一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测引物及方法与流程

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式rt-pcr检测引物及方法。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)又称为猪蓝耳病毒，以引起母猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪和育肥猪呼吸困难、败血症、高死亡率为主要特征。该病在世界各地普遍存在，给我国的养猪业造成严重的经济损失。

猪蓝耳病毒为套式病毒目(nidovirales)、动脉炎病毒科(arteriviridac)、动脉炎病毒属(arterivirirus)，基因组为单股正链rna病毒，不分节段rna，含有5'端非编码区、10个开放阅读框架(orf1a、orf2a、orf1b、orf2b、orf3-7、orf5a)编码病毒结构蛋白(gp2、gp3、gp4、gp5、m、n)和3'端utr,组长约15kb。目前国际上根据prrsv的抗原特性，可将其分为欧洲型和美洲型2个血清型，美洲型毒株又根据其在非结构蛋白nsp2碱基数的缺失分为三种亚型，分别为经典毒株、高致病性变异毒株和nadc-30毒株。近年来，prrsv基因组的变异现象引起了人们的关注，也是造成本病难以控制的重要原因之一。

目前猪蓝耳病毒的检测方法主要是实验室检测。病原学检测技术主要有普通rt-pcr、荧光定量rt-pcr等。血清学检测方法中主要是抗体检测。但采用单一对引物分别用pcr扩增单独三种亚型具有敏感性较低、操作繁琐、检测时间长等缺点，不能及时了解检测样本prrs的基因特点。本发明在单一常规的rt-pcr基础上建立一种巢式rt-pcr方法，通过两对引物扩增出不同的目的片段来区分猪经典毒株、高致病性变异毒株和nadc-30毒株，以提高检测的敏感性及特异性。

巢式rt-pcr是一种变异的聚合酶链反应，使用两对pcr引物扩增目的片段。经过两次pcr扩增，可以极大程度的提高普通pcr的灵敏度，且二次pcr引物发生非特异性结合的概率极低。根据密码子的兼并性,常用一个符号代替某两个或者更多碱基，改符号即为简并碱基。并专利中设计引物中r和y即简并碱基，从而可以扩增出经典毒株、高致病性变异毒株和nadc-30的不同条带。且只有一条是真正可以和模板配对的。序列分析显示：流行毒株nsp2蛋白氨基酸高度保守，可以作为临床诊断的靶抗原。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种快速简便的猪蓝耳病巢式rt-pcr检测方法，不仅可快速区分猪感染蓝耳病的不同病毒亚型，同时具有特异性强、灵敏度高等特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

猪蓝耳病毒的巢式rt-pcr引物的设计：通过编码猪蓝耳病毒nsp2基因中碱基序列得到两对带有简并碱基的巢式检测引物，所述两对检测引物，分别为外侧引物prrsv-o-f、prrsv-o-r和内侧引物prrsv-i-f、prrsv-i-r，序列如下：

prrsv-o-f：aatcttgargaatgcttggc(seqidno.1)；

prrsv-o-r：gctgagtaytttgggcgtg(seqidno.2)；

prrsv-i-f：ttctttgattggratgttgtgc(seqidno.3)；

prrsv-i-r：caaggagctgcttgaygacac(seqidno.4)；

其中，简并碱基r表示a或g，简并碱基y表示c或t。

猪蓝耳病毒三重巢式rt-pcr检测方法的建立，包括以下步骤：

s1、提取待测样品的rna；

s2、第一轮扩增：以s1提取的rna为模板，利用外侧引物进行第一轮扩增，pcr反应体系为：2×1stepbuffer12.5μl，primescript1stepenzymemix1μl，20μmol/l的prrsv-o-f与20μmol/l的prrsv-o-r各1μl，rna模板0.5μl，补加rnasefreedh2o至25μl；pcr反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸8min，pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；

s3、第二轮扩增：以s2扩增产物稀释50倍为模板，利用内侧引物进行第二轮扩增，pcr反应体系为：mix12.5μl，20μmol/l的prrsv-i-f与20μmol/l的prrsv-i-r各1μl，模板1μl，补加rnasefreedh2o至25μl；pcr反应程序为：94℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸8min，pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据检测结果进行判断。

