本发明涉及抗人内皮蛋白c受体的抗体，特别涉及新的抗人内皮蛋白c受体的特异性单域抗体，及其可变区的dna编码序列，还涉及所述单域抗体的应用。
背景技术：
内皮蛋白c受体(endothelialproteincreceptor,epcr)是蛋白c抗凝途径新发现的成员，也是继血栓调节蛋白之后在肿瘤细胞表面发现的另一种与抗凝相关的蛋白。研究表明蛋白c受体可通过与活化的蛋白c(apc)结合激活蛋白酶活化受体(par-1)，促进细胞增殖及抑制凋亡，epcr在此过程中起着关键的介导作用；最近的研究表明活化的蛋白c能够通过与epcr及par-1结合提高乳腺癌细胞株的迁移性和趋化性，揭示细胞和组织中epcr的过度表达有利于其增殖，抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的进展和转移。目前epcr的功能包含了参与抗凝、调节炎症反应和抑制细胞凋亡、参与肿瘤耐药和转移等。
人epcr的开放阅读框含有714个核苷酸，编码238个氨基酸，在加工过程中去除17个氨基酸信号肽，即成为221个氨基酸组成的成熟蛋白。epcr由胞外区、跨膜区和一个短的高度保守的胞浆区组成。细胞膜上的epcr属于结合型受体，研究证实epcr在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤等多种肿瘤细胞及白血病细胞中均具有表达，尤其是在恶性实体瘤当中。epcr基因在多种肿瘤细胞中高表达提示其可作为癌症诊断的肿瘤标记物。
骆驼科动物如双峰驼、单峰驼、羊驼和美洲驼中存在一种缺少轻链，仅由重链组成、但具有完整功能的抗体，称为重链抗体(heavychainantibody，hcab)。与常规抗体一样，重链抗体可变区具有很好的抗原识别和结合能力，能够正常行使抗体的功能。重链抗体的可变区(variabledomainsofthehcab，简称为vhh)，分子量约为15kda，仅为常规抗体大小的1/10，是目前可以得到的具有完整抗体功能的最小分子片段，称为单域抗体(singledomainantibody，sdab)。骆驼单域抗体的抗原结合区仅由vhh的三个超变区(h1-h3)组成，在空间上形成了与常规抗体典型结构不同的抗原结合域。其中h3的平均长度比常规抗体长，在空间上呈突出的指状结构，因此单域抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。另外，由于在框架区fr2中有四个位点被亲水性氨基酸替换，重组vhh在大肠杆菌中可以获得高表达。
获得单域抗体基因序列的方法是通过噬菌体抗体库进行筛选。噬菌体抗体库是用基因克隆技术将羊驼全套sdab可变区基因克隆出来，组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体。噬菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤淘选和鉴定：淘选是将噬菌体抗体库与目的抗原共同孵育，通过几轮洗脱，收集结合的噬菌体，将获得的噬菌体感染细菌并扩增，再进行下一轮的淘选，经几轮淘选后便可富集到与目的抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株；鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株，即将淘筛出的噬菌体感染细菌、铺板、挑选，即可得到高特异性单克隆菌株，通过基因测序，分析比对后即可获得相关抗体的可变区基因序列及其编码蛋白质。鉴定后的单域抗体进一步进行克隆构建，选择适当的载体进行表达后即可得到单域抗体。单域抗体与igg及scfv抗体相比，具有分子小、免疫原性低、穿透力强等优点，使得在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。
截止目前，还未见利用人类epcr的全长作为目的抗原，用羊驼噬菌体抗体库进行抗人内皮蛋白c受体的抗体筛选。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种抗人内皮蛋白c受体的特异性单域抗体。通过羊驼噬菌体抗体库的筛选，发现两株跟epcr能够紧密结合的单域抗体，该结合能够对蛋白c跟epcr的结合产生竞争性影响，该结合能够抑制蛋白c-epcr的信号通路，从而对依赖该信号通路的疾病具备潜在的治疗效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明的第一方面，提供了一种抗人内皮蛋白c受体的单域抗体，所述的单域抗体的氨基酸序列为seqidno:1、seqidno:2、与所述seqidno.1所示的序列同源性在95％以上的氨基酸序列或与所述seqidno.2所示的序列同源性在95％以上的氨基酸序列中的任意一种，
