一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测呼吸道合胞病毒的靶序列、特异性引物和靶探针，本发明还涉及利用特异性引物、探针、内参探针进行双重等温核酸扩增检测呼吸道合胞病毒的方法和试剂盒。

背景技术：

呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)是一种含有包膜的单股负链rna病毒，属于副粘病毒科肺炎病毒属。存在单一抗原类型的rsv，根据抗原和遗传变异分析分为两个亚组，a型和b型，通常只有一种亚型在流行病中占优势。呼吸道合胞病毒已被确认为是急性呼吸道感染最常见、最重要的原因，导致全世界婴幼儿和成年人的发病率和死亡率上升，对社会和卫生保健系统造成重大损失。由rsv引起的呼吸道感染可导致支气管炎、支气管肺炎和重症肺炎，甚至危及生命，且临床症状(例如，咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉痛和呼吸困难等)难以与其他呼吸道病毒引起的肺炎区分开来。一些研究表明由rsv引起的婴幼儿肺炎和支气管炎比其他病原微生物比例高。还有部分研究表明每年的深秋到早春时期为rsv感染的高发期，与其他呼吸道病毒相比，每年rsv流行的时间更长。在我国，rsv感染也呈季节性流行，最易在冬季发现(多在每年的11月份到次年的2月份)，其次是春季、秋季和夏季。但目前尚无特异有效的rsv疫苗上市也无特异的治疗方法，因此rsv感染仍然是一个尚未解决的全球健康问题。因此，快速、准确地检测rsv，不仅对监测和控制rsv的流行具有重要意义，也为临床早期诊断提供可靠的实验室依据，为选择合理的治疗方案提供依据。

目前的rsv诊断依赖于病毒培养，对病毒核酸(例如，rt-pcr、实时荧光rt-pcr和多重rt-pcr技术)或血清学的选择性检测。病毒培养以其优良的特异性被认为是诊断rsv的金标准，但其敏感度低，易导致rsv漏诊。细胞培养的开展也受到其劳动密集型和培养周期长的限制。血清学检测主要包括直接免疫荧光检测(dfa)、快速抗原检测(radt)，也同样存在敏感度低，操作复杂等缺点。有的检测方法，例如直接免疫荧光检测(dfa)需要专业的技能、材料、试剂和免疫荧光显微镜。分子生物学与病毒分离培养、血清学诊断相比，具有灵敏度高、特异性强、周转时间快等优点，然而，它需要专业知识技能，专用热循环设施和专用实验室，这在很大程度上限制了其在传统实验室和低资源地区的推广及应用。

由于现存rsv病毒检测方法的不足以满足通用型rsv病毒快速检测的需求，因此研究一种能在基层应用，可在常温下快速检测rsv病毒的方法非常有必要。

重组酶介导扩增技术(recombinase-aidedamplificationassay，raa)是一种新型恒温核酸扩增检测技术。反应体系由大肠杆菌重组酶uvsx、单链结合蛋白、dna聚合酶、缓冲液等组分组成，反应在39-42℃恒温下30min即可完成。在以往的raa研究中，raa检测技术的一个主要缺点是它们不包含内参。内参是存在于同一样品管中的非靶dna序列，它与靶序列同时被扩增。在没有内参的raa反应中，阴性反应(没有带或无信号)可能意味着反应中没有靶序列。但是，这也可能意味着由于温度不当、raa反应体系混合物不正确、dna聚合酶活性差或样品基质中存在抑制物质，从而使反应受到了抑制，而导致了假阴性结果。相反，在含有内参的raa反应中，即使没有靶序列，也应该始终产生控制信号。本发明在反应体系中加入了内参，实现对反应体系及反应过程进行监测，进一步确保了检测结果的准确性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测结果准确可靠、灵敏、特异、快速的检测呼吸道合胞病毒的方法。

为实现上述目的，发明人根据rsv病毒基因组序列，寻找a型和b型同源性高的保守序列，设计适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对和靶探针。

经过对比和筛选，本发明首先提供一条用于检测呼吸道合胞病毒的靶序列，其具有seqidno.5所示的序列或其特异性片段。其在genbank登录号ky982517公开的序列第13948-14316bp位。

