性厌氧菌。lps位于布鲁菌外膜的外侧，从内到外依次由类脂a、核心寡聚糖和o链三部分组成，根据lps是否含有o链，分为含有o链的光滑型和缺少o链的粗糙型。布鲁菌在体内体外的增殖和生存能力会因lps的缺失而造成严重影响，即布鲁菌入侵机体时主要针对lps触发强烈的免疫反应。因此，lps是布鲁菌重要的毒力因子，也是布鲁菌病重要的诊断抗原。

近几年来，我国动物布病和人布病的发病率呈逐年上涨趋势，是我国发病数增加最快的疾病之一，严重影响公共卫生安全及畜牧业经济发展。因此，布病的早期鉴别和诊断对布病的净化具有重要意义。目前针对布病的免疫学检测方法主要有虎红平板凝集，试管凝集试验，全乳环状试验，补体结合试验，酶联免疫吸附试验，胶体金免疫层析技术，免疫偏振技术r等，这些检测方法为临床布病诊断提供了方便，但是因特异性和敏感性等问题仍需要进一步改进和提高。研制优良的诊断产品首要考虑的是诊断抗原的选择，目前布鲁菌检测的诊断抗原多数是全菌灭活产物和表面特异性抗原，然而全菌灭活产物做抗原容易与其他革兰氏阴性菌出现交叉免疫进而影响诊断的特异性，表面抗原蛋白会因为在细菌内表达时机和表达浓度的高低影响检测的灵敏度，鉴于lps是布鲁菌重要的抗原和毒力因子，在布鲁菌体液免疫反应中发挥重要作用，也是动物血清中最容易检测到的抗体物质，在一些诊断方法中得到了良好应用。同时布鲁菌lps又与其他革兰氏阴性菌lps结构存在着明显差异，可以避免交叉免疫的问题，结合本实验室对多种抗原物质的对比分析，发现布鲁菌的lps是目前最适合建立布鲁菌快速诊断产品的候选抗原物质。然而，先前布鲁菌lps的提取纯化过程却十分复杂，不适合工业化生产，以及其有效单克隆抗体的筛选也不够敏感特异，为此给lps的应用带来了阻碍。因此，为了建立更适合临床检测应用的布病抗原和抗体诊断方法，需要对布鲁菌lps的提取工艺和lps单克隆抗体的制备进行深入研究。

技术实现要素：

为建立一种快速高效、高灵敏度、高通量的布鲁氏菌病检测方法，本发明提供一种羊种布鲁菌16mlps的制备方法及其单克隆抗体的筛选鉴定方法和应用。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的羊种布鲁菌16mlps，其制备方法主要采用改进的酚水法提取羊种布鲁菌16m的lps，具体包括以下步骤：

取培养72h的菌液于4℃、5000rpm条件下离心15min，收菌泥，用pbs洗3次，离心收取菌泥，称取菌泥重量，按照菌泥和水1:4的比例加入等量的70度预热的蒸馏水和饱和酚，混匀后70℃水浴10min，4℃冷却，5000rpm离心8h，收集酚层和水层于离心管中，透析36h，分装于安剖瓶中冻干28h，冻干后样品用1％nacl溶解，室温摇床2h，加入3倍体积的冷甲醇于4℃冰箱中摇转1h，8000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀，加入pbs溶解沉淀，采用8％的sds-page凝胶进行电泳，并进行银染显色，检测lps的纯度。

利用上述制备的羊种布鲁菌16m的lps制备本发明的羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体，具体包括以下步骤：

步骤一、采用酚水法提取羊种布鲁菌16m的lps；

步骤二、采用提取的羊种布鲁菌16m的lps免疫balb/c小鼠；

步骤三、将免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合；

步骤四、利用间接elisa方法筛选出两株阳性杂交瘤细胞株；

步骤五、利用筛选的两株阳性杂交瘤细胞株制备两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体；

步骤六、对纯化后的两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体分别进行亚型鉴定，其亚型分别为igg3和igg1，轻链类型均为κ型；

步骤七、对两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体分别进行纯度及浓度检测，两株单克隆抗体均出现在55kd的重链和25kd的轻链条带，无其他杂带，其浓度分别为1.02mg/ml和2.10mg/ml；

步骤八、对两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体分别进行亲和常数及免疫效价检测，其亲和常数分别为1.12×10⁹和1.11×10⁹，免疫效价分别为1：6400和1：12800；