seqidno:1
avqlvesggglvqpggslrlscaasgftldyyaigwfrqapgkeregvscisssdgstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycatslggawvvagncpaldfnswgqgtqvtvss；
seqidno:2
qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftldyyaigwfrqapgkeregvscisssdgstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycatglggawtvasncpaldfgswgqgtqvtvss。
本发明的第二方面，提供了一种编码以上所述的单域抗体的核苷酸序列，其中编码seqidno:1所示的单域抗体的核苷酸序列如seqidno:3所示；编码seqidno:2所示的单域抗体的核苷酸序列如seqidno:4所示。
本发明的第三方面，提供了一种含有以上所述的核苷酸序列的重组表达载体。
进一步，所述载体选自原核或真核表达载体，优选选自pcdna3.1。
本发明的第四方面，提供了一种含有以上所述的核苷酸序列的宿主细胞。
进一步，所述宿主细胞含有以上所述的重组表达载体。
进一步，以上所述的宿主细胞能够表达所述的抗人内皮蛋白c受体的单域抗体。
进一步，所述宿主细胞优选的是hek293细胞。
本发明的第四方面，提供了本发明所述的抗人内皮蛋白c受体的单域抗体在制备检测或去除人内皮蛋白c受体试剂中的应用。
进一步，本发明还提供以上所述的氨基酸序列或核苷酸序列在制备检测或去除人内皮蛋白c受体试剂中的应用。
本发明的第五方面，提供了本发明所述的抗人内皮蛋白c受体的单域抗体在制备治疗以蛋白c-epcr信号通路为靶点的疾病的药物中的应用。
进一步，所述以蛋白c-epcr信号通路为靶点的疾病是肿瘤。
本发明的有益效果：
本发明利用噬菌体展示技术对羊驼噬菌体抗体库进行多轮筛选，富集能够特异结合人蛋白c受体的噬菌体；通过对噬菌体培养，制备抗体并鉴定获得阳性克隆，通过测序获得其相应的编码序列。本发明中的抗人内皮蛋白c受体的单域抗体保持对epcr的高结合能力，可用于epcr的表达检测；本发明的抗体可与蛋白c竞争性结合epcr，从而阻止蛋白c-epcr的信号通路激活，能用于以蛋白c-epcr信号通路为靶点的疾病治疗。
附图说明
图1为酶联免疫吸附实验(elisa)筛选候选抗人内皮蛋白c受体的单域抗体时确定抗原抗体最佳反应浓度测定图；
图2为采用elisa方法检测候选抗人内皮蛋白c受体的单域抗体与抗原的亲和力的结果；
图3为采用elisa方法检测候选获得的抗人内皮蛋白c受体的单域抗体竞争性结合能力的结果；
图4为抗人内皮蛋白c受体的单域抗体表达情况的sds-page电泳检测结果；
图5为注射6号抗epvr单域抗体和8号抗epvr单域抗体的乳腺癌模型小鼠的肿瘤体积的时间变化图；
图6为注射6号抗epvr单域抗体和8号抗epvr单域抗体对乳腺癌模型小鼠肿瘤大小的影响图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本领域技术人员可以明白，根据本申请公开的内容结合本领域技术常识，本申请公开的dna序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而且，本领域技术人员可以将本申请获得的新的dna序列构建到任何合适的载体、宿主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
【实施例1】获得人内皮蛋白c受体蛋白
1、免疫原的制备
人epcr全蛋白的氨基酸序列为：mlttllpilllsgwafcsqdasdglqrlhmlqisyfrdpyhvwyqgnaslgghlthvlegpdtnttiiqlqplqepeswartqsglqsyllqfhglvrlvhqertlafpltircflgcelppegsrahvffevavngssfvsfrperalwqadtqvtsgvvtftlqqlnaynrtryelrefledtcvqyvqkhisaentkgsqtsrsytslvlgvlvggfiiagvavgiflctggrrc(seqidno:5)。
2、全蛋白构建
构建入pcdna3.1载体,表达后纯化：
