一种用于提取RNC-mRNA复合物的方法与流程

本发明涉及一种用于提取rnc-mrna复合物的方法。

背景技术：

基因表达定量，常见的定量方法是转录组和蛋白质组，但从mrna到蛋白的翻译过程，还有大量变数，因此兼顾有转录组和蛋白组技术优势的翻译组应运而生。翻译组在肿瘤、微生物抗逆机制、指导蛋白质组鉴定，以及新蛋白的挖掘、利用翻译暂停理论优化蛋白折叠效率等方面有着广阔的应用。

翻译组测序技术主要有ribosomeprofiling技术(核糖体印记技术)和rnc-mrna技术(核糖体新生肽链复合物结合的mrna技术)，两项技术均可以对正在翻译的mrna进行测序，但两者存在差异，并各有优势。ribosomeprofiling测序是对核糖体结合的mrna片段进行测序，能够获得整个基因翻译量的信息，以及从中进一步获得基因内部翻译变化的丰富的信息，但此技术操作复杂、需酶切操作、需要较大样品量、容易造成杂质污染，且较难检测序列变异、无法获取utr翻译调控区信息等缺点。而rnc-mrna测序能弥补上述技术的不足，且能够计算翻译效率、推算出蛋白质的含量，同时也能够推算出新的蛋白质。

rnc-mrna测序需要先得到全长的与核糖体结合的mrna复合物，由于核糖体和mrna的结合是非共价结合，整个大分子复合物构象脆弱，容易降解或解离，因此该技术的难点在于rnc-mrna复合物的分离，处理不当将得不到全长与核糖体结合的mrna复合物，并造成rnc-mrna定量失准，进一步也就无法获得翻译过程中核糖体分布的位置信息。中国发明专利cn104186460b公开了一种完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，以及中国发明专利cn104262478b公开了一种完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，但两种方法主要方法及目的在于冷冻保存rnc长期储存和运输、解冻后提取rnc可达到新鲜细胞提取rnc的效果，且公开的说明书中提取过程需要超速离心的操作，需要超速离心平台或者超速离心机，增加实验成本和实验操作的复杂性，阻碍该技术大规模地高效应用。因此，对提取rnc-mrna复合物还有很大的优化空间。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于提取rnc-mrna复合物的方法，该无需依赖超速离心机或平台，并且提取得到的rnc-mrna复合物的质量较好。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于提取rnc-mrna复合物的方法，包括以下步骤：

((1)取-80℃保存的细胞样本或者研磨好的组织样本置于冰上，加入预冷的细胞裂解液或者组织裂解液在冰上进行孵育裂解，裂解完全后，在4℃下17000g离心10min，弃沉淀回收上清液；所述细胞样本或者研磨好的组织样本在保存于-80℃前通过蛋白生物合成抑制剂处理；

(2)将步骤(1)回收的上清液加入到预处理好的层析柱的树脂顶部中央区，收集流出的液体，在室温下600g离心4min，得到含rnc-mrna复合物的上清液；

(3在步骤(2)得到的上清液中加入lysisreagent室温孵育8min；

(4)在步骤(3)得到的上清液中加入氯仿进行萃取，充分摇匀后室温孵育，4℃下12,000g离心15min，取上清液；

(5)将步骤(4)得到的上清液转移至新的ep管中，加入无水乙醇，混匀后转移到rneasyminispincolumn中，在室温下≥8000g离心15s，弃掉流出液；

(6)将bufferrwtr加入到rneasyminispincolumn中，在室温下≥8000g离心15s，弃掉流出液；

(7)将bufferrpe加入到rneasyminispincolumn中，在室温下≥8000g离心15s，弃掉流出液；

(8)重复步骤(7)；

(9)将rneasyminispincolumn在室温下≥8000g空转2min；

(10)将步骤(9)得到的rneasyminispincolumn转移到新的ep管，加入rnase-freewater将rnc-mrna复合物洗脱下来，收集含有rnc-mrna复合物的流出液。

优选地，所述细胞裂解液包括以下浓度的组分：20mm、ph7.4的tris-hcl，150mm的nacl，5mm的mgcl2，1mm的dtt，100μg/ml的cycloheximide，1％的tritonx-100以及rnase-free水。

优选地，所述组织裂解液包括以下浓度的组分：20mm、ph7.8的tris-hcl，100mm的kcl，10mm的mgcl2，2mm的dtt，100μg/ml的cycloheximide，1％的tritonx-100，1xedta-freecompleteproteaseinhibitor以及rnase-free水。

优选地，所述步骤(1)中裂解液在使用前按照每500μl的裂解液加入5μl2u/μl的dnasei和10μl40u/μl的rnaseinhibitor。

优选地，所述蛋白生物合成抑制剂为cycloheximide。

优选地，所述步骤(2)中层析柱的预处理步骤包括：

轻轻颠倒混匀层析柱的树脂，打开柱子的两端，让树脂中液体自然流出，往层析柱中加入3ml1×mammalianpolysomebuffer让其在重力的作用下自然流出，直至mammalianpolysomebuffer流干。

