本发明属于生物技术领域，涉及一种用于辅助检测前列腺癌的ddpcr引物组合物及其应用。
背景技术：
前列腺癌是中老年人最常见的恶性肿瘤。在欧美国家，其发病率已连续多年居男性恶性肿瘤发病率首位，死亡率居第二位。我国前列腺癌发病率虽然低于欧美国家，但是随着我国人口老龄化和饮食结构的改变，近年来也呈现出上升趋势。
目前，前列腺癌的诊断主要依赖于血清前列腺癌特异抗原(psa)的水平和直肠指检(dre)。血清psa是前列腺癌最常用的标志物，但是psa的假阳性率较高，psa水平在4-10ng/ml之间的患者，阴性活检率高达60-70％，这给患者和社会都带来了巨大的负担。因此，很有必要寻找一种更特异的指标用于前列腺癌的筛查和早期诊断。
cn108531594a提供了一种多基因联合用于前列腺癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒，所述联合基因为apc、nid2、p16，通过设计特异性甲基化引物分别检测apc、nid2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列，实现对前列腺癌的早期筛查和辅助诊断，分别通过三通道荧光定量pcr法分析尿沉渣中apc、nid2、p16三个基因标志物的甲基化水平，并根据所报告的ct值判读样本的阳性或阴性结果。cn103857796a提供一种对前列腺癌的特异度高且能够检测出恶性度低的前列腺癌组织的检测灵敏度高的前列腺癌的检测方法及前列腺癌标记物。其为包括由从受检者采取的受检者样品检测前列腺癌标记物的表达量的步骤的前列腺癌细胞的检测方法、用于前列腺癌细胞的检测方法的引物及前列腺癌标记物，所述前列腺癌标记物包含选自mir-124、mir-9和mir-137中的1种以上的mirna。但上述现有技术选择的标记物与前列腺癌关联度不够特异，其检测结果的温度下和准确性不高。
数字pcr(dpcr)技术则为第三代pcr，与q-pcr技术不同，数字pcr采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qpcr更加出色的灵敏度和特异性、精确性的优势，操作简单，周期也很短，ddpcr迅速得到了广泛的应用。
尿液作为检测样本为非侵入性前列腺癌筛查和诊断带来了巨大的希望。前列腺癌抗原3(pca3)已经作为一种新型的尿液诊断标志物获得美国fda批准，但近期在中国人群的研究较少。其他的尿液生物标志物如转移相关肺腺癌转录物1(malat-1)、前列腺特异性g蛋白偶联受体(psgr)被认为与前列腺癌同样相关。尿液malat-1与中国人群的前列腺癌患病风险有关。psgr过度表达已被证明与前列腺癌风险相关，尿液psgr具有用于前列腺癌的早期诊断的潜在价值。
因此，研发一种基于ddpcr的检测前列腺癌相关生物标志物的引物组合物并用于尿液样本的无创检测，解决患者痛苦，具有重大的现实意义。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足和满足市场的需求，本发明提供了一种用于辅助检测前列腺癌的ddpcr引物组合物及其应用，基于ddpcr方法，通过优选三种特异性的基因并设计相匹配的引物，优化扩增体系和条件，各步骤各条件相互配合，实现了准确特异地检测三种基因的表达情况的目的，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于辅助检测前列腺癌的ddpcr引物组合物，所述引物组合物包括针对pca3基因的上下游引物，针对psgr基因的上下游引物和针对malat1基因的上下游引物。
优选地，所述针对pca3基因的上下游引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示。
优选地，所述针对psgr基因的上下游引物的核苷酸序列如seqidno3-4所示。
优选地，所述针对malat1基因的上下游引物的核苷酸序列如seqidno5-6所示。
所述引物组合物具体见表1；
表1
本发明中，发明人为解决现有技术的不足和满足市场的需求，基于ddpcr方法，通过优选三种特异性的基因并设计相匹配的引物，前列腺癌抗原3(pca3)已经作为一种新型的尿液诊断标志物获得美国fda批准。多项研究显示转移相关肺腺癌转录物1(malat-1)和前列腺特异性g蛋白偶联受体(psgr)与前列腺癌相关。尿液malat-1和psgr过度表达与中国人群的前列腺癌患病风险有关。因此选择上述3个生物标志物。针对引物设计，首先确定pca3、malat-1、psgr基因的编码序列，引物设计使用在线引物设计工具blast，引物长度15-30bp，引物gc含量在40％～60％之间，tm值最好接近72℃。引物应具有特异性，引物设计完成以后，对其进行blast检测。引物自身及引物之间不应存在互补序列。根据以上条件筛选最优的引物进行下一步实验。三种基因相互配合，实现了准确特异地检测三种基因的表达情况的目的，用于参考数据，辅助医生对前列腺癌的早期筛查和诊断，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
第二方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包括第一方面所述的引物组合物、缓冲液、样本cdna和水。
优选地，所述检测体系的cdna的浓度为0.5-1.5ng/μl。
第三方面，本发明提供一种在尿液样本中检测基因表达情况的方法，采用如第一方面所述的引物组合物。
优选地，包括如下步骤：
(1)收集尿液样本，提取rna，反转录为cdna；
(2)制备ddpcr反应体系；
(3)进行pcr扩增，对扩增结果进行数据分析。
优选地，步骤(2)所述反应体系包括：步骤(1)的cdna、第一方面所述的引物组合物、缓冲液和水。
优选地，所述反应体系的cdna的浓度为0.5-1.5ng/μl，例如可以是0.5ng/μl、0.7ng/μl、1ng/μl、1.2ng/μl、1.4ng/μl或1.5ng/μl。