合成epcr目的基因，经nhei和hindiii双酶切，插入表达载体pcdna3.1中，构建pcdna3.1-epcr重组质粒，转染进hek293细胞表达，并利用亲和层析法纯化epcr蛋白。
【实施例2】抗人内皮蛋白c受体的单域抗体的筛选
首先，将未经免疫的骆驼体内免疫b细胞中的人类epcr的mrna反转录为cdna，然后可变区克隆到噬菌粒(phagemid，噬菌体质粒)m13k07(购自美国stratagene公司)，转化入大肠杆菌菌株xl1-blue，最后在辅助噬菌体m13k07系统扩增、包装下，将epcr抗体蛋白片段展示在噬菌体m13k07的表面，成为羊驼性天然单域重链抗体库。
本发明所用到的羊驼天然单域重链抗体库获自南京金斯瑞生物科技有限公司。
(一)epcr抗体的筛选、富集
1)m13k07滴度测定
1.单菌落xl1-blue，接种于2×ty/tet(15μg/ml)培养基，37℃过夜。
2.以1:100比例重新接种于新鲜2×ty培养基，37℃至od600＝1.0。
3.将噬菌体储液进行一系列10倍梯度稀释，溶于0.1ml分装的2×ty培养基中，每个梯度两份，以得到一个每毫升103-105噬菌体的浓度。
4.2×ty上层琼脂融化，每份噬菌体稀释液至少3ml，冷却至45℃。
5.10μl噬菌体液于500μl新鲜xl1-blue细胞在一个10ml的培养试管中，10分钟之后加入3ml上层琼脂，迅速混匀，立即将上层琼脂混合物倒至lb琼脂平板上，摇晃平板，让上层琼脂铺开，防止上层琼脂结成块，37℃静置过夜。
6.噬菌斑的数目乘以100乘以相应的稀释倍数，等于原始储液中的噬菌体的滴度。
2)m13k07的扩增
1.用枪头从过夜培养的平板上挑取一个单噬菌斑，在1ml新鲜xl1-blue细胞中吹洗，37℃振荡培养1小时。
2.吸取100μl培养物在50μg/ml四环素的2×ty50ml中，37℃振荡培养24小时。
3.将培养物转移到无菌管里，14000rpm，4℃，10分钟，上清液转移到新管中，1/5体积比例的40％peg4000&2.5mnacl液，强烈震动，冰浴15分钟。
4.14000rpm，4℃15分钟，尽量去除上清，用1/20体积的1×te缓冲液重悬沉淀，15000rpm4℃5分钟，上清转移到无菌管中，od268＝1.0对应每毫升5×1012个噬菌体。
3)原始epcr抗体库的大量扩增
1.单菌落xl1-blue，接种于2×ty/tet(15μg/ml)培养基，37℃过夜。
2.以1:100比例重新接种于新鲜2×ty培养基，37℃至od600＝0.4～0.5。
3.用1010-1011数量级的噬菌体侵染50ml的xl1-blue，37℃静置40分钟。
4.取100μl细胞悬液，在2×ty培养基里做10倍梯度稀释(10-1-10-12)，取10μl的各稀释度的细胞液于lb-氨苄平板上涂布，30℃过夜。
5.剩下的培养物37℃继续培养1小时，然后加入500ml2×ty培养基，37℃继续培养1小时。
6.用20倍的m13k07(1013)100μl进行侵染，37℃静置40分钟。
7.3000g，室温15分钟，沉淀重新悬浮于1000ml2×ty+amp+kan+glu，30℃，150rpm摇荡培养过夜。
8.将上清转移到无菌管里，14000rpm，4℃10分钟，上清液转移到新管中，按照每400μl上清液加入100μl40％peg4000&2.5mnacl液，强烈震动，冰浴15分钟。
9.14000rpm，4℃15分钟，去掉上清，用4ml1×te缓冲液溶解，滴度为1011pfu/μl。
4)epcr抗体的筛选、富集，第一轮
1.称取前述制备的免疫原人epcr全蛋白44μg，溶于3ml的碳酸钠-碳酸氢钠包被液(ph＝9.5)中，加入容量为4ml的nunc-immunotmmaxisorptm免疫试管中，4℃过夜。
2.tris-hcl封闭免疫试管的未饱和的蛋白偶联位点。先用偶联液清洗免疫试管3次，尽量去除上清，加入4ml0.1mtris-hcl缓冲液(ph8.0)，室温静置2小时，以封闭活性位点。
3.bsa封闭潜在蛋白结合位点。4ml5％bsa放入免疫试管中，室温缓慢摇动2小时，pbs清洗3次，甩干净。
4.1ml噬菌体抗体库液，总共1014个噬菌体加入免疫试管，室温下，混合器缓慢摇晃30分钟，然后室温静置90分钟，pbst清洗免疫试管10次，pbs清洗免疫试管10次，甩干。
5.噬菌体洗脱。免疫试管中加入600μl的10mmhcl，缓慢摇晃，室温30分钟，然后加入100μl0.1mtris-hcl将ph调至7.5，加入2ml新鲜的od＝7.0的xl1-blue菌液，37℃静置50分钟，转移到50ml离心管中，加入5ml2×ty，37℃摇荡30分钟。