根据上述靶序列精心设计了特异性引物对和靶探针，其核苷酸序列分别如seqidno.1-3所示。该发明的探针和引物适用检测包括a型和b型在内的通用型rsv。本发明探针类型为exo探针，分别于四氢呋喃[thf]两侧标记荧光基团(dt-荧光基团)和淬灭基团(dt-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-5bp。

进一步地，本发明设计的内参探针的核苷酸序列如seqidno.4所示。该内参探针类型为exo探针，分别于四氢呋喃[thf]两侧标记与靶探针荧光颜色不同的荧光基团(dt-荧光基团)和淬灭基团(dt-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-5bp。

本发明提供了所述的靶序列在采用等温核酸扩增技术检测呼吸道合胞病毒中的应用。

具体地，本发明提供了适用于等温核酸扩增技术检测呼吸道合胞病毒的引物探针组合，该组合含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如seqidno.3所示。

优选地，本发明的引物探针组合还含有一条内参探针，所述内参探针的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明提供了所述引物探针组合在制备快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供了含有所述引物探针组合的快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒。

本发明实施例中，本发明提供的快速检测呼吸道合胞病毒的试剂盒含有等温核酸扩增体系，该体系具体配置如下：

该体系中，靶探针和内参探针分别标记荧光色不同的荧光基团，所述荧光基团包括fam、hex、rox、tet、joe、cy3、cy5、tamra、vic。

本发明的试剂盒还含有内参dna，其核苷酸序列如seqidno.6所示，所述试剂盒在工作时，在等温核酸扩增体系中加入样品rna和内参dna，混合均匀后进行等温核酸扩增检测，扩增检测温度为39-42℃，优选39℃，扩增检测时间为15-30min，优选30min。

本发明所采用的内参dna为重组dna，由植物病毒片段和靶标片段(本发明为rsv片段)组成。重组dna保留了本发明rsv片段相同的引物序列(seqidno.1-2)，且其他序列作为主干，而只有与rsv探针(seqidno.3)结合区被植物病毒片段所替换。在这种情况下，除了探针结合区有差异外，重组dna序列与rsv靶标的引物和模板序列完全相同，随后该重组dna片段构建成质粒作为竞争性内参dna。

结果判读：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光pcr仪中，实时读取荧光信号，根据rsv靶标和内参dna检测结果进行判断:

rsv靶标和内参dna检测结果均出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

rsv靶标检测结果未出现扩增荧光信号内参dna检测结果出现扩增荧光信号，检测结果为阴性；

rsv靶标检测结果出现扩增荧光信号内参dna检测结果未出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

rsv靶标和内参dna检测结果均未出现扩增荧光信号，检测结果为可能为假阴性，建议重复实验或重新提取rna进行检测。

本领域技术人员可以理解，基于非疾病诊断目的，本发明还提供了一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法，以本发明上述含内参探针的引物探针组合对待测样品模板进行等温核酸扩增检测，所述待测样品模板为待测样品rna和内参dna。所述内参dna核苷酸序列如seqidno.6所示。

本发明所提供双重的检测rsv的方法，实际成本低廉、仪器设备简单、检测时间短、无需高温变温的条件、并且对检测材料质量和对操作人员的技术要求低，而且本发明方法中加入内参排除了假阴性和无效结果，更适合应用于有大量样品的检测，并且可同时检测大批量的样本，具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，分析灵敏度达5拷贝/反应，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为实施例1筛选最佳引物探针组合实验结果图，图中1指代seqidno.1，2，3组合的扩增荧光信号；2指代seqidno.1，8，3组合的扩增荧光信号；3指代seqidno.2，2，3组合的扩增荧光信号；4指代seqidno.2，8，3组合的扩增荧光信号；5指代seqidno.1，9，3组合的扩增荧光信号；6指代seqidno.2，9，3组合的扩增荧光信号；阴性：阴性对照。

图2a-图2b为实施例2的方法对rsv和内参dna的实时荧光检测扩增曲线图，图2a为rsv阳性扩增荧光信号图，图2b为图2a相对应的内参dna扩增荧光信号图。

图3a-图3b为实施例3的方法对rsv和内参dna的实时荧光检测扩增曲线图，图3a为rsv阳性扩增荧光信号图，图3b为图3a相对应的内参dna的扩增荧光信号图。

图4a-图4b为实施例4的方法对rsv和内参dna的实时荧光检测扩增曲线图，图4a为rsv阳性扩增荧光信号图，图4b为图4a相对应的内参dna的扩增荧光信号图。

图5a-图5b为本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒灵敏度实验结果图。图中0：10⁰，1：10¹，2：10²，3：10³，4：10⁴，5：10⁵，阴性：阴性对照。图5a代表灵敏度扩增荧光信号图。图5b为图5a中相对应的内参dna扩增荧光信号图。