步骤九、对两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体分别进行敏感性和特异性检测，免疫荧光结果显示：用这两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体孵育10分钟均能够与布鲁菌发生特异性结合，敏感性强。

作为优选的实施方式，步骤二的具体过程如下：

将提取的羊种布鲁菌16m的lps与弗氏完全佐剂等体积混合并进行充分乳化，皮下多点注射初次免疫4只spf级balb/c雌性小鼠，剂量为60ug/只；初次免疫后，每隔两周进行加强免疫一次，共四次，剂量为30ug/只/次；采用间接elisa方法对免疫小鼠抗体效价进行检测，选取免疫血清效价为1:6400的小鼠进行腹腔注射免疫，50μg/只。

作为优选的实施方式，步骤三的具体过程如下：

取下免疫好的小鼠胸腺细胞和脾细胞；将小鼠脾细胞吸入到装有sp2/0骨髓瘤细胞的离心管中，1500r/min离心5min，倒掉上清，用无血清的imdm培养基将细胞吹匀，1500rpm离心5min，倒掉上清，悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，1min内加入1ml的peg1500，37℃温水中静置1min，2min内加入2ml无血清的imdm培养基，然后在2min内再加入8ml无血清的imdm培养基，1000rpm离心5min，倒掉上清，加入10ml血清，将细胞吹匀，倒入小鼠胸腺细胞，加入25ml灭菌的半固体培养基，充分混匀，均匀倒入多个细胞培养皿中，将细胞培养皿放入湿盒中，放入孵箱中过夜培养。

作为优选的实施方式，步骤四的具体过程如下：

(1)用包被液稀释羊种布鲁菌16m的lps至终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃过夜；2％的牛奶封闭，200ul/孔，37℃培养箱孵育2h；

(2)加入一抗、阴性对照、空白对照、阳性对照，均为100ul/孔，37℃培养箱孵育1h；所述一抗为细胞培养上清，所述阴性对照为sp2/0培养上清，所述空白对照为pbs，所述阳性对照为用pbs稀释1000倍的阳性血清；

(3)加入用pbs稀释20000倍的hrp标记的山羊抗小鼠igg二抗，100ul/孔，37℃培养箱孵育1h；

(4)以上步骤(1)、(2)、(3)，每进行一步均需吸弃板中已有的液体，用洗涤液洗涤3次，用显色液显色5min，显色液剂量为100ul/孔；

(5)加入50ul终止液终止；

(6)测定波长450nm和630nm下的吸光值；

(7)将第一次筛选出的杂交瘤细胞用上述同样的筛选方法进行第二次筛选，最终得到两株能稳定分泌抗羊种布鲁菌16mlps的阳性杂交瘤细胞株，命名为5和10。

作为优选的实施方式，步骤五的具体过程如下：

给spf级balb/c雌性小鼠腹腔注射石蜡油，剂量为500ul/只；7d后，每只小鼠注射阳性杂交瘤细胞5×10⁵～9×10⁵个；7d后采集腹水，5000rpm离心10min，取上清；将上清用偶联缓冲液以体积比为1:3的比例进行稀释，4℃、12000rpm离心10min，0.22μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质；用10倍柱体积的偶联缓冲液平衡柱子，保持流速1ml/min；将样品注入柱子上端接口，收集流出液，保持流速1ml/min；用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速1ml/min；用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于上述ep管中，保持流速1ml/min；用1m、ph9.0的tris-hcl缓冲液调整ph值至7.0；用10倍柱体积的偶联缓冲液平衡柱子回ph7.0，保持流速1ml/min；用0.01m、pbs缓冲液将抗体透析过夜，换液3次，得到两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体，并记为bmlps5和bmlps10。

作为优选的实施方式，步骤六的具体过程如下：

用ph7.4、100mm的pbs缓冲液稀释包被抗体至0.5ug/ml，100μml/孔，4℃过夜；加入封闭液200ul/孔，37℃孵育2h；加入阳性杂交瘤细胞上清，100ul/孔，37℃孵育1h；用封闭液按体积比为1:1000的比例稀释hrp标记的山羊抗小鼠igg，100μml/孔，37℃孵育1h；以tmb作为底物溶液50ul/孔；以上步骤，每进行一步均需吸弃板中已有的液体，并用pbst洗涤3次，最后在10～20min内测定波长450nm和630nm下的吸光值，完成单克隆抗体的亚型鉴定。