进一步地，s1所述待检测rna从猪的初乳、精液、血清、组织(包括胎盘)或恶露等样品中提取。

进一步地，s2所述目的条带为1124bp，1034bp或731bp。

更进一步地，目的条带为1124bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；目的条带为1034bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；目的条带为731bp，判定样品中含有猪类nadc-30蓝耳病毒。

进一步地，s3所述结果判断具体为：目的条带为1029bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；目的条带为939bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；目的条带为636bp，判定样品中含有猪类nadc-30蓝耳病毒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供了两对带有简并碱基的引物，可一次性检测出所测样品中感染猪蓝耳病毒是经典毒株或高致病性变异毒株或nadc-30，解决了对蓝耳病三种毒株分别检测所带来的耗时、耗材、灵敏性低等缺点。(2)本发明提供的巢式rt-pcr检测引物，是通过编码高度保守的nsp2蛋白基因的碱基序列设计出的4条特异性引物，具有较强的特异性。(3)本发明提供的rt-pcr检测方法，通过多步扩增检测，适用范围宽，最低检测限比普通pcr检测方法灵敏度高2-3个数量级。(4)该检测方法能从混合模板中扩增出特异性条带，干扰性较好，可靠性强；而且还适用于猪的初乳或精液，恶露等样本的检测，具有较强的实用性，利于推广和普及。

附图说明

图1为巢式rt-pcr外侧引物特异性检测的凝胶电泳图，其中m为dl2000dnamarker；1为重组阳性质粒；2为经典蓝耳病毒质粒；3为高致病性蓝耳病毒质粒；4为nadc-30病毒质粒；5-8分别为猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；9为阴性对照(rnase-freewater)。

图2为巢式rt-pcr内侧引物特异性检测的凝胶电泳图，m为dl2000dnamarker；1为重组阳性质粒；2为经典蓝耳病毒质粒；3为高致病性蓝耳病毒质粒；4为nadc-30病毒质粒；5-8分别为猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；9为阴性对照(rnase-freewater)。

图3为巢式rt-pcr外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，m为dl2000dnamarker；1-8中prrsv经典毒株模板拷贝数依次为3.8×10⁷，3.8×10⁶，3.8×10⁵，3.8×10⁴，3.8×10³，3.8×10²，3.8×10¹，3.8；1-8中prrsv变异毒株模板拷贝数依次为1.3×10⁷，1.3×10⁶，1.3×10⁵，1.3×10⁴，1.3×10³，1.3×10²，1.3×10¹，1.3；1-8中prrsv类nadc30毒株模板拷贝数依次为1.6×10⁷，1.6×10⁶，1.6×10⁵，1.6×10⁴，1.6×10³，1.6×10²，1.6×10¹，1.6。

图4为巢式rt-pcr内侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，1-9分别以第一次pcr产物为相应模板；1-8中prrsv经典毒株模板拷贝数依次为3.8×10⁷，3.8×10⁶，3.8×10⁵，3.8×10⁴，3.8×10³，3.8×10²，3.8×10¹，3.8；1-8中prrsv变异毒株模板拷贝数依次为1.3×10⁷，1.3×10⁶，1.3×10⁵，1.3×10⁴，1.3×10³，1.3×10²，1.3×10¹，1.3；1-8中prrsv类nadc30毒株模板拷贝数依次为1.6×10⁷，1.6×10⁶，1.6×10⁵，1.6×10⁴，1.6×10³，1.6×10²，1.6×10¹，1.6。

图5为巢式rt-pcr引物干扰性检测的凝胶电泳图，m为dl2000dnamarker，1为外侧引物扩增混合的基因组，2-5为阴性对照(rnase-freewater)。

图6为巢式rt-pcr引物干扰性检测的凝胶电泳图，m为dl2000dnamarker，1为内侧引物扩增混合的基因组，2-5为阴性对照(rnase-freewater)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。