优选地，所述步骤(2)中层析柱为microspins-400column。采用商业化的microspins-400column对回收的上清液进行分子排阻色谱法分离纯化，无需依赖超速离心机或平台，节约成本，节省时间。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于提取rnc-mrna复合物的方法，本发明方法中采用层析柱对样品进行分离纯化，该无需依赖超速离心机或平台，节约成本、节省时间，并且提取得到的rnc-mrna复合物的质量较好。

附图说明

图1为本发明提取细胞样品的rnc-mrna复合物2100质检图；

图2为本发明提取组织样品的rnc-mrna复合物2100质检图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明用于提取rnc-mrna复合物的方法的详细步骤如下：

1、细胞固定

(1)对于新鲜的细胞样本(贴壁细胞)

1)在细胞培养基中加入harringtonine至终浓度2μg/ml，迅速混匀孵育(放入培养箱)2min；

2)迅速加入cycloheximide至终浓度100μg/ml，迅速混合孵育1min；

3)倒弃培养基，将含有细胞的培养板上转移至冰上，用适当体积冰预冷的pbs(加入cycloheximide，终浓度0.1mg/ml)轻轻冲洗一次吸干液体，再加入1-2ml预冷的pbs(加入cycloheximide，终浓度0.1mg/ml)；

4)侧拿皿使之一定程度倾斜，干净的细胞刮刀刮下细胞，刮的时候顺一个方向转着刮，集于底侧，回刀时先在底部溶液里涮一涮；

5)用1ml枪吸净置预冷1.5mlep管内；

6)已预冷的4℃离心机离心收集细胞，500g离心5min，吸弃上清，收集细胞；

7)液氮速冻。-80℃暂存，干冰保存。

(2)对于新鲜的细胞样本(悬浮细胞)

1)取1×10⁶-10⁷的细胞，500g离心5min去除培养基，收集细胞；

2)加入含有cycloheximide(终浓度0.1mg/ml)的新鲜培养基(8-10ml)，轻柔吹吸混匀，500g离心5min，倒弃上清；

3)加入1ml预冷的pbs(加入cycloheximide，终浓度0.1mg/ml)，轻柔吹吸混匀，并转移至预冷1.5mlep管内；

4)500g，4℃，离心5min，吸弃上清，收集细胞；

5)液氮速冻。-80℃暂存，干冰保存。

2、celllysis反应

(1)冰上预冷裂解液lysisbuffer，一个样品加500μl的裂解液，使用前500μl的裂解液中加入5μldnasei(2u/μl)和10μlrnaseinhibitor(40u/μl)；

(2)将细胞或者研磨好的组织样本从-80℃拿出，置冰上并迅速加入上一步配好的500μl预冷的相应的lysisbuffer至冰冻的样本上，冰上融化，移液枪轻柔吹散细胞，轻轻颠倒混匀数次，冰上孵育15min；

(3)4℃17000g离心10min，弃沉淀回收上清液400μl。

3、核糖体新生肽链复合物提取(即rnc-mrna复合物的提取)

(1)轻轻颠倒混匀层析柱的树脂，打开柱子的两端，让树脂中液体自然流出，往层析柱中加入3ml1×mammalianpolysomebuffer让其在重力的作用下自然流出；

(2)当buffer流干后，将层析柱置于一个干净的无核酸酶的1.5mlep管中，小心缓慢的在树脂的顶部中央区加入25-100μl上清液(步骤1(3)最后一步所得上清液)，600g离心4min室温，获得含多聚核糖体的上清液；

(3)rnc-mrna复合物提取

1.加入700μllysisreagent充分溶解样品，可适当涡旋振荡，室温孵育8min；

2.加入140μl氯仿，盖上盖子，大力充分摇匀15sec；

3.室温孵育2-3min；

4.4℃12,000g离心15min；

5.转移上清至新的ep管中，避免吸取沉淀，加1.5倍体积的无水乙醇，混匀；

6.吸取700μl的样品，包括上一步可能形成的沉淀到rneasyminispincolumn中，室温≥8000xg(≥10,000rpm)离心15s，弃掉流出液；

7.重复上一步，如果上一步的样品多于700μl；

8.加入700μlbufferrwt室温≥8000xg(≥10,000rpm)离心15s，弃掉流出液；

9.加入500μlbufferrpe室温≥8000xg(≥10,000rpm)离心15s，弃掉流出液；

10.重复上一步；

11.空转2min室温≥8000xg(≥10,000rpm)；

12.转移rneasyminispincolumn到新的1.5mlep管，加入30–50μlrnase-freewater，洗脱rnc-mrna复合物；

(4)rnc-mrna复合物质检：nanodrop检测rnc-mrna复合物的浓度和质量。

实施例1

以细胞样品为例，方法步骤同上，其中细胞裂解液celllysisbuffer(clb)组分如表1：

表1细胞裂解液

质检结果如图1所示，从图1可以看出，提取的rna质量较好，符合下一步的建库需求。

实施例2

以组织样品为例，方法步骤同上，其中组织裂解液tissuelysisbuffer(tlb)组分如表2：

表2组织裂解液

质检结果如图2所示，从图1可以看出，提取的rna质量较好，符合下一步的建库需求。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。