优选地，所述引物的浓度为10μm。
优选地，步骤(3)所述扩增的条件为：95℃10min；95℃30s，60℃1min，40个循环；98℃10min；
优选地，步骤(3)所述数据分析的方法为：采用两两之间t检验的方法，p≤0.05表明有显著性差异。
作为优选技术方案，一种在尿液样本中检测基因表达情况的方法，采用如第一方面所述的引物组合物，具体包括如下步骤：
(1)收集尿液样本，提取rna，反转录为cdna；
(2)制备ddpcr反应体系，包括步骤(1)的0.5-1.5ng/μl的cdna、第一方面所述的引物组合物、缓冲液和水；
(3)进行pcr扩增，扩增的条件为：95℃10min；95℃30s，60℃1min，40个循环；98℃10min；对扩增结果进行数据分析，采用两两之间t检验的方法，p≤0.05表明有显著性差异。
本发明中，发明人基于ddpcr方法和三个基因的特异性引物，优化pcr体系和扩增条件，各步骤各条件相互配合，最终实现了准确稳定的检测。
第四方面，本发明提供一种用于辅助检测前列腺癌的药物和/或试剂盒，所述药物和/或试剂盒包括第一方面所述的引物组合物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供的引物组合物采用ddpcr方法对三种基因的表达情况进行检测，灵敏度和精确性高，特异性好，尿液中检测pca3、psgr和malat-1对于前列腺癌的辅助诊断，其诊断准确性均优于psa，其中pca3表现最好，敏感性为97％，特异性为41.6％；malat-1的敏感性为72.7％，特异性为60.7％；psgr的敏感性为81.8％，特异性为49.4％。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1制备样品
研究对象满足以下条件：45岁以上男性，血液psa检测水平在4-10ng/ml之间，签署知情同意。共招募122名患者。
患者进行经直肠超声(trus)活检，54名患者被诊断为前列腺癌，其余为阴性患者，前列腺癌和阴性患者的中位psa分别为7.0(sd:1.7)ng/mland7.2(sd:1.7)ng/ml(＝0.643)。
标本收集和样本制备：
活检前，收集患者前列腺按摩后的尿液样本，尿液样本收集后立即在冰上冷却，并在2小时内进行下一步处理，将样品在4℃，2,500×g离心15分钟，用冰冷的冷pbs(1×)洗涤两次，然后将沉淀物放在trizol试剂中(invitrogen：number15596-026，美国)，进行rna提取，并在-80℃下储存以进一步保存使用。
实施例2数字pcr
在cdna合成之前，提取的rna用dnaseⅰ(takara：d2215，takara，日本)处理，采用罗氏(roche)的transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit，将rna反转录为cdna。
数字pcr所需引物如下表1：
表1
制备数字pcr反应液，总体积20μl，向扩增管中加入下列反应物：cdna模板2ng，10μlsupermix(2×)，上下游引物各1μl，ddh2o补足20μl。
所有待测样品均设3个重复，并用去离子水代替模板作为阴性对照；
pcr扩增条件(bio-rad)：95℃10min；95℃30s，60℃1min，40个循环；98℃10min；
数据分析
quantasoftversion1.3.2.0(bio-rad)软件读取结果。数据采用两两之间t检验的分析方法，p≤0.05表明有显著性差异。
检测结果
活检阳性的患者，pca3、psgr和malat-1mrna表达量普遍高于阴性的患者，尿液中检测pca3、psgr和malat-1对于前列腺癌的辅助诊断，其诊断准确性均优于psa，其中pca3表现最好，敏感性为97％，特异性为41.6％；malat-1的敏感性为72.7％，特异性为60.7％；psgr的敏感性为81.8％，特异性为49.4％。因此，对于psa水平在4-10ng/ml之间的患者，可以利用ddpcr在尿液中检测pca3的表达量来对作为参考数据，辅助医生对前列腺患者进行早期筛查和诊断。
综上所述，本发明提供的一种用于辅助检测前列腺癌的ddpcr引物组合物及其应用，基于ddpcr方法，通过优选三种特异性的基因并设计相匹配的引物，优化扩增体系和条件，各步骤各条件相互配合，实现了准确特异地检测三种基因的表达情况的目的，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
sequencelisting
<110>天津脉络医学检验有限公司
<120>一种用于辅助检测前列腺癌的ddpcr引物组合物及其应用
<130>2019
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>1
tggtgggaaggacctgatgatacag25
<210>2
<211>24
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>2
tctcccagggatctctgtgcttcc24
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>3
catggcctttgaccgttatgt21
<210>4
<211>23
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>4
gccaatctgggctgttactgtat23
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>5
cttccctaggggatttcagg20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>6
gcccacaggaacaagtccta20