实施例1：猪蓝耳病毒三重巢式rt-pcr检测方法的建立

一、引物的设计

通过对猪蓝耳病毒的序列分析可知，流行毒株nsp2蛋白氨基酸高度保守，可以作为临床诊断的靶抗原。编码nsp2蛋白的碱基序列，设计得到一对外侧引物和一对内侧引物，所述内侧引物在外侧引物扩增序列内侧。两对引物中含有简并碱基，从而可以扩增出经典毒株、高致病性变异毒株和nadc-30的不同条带，达到一次性检测并区分此三种亚型的目的。其中，两对引物的序列分别为：

prrsv-o-f：aatcttgargaatgcttggc；

prrsv-o-r：gctgagtaytttgggcgtg；

prrsv-i-f：ttctttgattggratgttgtgc；

prrsv-i-r：caaggagctgcttgaygacac；

其中，简并碱基r表示a或g，简并碱基y表示c或t。

二、根据设计的引物建立的猪蓝耳病毒三重巢式rt-pcr检测方法

s1、取样与rna提取

a：样本采集：收集样本血清，3000r/min离心20分钟，取200μl用dna/rna提取试剂盒提取rna，测定浓度备用。

b：组织样品处理：取待检测猪只样本的组织胎盘，剪碎后用rna提取试剂盒提取rna，测定浓度备用。

s2、用外侧检测引物prrsv-o-f、prrsv-o-r进行第一次pcr扩增。pcr反应体系为：2×1stepbuffer12.5μl，primescript1stepenzymemix1μl，20μmol/l的prrsv-o-f与20μmol/l的prrsv-o-r各1μl，rna模板0.5μl，补加rnasefreedh2o至25μl；pcr反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸8min，pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；

s3、用内侧检测引物prrsv-i-f、prrsv-i-r对第一次扩增产物模板进行50倍稀释第二次扩增。内侧引物的最佳扩增条件如下：mix12.5μl，20μmol/l的prrsv-i-f与20μmol/l的prrsv-i-r各1μl，模板1μl，补加rnasefreedh2o至25μl；pcr反应程序为：94℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸8min，pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

第一轮pcr扩增后，电泳检测到目标条带则报告为阳性，且检测样本带毒量较高。具体为：如目的条带为1124bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；如目的条带为1034bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；如目的条带为731bp，判定样品中含有猪类nadc-30蓝耳病毒。若是没有所述的三个目的条带，则进行第二轮扩增。

第二次pcr扩增后，电泳检测到目标条带的也判断为阳性，表明样品带毒量相对较低。具体为：如目的条带为1029bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；如目的条带为939bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；如目的条带为636bp，判定样品中含有猪类nadc-30蓝耳病毒。两轮pcr后检测均无目的条带的则报告为阴性。

实施例2：猪蓝耳病毒的巢式rt-pcr检测试剂盒

一种用于鉴别猪蓝耳病毒并区分经典毒株、高致病性变异毒株或nadc-30等3个亚型的检测试剂盒，所述试剂盒包括：两对检测引物、扩增试剂、阳性对照和阴性对照。其中，两对引物为外侧引物prrsv-o-f、prrsv-o-r和内侧引物prrsv-i-f、prrsv-i-r，阴性对照为rnase-freewater，阳性对照为重组阳性质粒pmd18-t-nsp2。该阳性质粒的构建方法具体如下：

步骤一：nsp2基因的克隆

提取猪蓝耳病毒(prrsv)的基因组rna，以该基因组rna为模板，采用巢式rt-pcr外侧引物prrsv-o-f和prrsv-o-r扩增nsp基因部分保守序列。pcr反应体系(25μl)为：2×1stepbuffer12.5μl，primescript1stepenzymemix1μl，20μmol/l的prrsv-o-f与20μmol/l的prrsv-o-r各1μl，rna模板0.5μl，补加rnasefreedh2o至25μl；pcr反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸8min，pcr产物于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约1124bp、1034bp、731bp的三重特异性dna条带，与目标dna片段大小相符。