本发明的羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体在布鲁氏菌感染后动物机体抗体水平监测、感染动物和污染动物产品病原检测、制备布鲁氏菌病原检测试纸条、制备布鲁氏菌抗原检测试剂盒、制备布鲁氏菌抗体检测试纸条、制备布鲁氏菌抗体检测试剂盒中的应用。

本发明的有益效果是：布鲁菌16m是当前布病感染中最为流行的菌株，也是危害最严重的菌株，lps是动物或人布病最有效的诊断抗原，由于布鲁菌lps制备工艺过于复杂及其有效单克隆抗体筛选鉴定需要进一步改进和研究，因此本发明通过改进布鲁菌lps提取制备工艺，使得lps的制备更便捷，适合工业化生产。同时目前布鲁菌病原诊断方法难以建立，诊断产品不够成熟，主要是针对布鲁菌检测的特异性单抗的筛选鉴定还不够精准，因此，本发明通过改进当前流行布鲁菌菌株羊种布鲁菌菌株16mlps的提取制备工艺，获得了纯度较好的lps，可以为工业化生产提供便利，同时为布鲁菌抗体检测产品的研发提供技术保障。此外，利用提取的布鲁菌lps制备亲和力较好，特异的单克隆抗体为布鲁菌病原检测产品的研发奠定了基础。本发明旨在优化改进布鲁菌lps的提取纯化工艺，制备特异强、亲和力高的羊布鲁菌强毒株16m的单克隆抗体，拟为建立布鲁菌快速病原及抗体诊断方法奠定实验基础，同时为研制布病临床上的快检产品奠定基础。

本发明通过酚水法提取羊种布鲁菌16m的lps免疫balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，利用杂交瘤技术成功制备了两株单克隆抗体，分别命名为bmlps5和bmlps10；对这两株单克隆抗体进行sds-page、间接elisa及间接免疫荧光试验分析，结果显示：本发明的羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体，其亚型分别为igg3和igg1，轻链类型均为κ型；纯化后浓度分别为1.02mg/ml和2.10mg/ml；亲和常数分别为1.12×10⁹和1.11×10⁹，免疫效价分别为1：6400和1：12800。这两株单克隆抗体纯度和效价高，亲和性好，结合能力强，能够为今后开展布鲁菌病原及抗体检测方法的建立奠定良好的实验基础。

附图说明

图1为羊种布鲁菌16m的lps电泳银染结果。图中，1为marker；2为羊种布鲁菌16mlps。

图2为免疫小鼠抗体效价elisa检测结果。

图3为单克隆抗体sds-page图。图中，1为bmlps5；2为bmlps10；3为marker。

图4为单克隆抗体间接免疫荧光试验结果。图4a为孵育10min的试验结果；图4b为孵育1h的试验结果。

图5为单克隆抗体亲和常数及免疫效价检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、试验动物及菌种

6～8周龄、体重18g左右、spf级balb/c雌性小鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司。

羊种布鲁菌16m、sp2/0骨髓瘤细胞、小鼠巨噬细胞均由中国农业科学院特产研究所保存。

2、主要试剂及仪器

imdm培养基、imdm完全培养基(含15％血清)、2.2％甲基纤维素、hat培养基、ht培养基、山羊抗小鼠igg/hrp均为sigma公司产品。

peg1500：roche公司产品。

新生牛血清由gibco公司生产。

包被抗体、各型亚类二抗均为southernbiotech公司产品。

tmb、sds-page凝胶快速配制试剂盒均为碧云天公司产品。

银染试剂盒；索莱宝公司产品。

bca蛋白浓度测定试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

实施例1免疫原制备

取培养72h的菌液于4℃、5000rpm条件下离心15min，收菌泥，用pbs洗3次，离心收取菌泥，称取菌泥重量，按照菌泥和水1:4的比例加入等量的70度预热的蒸馏水和饱和酚，混匀后70℃水浴10min，4℃冷却，5000rpm离心8h，收集酚层和水层于离心管中，透析36h，分装于安剖瓶中冻干28h，冻干后样品用1％nacl溶解，室温摇床2h，加入3倍体积的冷甲醇于4℃冰箱中摇转1h，8000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀，加入pbs溶解沉淀，采用8％的sds-page凝胶进行电泳，并进行银染显色，检测lps的纯度。