6.加入1μl的1011个m13k07噬菌体，37℃静置50分钟，3000g，离心5分钟，去掉上清，沉淀溶于50ml的2×ty+amp+kan+glu培养基，30℃过夜。
7.peg4000沉淀培养基上清液中噬菌体，14000rpm离心，2ml的1×te溶解噬菌体，滴度约为1011。
5)epcr抗体的筛选、富集
第二、三、四、五轮，步骤同第一轮。
6)elisa检测抗体富集度
1.抗原包被：用蛋白c分别包被elisa板，包被浓度为1μg/ml。
2.bsa封闭；
3.每个elisa孔加入109个不同富集度的抗体噬菌粒，稀释到pbst中，100μl/孔，静置1小时。
4.anti-噬菌体抗体(兔来源)，稀释度1:5000，100μl/孔，37℃，1小时。
5.羊抗兔igg抗体(hrp)，稀释度1:10000，100μl/孔，37℃，1小时。
随着一轮一轮的筛选的进行，能够特异性识别结合蛋白c的抗体逐渐被富集。
(二)单克隆抗体菌落选取
elisa法检测胱抑素c的抗体富集度，到达平台期的第三轮筛选得到的抗体库随机选取60个抗体单菌落，而到达平台期的第四轮的抗体库随机选取30个抗体单菌落，分别用m13k07辅助扩增，离心后的上清液直接作为抗体溶液做elisa，选取光度值最高的单菌落作为单克隆抗体，根据单克隆抗体噬菌粒(phage-vhh)elisa的结果，第四轮、第五轮共挑取了21个阳性菌落测序，结果显示纳米抗体编码基因序列存在重复的现象，只有9种特异序列。
(三)酶联免疫吸附实验(elisa)筛选
酶联免疫吸附实验(elisa)可以用于：检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。其基本原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，滴加底物溶液后，出现颜色反应，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
1)酶联免疫吸附实验步骤
1.包被抗原：用50mm的碳酸盐包被缓冲液(ph9.6)溶解抗原epcr，使抗原浓度为5μg/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，4℃放置过夜。
2.第二天弃去包被液后，用pbst洗涤3次，每孔加入150μl1％bsa37℃封闭1小时。
3.pbst洗涤3次后，每孔加入100μl待检抗体(1μg/ml)，并加入对照样品，37℃孵育2小时。
4.pbst洗涤3次后，加入100μl稀释后的hrp标记的二抗，37℃孵育1小时。
5.显色:pbst洗涤5次,轻轻拍干,每孔加入100μl显色剂,室温反应5～10min。
6.每孔中加入终止液100μl并混匀,终止显色反应。
7.用酶标仪在450nm处测定吸光值。
2)棋盘法确定抗原抗体最佳反应浓度
抗原蛋白c分别用5.00μg/ml、2.50μg/ml、1.25μg/ml和0.625μg/ml4个浓度梯度包被，阴性对照组包被对应浓度的bsa，包被封闭后，用5％的脱脂奶粉梯度稀释1号克隆抗体，抗体浓度依次稀释10倍，分别为1×109pfu/μl、1×108pfu/μl、1×107pfu/μl、1×106pfu/μl，将上述各梯度的抗体稀释液分别加入对应的孔内，每孔100μl，37℃静置1h，选取1号克隆进行elisa检测确定抗原抗体最佳反应浓度。如图1所示。
随着抗体浓度的逐渐增加，od450也逐渐增大，在浓度每孔5×1010pfu时开始进入平台期。而就抗原包被浓度而言，随着抗原浓度的增加，抗体与抗原的结合能力没有明显的增加，尤其是5.0μg/ml和2.5μg/ml浓度条件下，增加的幅度很小，几乎接近平台期。所以，从试验灵敏性和经济两方面考虑，之后验证试验的最佳抗原包被浓度为2.5μg/ml，抗体孵育浓度为每孔5×108pfu。
【实施例3】获得高亲和力和竞争性结合epcr的单域抗体
1、抗体亲和力检测：
亲和力检测采用常规elisa方法如下：将候选抗体固定于载体，然后包被抗体与抗原反应，洗涤后再与带标记的检测抗体反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。结果如图2所示。
2、抗体竞争性结合能力检测：
通过竞争性结合elisa方法进行检测方法如下：将抗原epcr固定于载体，然后用候选抗体与抗原反应(对照组)，竞争性结合能力检测采用候选抗体与纯化的蛋白c混合后再与抗原反应(检测组)，洗涤后再与带标记的检测抗体反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。结果如图3所示。