步骤二：pmd18-t-nsp2阳性质粒构建

将上述pcr产物用takara公司的胶回收试剂盒回收，然后与takara公司的pmd18-t克隆载体进行连接，连接体系为：pmd18-tvector1μl，pcr回收产物3μl，solutionⅰ5μl，ddh201μl；16℃恒温连接30min后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布amp抗性的lb培养基上；37℃培养过夜，通过抗性筛选出正确的重组子。

步骤三：pmd18-t-nsp2阳性重组子鉴定

用引物prrsv-o-f和prrsv-o-r对挑选的阳性克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定正确的重组子命名为pmd18-t-nsp2。

步骤四：重组质粒pmd18-t-nsp2的提取

测序鉴定正确的重组子用lb肉汤进行增菌后采用takara公司的高纯度质粒小提试剂盒minibestplasmidpurificationkit提取质粒并测定浓度，计算拷贝数。

实施例3：巢式rt-pcr引物的可行性分析

1、特异性试验

提取猪蓝耳病毒(prrsv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组当模板，对巢式rt-pcr所用到的两对引物prrsv-o-f、prrsv-o-r和prrsv-i-f、prrsv-i-r进行特异性检测，检验两对引物的特异性。结果如图1，2所示，两对引物均具有良好的特异性和较高的扩增效率。

2、敏感性试验

对实施例2所获得的阳性质粒进行10倍倍比稀释至个位数拷贝数，选取各稀释度质粒当做模板用引物prrsv-o-f、prrsv-o-r进行第一次pcr扩增，pcr产物用1％琼脂糖胶检测。结果如图3所示，第一次pcr扩增电泳结果显示，外侧引物可检测到prrsv经典毒株基因拷贝数3.8×10²，可检测到prrsv变异毒株基因拷贝数1.3×10²，可检测到prrsv类nadc30毒株基因拷贝数1.6×10²，且扩增特异性好。扩增产物作为相应梯度的模板用引物prrsv-i-f、prrsv-i-r做第二次pcr扩增，扩增产物用1％琼脂糖胶进行检测。结果如图4所示，经过巢式rt-pcr两次扩增后所能检测到的最低10¹个数量级的基因拷贝数。

3、干扰试验

对特异性试验中用到的基因组与蓝耳基因组取等量进行混合，用引物prrsv-o-f、prrsv-o-r和prrsv-i-f、prrsv-i-r分别进行pcr扩增，检验引物的抗干扰性，能否从混合基因组模板中扩增出目的条带。结果如图5和图6所示，两对引物均能从混合模板中扩增出特异性条带，显示引物抗干扰性较好。

4、符合率试验

为验证巢式引物对各地区猪蓝耳病毒检测的敏感性，提取了ch-1r、r98、jxa1-r、gdr180、nadc-30等毒株的基因组，测定浓度后计算出拷贝数，梯度稀释至个位数拷贝数，经过两轮巢式rt-pcr扩增后，各类基因组均能检测到10¹个数量级的基因拷贝数，证明本发明方法切实可行。

实施例4：检测方法的临床试验

1、临床样品采集：2018年11月从湖北某家规模化猪场采集小猪血样20份，3000r/min离心30分钟，收集样本血清，按照takara公司的dna/rna提取试剂盒提取rna。

2、pcr扩增与电泳检测：按实施例1所提供的方法进行两轮pcr扩增。对扩增后的产物进行电泳检测，20份血清样本共检测到13份高致病性蓝耳变异株阳性，4份经典株蓝耳病阳性。测序结果显示17份阳性产物均为猪蓝耳病基因，证明该方法检测的结果具有可靠性，可以推广普及，具有良好应用前景。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110>长江大学

<120>一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式rt-pcr检测引物及方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aatcttgargaatgcttggc20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gctgagtaytttgggcgtg19

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttctttgattggratgttgtgc22

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caaggagctgcttgaygacac21