图6a-图6b为本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒特异性实验结果图。图6a为特异性检测图，图6b为图6a中相对应的内参dna扩增荧光信号图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1适用用于等温核酸扩增检测通用型呼吸道合胞病毒的特异性引物对、靶探针、内参探针的设计和确定

下载全部rsv病毒全基因组序列，进行序列比对，寻找同源性高的保守区域，确定一条适用于检测a型、b型的通用型rsv的靶序列，其核苷酸序列如seqidno.5所示。在该保守区域设计多条特异性引物和靶探针。

raa引物设计原则：一是引物长度，raa引物比典型的pcr引物更长，一般要求为30-35bp；二是引物序列，5’端(3-5bp)避免出现重复g，最好为c或t；3’端(后3个碱基)最好有g和c；gc含量不要大于70％或小于30％；引物间避免形成二级结构、引物二聚体等。raa探针设计原则：raa荧光探针(exo探针)主要包括四个特殊部分，3′末端的阻断物(通常为c3-spacer)，脱碱基核苷酸类似物(四氢呋喃[thf]残基，有时称为“dspacer”)及位于thf两侧的荧光基团(dt-荧光基团)和淬灭基团(dt-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-5bp。探针一般为46-52个碱基，5’端到thf位点至少要30个碱基，thf位点到3’端至少要15个碱基。

本发明经过大量实验发现并非只要满足上述引物、探针设计原则所设计出的引物、探针进行扩增效果就必然好，在研究对比中，本发明发现有非常符合上述设计原则的引物探针组合并没有出现很好的扩增效果，反倒是不符合以上引物探针设计原则的引物探针组合反而扩增的效果很好。因此在满足上述一般设计原则的基础上，本发明进行了优化设计和大量引物探针组合的筛选对比，以下为本申请设计的大量候选引物探针组合的部分罗列及效果说明。

候选的引物核苷酸序列见seqidno.1-4，7-9(y，w，r为简并碱基，y＝c/t，w＝a/t，r＝a/g)。使用rsv阳性临床样本筛选灵敏度高、特异性好的最佳引物和探针组合，根据起峰时间和荧光强度进行筛选，筛选结果图1。

正向引物序列：

5’-tccyaattgtatagcattcataggtgaaggagc-3’，(seqidno.1)

5’-ttaaagatccyaattgtatagcattcataggtg-3’(seqidno.7

反向引物序列：

5’-ttgcatctgtagcaggaatggtyaaattytcac-3’(seqidno.2)

5’-accaatgaatgttgttrgttgcatctgtagcagga-3’(seqidno.8)

5’-ggttcwgcaaaytttatatgtaaataagac-3’(seqidno.9)

靶探针序列为：

5’-catcctgatataagatatatttacagaagtytgaaagat

tgcaatga-3’(seqidno.3)

内参探针序列为：

5’-gtaaggtgctagactaaaattgttgggactttgaatctctgaagtaaaagg-3’(seqidno.4)

对以下引物探针组合进行检测和筛选：

第1组：seqidno.1，2，3组合；

第2组：seqidno.1，8，3组合；

第3组：seqidno.2，2，3组合；

第4组：seqidno.2，8，3组合；

第5组：seqidno.1，9，3组合；

第6组：seqidno.2，9，3组合；

在图1可以看出，在相同的条件下，seqidno.1，2，3的引物探针组合，阳性阈值时间及荧光信号值优于其他组合，阳性阈值时间早，荧光强度高，因此本发明将该组合选为最佳引物探针组合。最终确定本发明适用于等温核酸扩增方法的检测rsv病毒的引物和探针如下：

正向引物序列：5’-tccyaattgtatagcattcataggtgaag

gagc-3’，(seqidno.1)

反向引物序列：5’-ttgcatctgtagcaggaatggtyaaatty

tcac-3’。(seqidno.2)

靶探针序列为：5’-catcctgatataagatatatttacagaagt

ytgaaagattgcaatga-3’(seqidno.3)