经过亲和力检测和竞争性结合能力检测，筛选得到两个抗体可变区，分别是克隆6(clone6)和克隆8(clone8)，这两个抗体跟epcr有较强的结合反应，但在与蛋白c混合孵育后则与epcr结合的能力显著降低，说明他们与epcr的结合和蛋白c与epcr的结合是竞争性的。经过测序克隆6和克隆8的可变区序列分别为：
克隆6:
gcggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggattcactttggattattatgccataggctggttccgccaggccccagggaaggagcgcgagggggtctcatgtattagtagtagtgatggtagcacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcgacaagtctaggtggggcatgggtagtagctggtaactgtcccgctcttgactttaattcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcg(seqidno:3)。
克隆8:
caggtacagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggattcactttggattattatgccataggctggttccgccaggccccagggaaggagcgcgagggggtctcatgtattagtagtagtgatggtagcacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcgacaggtctaggtggggcatggacagtagctagtaactgtcccgctcttgactttggttcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcg(seqidno:4)。
【实施例4】重链单域抗体表达质粒的构建及抗体纯化
1.将实施例3筛选到的克隆6和克隆8抗体可变区(vhh)序列后面连接人抗体igg1fc序列，通过hindⅲ和nhe1两个酶切位点一起连入pcdna3.1表达载体。
2.单域抗体在hek293细胞中的表达、纯化：
(1)将测序正确的步骤1获得的重组质粒转化大肠杆菌dh5α，挑取单个克隆接种于含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，摇床200转/分培养过夜，抽提质粒；
(2)将抽提的重组质粒利用pei转染进hek293细胞进行表达，大量培养；
(3)收集细胞及上清，采用常规亲和层析方法纯化抗体蛋白，获得的特异性重链单域抗体6和8的sds-page电泳检测结果如图4所示。
【实施例5】特异性重链单域抗体6和8体内抑制肿瘤实验
1、制备为乳腺癌细胞培养液：当mda-mb-231乳腺癌细胞处于对数生长期时，首先将除去培养液，用pbs清洗mda-mb-231乳腺癌细胞两遍，于培养瓶中加入0.25％蛋白酶消化1分钟，去除0.25％蛋白酶，加入无血清培养基3ml，吹打细胞，制成悬液，以1000rpm离心5分钟，除去上清液，另加入适量细胞培养液，制备为肿瘤细胞培养液。
2、乳腺癌细胞培养液移植：对肿瘤细胞培养液经台盼兰染色和血细胞计数板计数，当活细胞比率大于90％、细胞浓度为1×106～1×107个细胞/ml时，可按每只裸鼠0.2ml接种于腋腹壁皮下。选取6-8周龄小鼠，体重16-22g，每只于皮下接种mda-mb-231细胞1×107/200μl，构建乳腺癌模型。
3、抗体治疗：挑选已经成瘤，并且肿瘤体积相近的移植瘤的小鼠，随机分为对照组、抗epcr克隆6号组和抗epcr克隆8号组，每组六只，待接种两周后进行抗体治疗，采取小鼠尾静脉注射的方式，实验组按照3μg/kg分别注射6号抗体和8号抗体，对照组注射生理盐水，每日观察肿瘤生长情况,在此期间，每三天测量肿瘤体积并记录，直至移植肿瘤细胞40天后，取肿瘤，拍照。将三组小鼠活体测量的肿瘤大小数据制成曲线图，得图5，说明随着时间的增加，对照组小鼠肿瘤生长更快，注射了6号和8号抗体的小鼠，体内肿瘤生长明显受到抑制。图6显示接种40天后，处理小鼠，取出肿瘤测量大小，可以看到实验组小鼠肿瘤的平均体积明显小于对照组，说明我们制备的抗epcr抗体能有效抑制小鼠乳腺癌肿瘤的生长。
序列表
<110>丁衡
武汉恒赛生物科技有限公司
<120>抗人内皮蛋白c受体的羊驼单域抗体及应用
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