将提取的羊种布鲁菌16m的lps进行sds-page凝胶电泳，并银染显色。结果如图1所示，用酚水法提取得到的羊种布鲁菌16m的lps条带清晰明显。

实施例2小鼠免疫

将实施例1获得的羊种布鲁菌16m的lps与弗氏完全佐剂等体积混合并进行充分乳化，皮下多点注射初次免疫4只spf级balb/c雌性小鼠(6～8周龄、体重18g左右)，剂量为60ug/只，编号为1、2、3、4。初次免疫两周后进行加强免疫，每次剂量均为30ug/只，每隔两周同样剂量进行加强免疫一次，共四次。

采用间接elisa方法对免疫小鼠抗体效价进行检测。结果如图2所示，1号小鼠的免疫血清效价为1:3200；2号小鼠的免疫血清效价为1:1600；3号小鼠的免疫血清效价为1:1600；4号小鼠的免疫血清效价为1:6400。因此，选取4号小鼠进行融合。

将实施例1获得的羊种布鲁菌16m的lps与弗氏完全佐剂等体积混合并进行充分乳化，对4号小鼠进行腹腔注射免疫，50μg/只。

实施例3细胞融合

将实施例2免疫好的4号小鼠摘眼球取血后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

取下小鼠胸腺，碾碎装到离心管中，向其中加入2ml的hat培养基和2ml的ht培养基，获得小鼠胸腺细胞，放在孵箱中备用。

取下小鼠脾脏，充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装有sp2/0骨髓瘤细胞的离心管中，1500r/min，离心5min；将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的imdm培养基将细胞轻柔地吹匀，1500rpm离心5min；倒掉细胞上清，拍打离心管底充分悬浮细胞；将离心管放入37℃温水中，在1min内缓慢加入1ml的peg1500，加完后，在37℃温水中静置1min；2min内缓慢加入2ml无血清的imdm培养基，接着2min内缓慢加入8ml无血清的imdm培养基，1000rpm离心5min；倒掉上清，加入10ml的胎牛血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的小鼠胸腺细胞，加入25ml灭菌的半固体培养基，充分混匀；均匀倒入30个细胞培养皿中；将细胞培养皿放入湿盒中，放入孵箱中过夜培养。

实施例4杂交瘤细胞筛选

采用实施例3培养好的胸腺细胞进行铺板，培养于96孔细胞培养板中。挑选10板细胞单克隆，用羊种布鲁菌16m的lps包板，对杂交瘤细胞采用间接elisa方法进行筛选。具体筛选方法如下：

(7)用pbst作为包被液稀释羊种布鲁菌16m的lps至终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃过夜；2％的牛奶封闭，200ul/孔，37℃培养箱孵育2h；

(8)加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(sp2/0培养上清)、空白对照(pbs)、阳性对照(用pbs稀释1000倍的阳性血清)，均为100ul/孔，37℃培养箱孵育1h；