内参探针序列为：5’-gtaaggtgctagactaaaattgttgggactttgaatctctgaagtaaaagg-3’(seqidno.4)

实施例2检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法(1)

1、样品来源及rsv的rna提取

病毒样品系河北省儿童医院从不同患者灌洗液中收集的含有rsv活病毒的标本，rna提取采用天隆提取试剂盒，rna提取设备为天隆全自动核酸提取仪。

2、引物和探针采用实施例1确定的适用于等温核酸扩增方法的检测rsv病毒的引物和探针(seqidno.1-4)，其中靶探针标记fam荧光基团，内参探针标记hex荧光基团。

3、配制扩增体系：在200μl离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为50μl)：

将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。也可现配现用。

4、rsv检测

向离心管中加入终浓度为6％(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将体系重新溶解成为48μl，再加入制备好的1μlrsvrna和1μl内参dna，使用奇天仪器恒温振荡混匀仪均匀混合4min，瞬时离心，放入到可检测fam和hex荧光的仪器中，在39℃反应30min。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。结果显示，在2min之后开始显示扩增的荧光信号，且每一个反应管，均检测到内参扩增信号，实现了对反应体系的监控，从而排除了假阴性和无效结果，如图2a-图2b所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例3检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法(2)

方法参见实施例2，不同之处在于50μl的等温核酸扩增体系中，靶探针的浓度为160nm,内参探针的浓度为160nm，正、反向引物的浓度分别为450nm，其他参数、步骤与实施例2相同。结果显示，在1min内开始显示扩增的荧光信号，且峰值高。如图3a-图3b所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例4检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法(3)

方法参见实施例2，不同之处在于50μl的等温核酸扩增体系中，靶探针的浓度为120nm,内参探针的浓度为120nm，正、反向引物的浓度分别为350nm，其他参数、步骤与实施例2相同。结果显示，在1min内开始显示扩增的荧光信号。如图4a-图4b所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

结果判读：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光pcr仪中，实时读取荧光信号，根据rsv靶标和内参dna检测结果进行判断:

rsv靶标和内参dna检测结果均出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

rsv靶标检测结果未出现扩增荧光信号内参dna检测结果出现扩增荧光信号，检测结果为阴性；

rsv靶标检测结果出现扩增荧光信号内参dna检测结果未出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

rsv靶标和内参dna检测结果均未出现扩增荧光信号，检测结果为可能为假阴性，建议重复实验或重新提取rna进行检测。

实施例5本发明检测方法的灵敏度、特异度及检出限评价

1.灵敏度评价

使用rsv重组质粒标准品进行灵敏度的评估，将重组质粒进行倍比稀释(10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝/反应)，每个稀释度浓度重复8次实验，统计分析结果显示该方法的95％检测限约为5拷贝/反应。通过灵敏度实验确定内参dna的最佳浓度为10²拷贝/反应，在该内参dna浓度下，rsv检测灵敏度不受影响。灵敏度效果图见图5a-图5b。

2.特异度评价

利用其他常见呼吸道病毒标本参照实施例2-4的方法进行特异性评估，包括腺病毒、流感病毒a和b、人鼻病毒、副流感病毒、冠状病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒和支原体等。检测结果显示本发明方法只能特异性检测呼吸道合胞病毒，并不与其他病毒发生交叉反应。特异性图见图6a-图6b。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法

<130>khp191110992.3

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tccyaattgtatagcattcataggtgaaggagc33

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttgcatctgtagcaggaatggtyaaattytcac33

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catcctgatataagatatatttacagaagtytgaaagattgcaatga47

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<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtaaggtgctagactaaaattgttgggactttgaatctctgaagtaaaagg51

<210>5

<211>369

<212>dna

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catcactttattgcatgcttccttggcatcatattaatagattcaattttgtatttagtt60

ctacaggttgtaaaattagtatagagtatattttaaaagatcttaaaattaaggatccta120

attgtatagcattcataggtgaaggagcagggaatttattattgcgtacagtagtggaac180

ttcatcctgatataagatatatttacagaagtctgaaagattgcaatgatcatagtttac240

caattgagtttttaaggctgtacaatggacatatcaacattgattatggtgaaaatttga300

ccattcctgctacagatgcaaccaacaacattcattggtcttatttacatataaagtttg360

ctgaaccta369

<210>6

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<212>dna

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<400>6

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<211>30

<212>dna

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<400>9

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