(9)加入用pbs稀释20000倍的hrp标记的山羊抗小鼠igg二抗，100ul/孔，37℃培养箱孵育1h；

(10)以上步骤(1)、(2)、(3)，每进行一步均需吸弃板中已有的液体，用pbst作为洗涤液洗涤3次，用显色液显色5min左右，显色液剂量100ul/孔；

(11)加入50ul终止液(2m硫酸)终止；

(12)双波长(450nm，630nm)测吸光值；

(7)将第一次筛选出的杂交瘤细胞用上述同样的筛选方法进行第二次筛选，最终得到两株能稳定分泌抗羊种布鲁菌16mlps的阳性杂交瘤细胞株，命名为5和10。

实施例5小鼠腹水单克隆抗体的制备及纯化

给spf级balb/c雌性小鼠腹腔注射石蜡油，剂量为500ul/只。7d后，每只小鼠注射实施例4筛选的阳性杂交瘤细胞5×10⁵～9×10⁵个。待小鼠腹腔明显胀大，约7d左右采集腹水，5000rpm离心10min，取上清。将上清用相应的偶联缓冲液(20mm磷酸钠缓冲液，ph7.0)以体积比为1:3的比例进行稀释，4℃、12000rpm离心10min，0.22μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。用10倍柱体积的相应偶联缓冲液(20mm磷酸钠缓冲液，ph7.0)平衡柱子，保持流速为1ml/min。将样品注入柱子上端接口，收集流出液，保持流速为1ml/min。用5倍柱体积的偶联缓冲液(20mm磷酸钠缓冲液，ph7.0)过柱，保持流速为1ml/min。用5倍柱体积洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸钠缓冲液，ph3.4)洗脱抗体，收集于上述ep管中，保持流速为1ml/min。立即用1m、ph9.0的tris-hcl缓冲液调整ph值至7.0。用10倍柱体积的偶联缓冲液(0.1m柠檬酸钠缓冲液，ph3.4)平衡柱子回ph7.0，保持流速为1ml/min。使用0.01m、pbs缓冲液将抗体透析过夜，换液3次，得到本发明的两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体。

实施例6单克隆抗体亚型鉴定

用ph7.4、100mm的pbs缓冲液稀释包被抗体(southernbiotech公司产品)至0.5ug/ml，100μml/孔，4℃过夜；加入封闭液200ul/孔，37℃孵育2h；加入实施例4获得的杂交瘤细胞上清，100ul/孔，37℃孵育1h；用封闭液按照体积比为1:1000的比例稀释hrp标记的山羊抗小鼠igg，加入适当的孔中，100μml/孔，37℃孵育1h；以tmb作为底物溶液50ul/孔。

以上步骤，每进行一步均需吸弃板中已有的液体，并用pbst洗涤3次最后在10～20min内于双波长(450nm，630nm)测吸光值。

将纯化的两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体按照上述方法进行亚型鉴定，并记为bmlps5和bmlps10，分别命名为bmlps5和bmlps10。结果显示，两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体的亚型分别为igg3和igg1，轻链类型均为κ型。

实施例7单克隆抗体纯度及浓度检测

对实施例5获得的两株单克隆抗体进行sds-page凝胶电泳(12％分离胶)，检测抗体纯度；使用bca蛋白浓度测定试剂盒检测抗体浓度，根据试剂盒说明书进行具体操作即可。

结果图3所示，两株单克隆抗体均出现在55kd的重链和25kd的轻链条带，无其他杂带，其浓度分别为1.02mg/ml和2.10mg/ml，这表明本发明制备的这两株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体纯度和浓度均较高，且无其他杂蛋白。

实施例8间接免疫荧光试验

选取其中一株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体进行间接免疫荧光试验。将小鼠巨噬细胞铺至6孔板，37℃培养箱过夜培养细胞数量至每孔面积的80～90％。每孔加细胞数量3倍的羊种布鲁菌16m感染细胞5h，吸弃6孔板中的培养基，更换含有100μg/ml庆大霉素的培养基，每孔2ml，37℃恒温培养箱中培养2h。80％预冷丙酮固定细胞30min，-20℃冰箱(可过夜)。加triton-100室温摇床10min。用5％脱脂牛乳作封闭液，以杂交瘤细胞培养上清为一抗(按照1：100进行稀释，即1份一抗加100份5％脱脂牛乳进行稀释)，37℃培养箱孵育1h。加fitc(异硫氰酸荧光素)标记的山羊抗小鼠igg为二抗(按照1：50进行稀释，即1份一抗加50份5％脱脂牛乳进行稀释)，37℃避光孵育。以上步骤，每进行一步均需吸弃板中已有的液体，并用pbst洗涤3次，再进行下一步，最后用荧光显微镜观察，并保存照片。

通过间接免疫荧光方法对筛选出的其中一株羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体进行一抗孵育。结果如图4所示，相比一抗孵育1h来说，本发明的羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体在10min内均能与羊种布鲁菌16m结合，且结合效果较好，结合速度快。

实施例9单克隆抗体亲和常数及免疫效价检测

将两株单克隆抗体用样品稀释液(pbst)从200倍开始进行2倍梯度稀释，参考实施例4的间接elisa试验方法，检测其亲和常数及效价。结果图5和表1所示，bmlps5和bmlps10的亲和常数分别为1.12×10⁹和1.11×10⁹，免疫效价分别为1：6400和1：12800，表明本发明的羊种布鲁菌16mlps单克隆抗体亲和力好，效价高。

表1单克隆抗体亲和常数及效价检测结果

本发明公开了一种羊种布鲁菌16mlps和其单克隆抗体及其提取制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。