一种杜冷丁人工抗原及其制备方法与流程

本发明属于生物化工及免疫检测技术领域，具体涉及一种杜冷丁人工抗原及其制备方法。

背景技术：

杜冷丁，也称为哌替啶，地美露；度冷丁；哌替啶，为人工合成的阿片受体激动剂，属于苯基哌啶衍生物，是一种临床应用的合成镇痛药，分子式：c15h21no2，分子量：247，结构式为：

杜冷丁系吗啡的人工代用品，其作用和机理与吗啡相似，具有与吗啡类似的性质。药理作用与吗啡相同，临床应用与吗啡也相同。杜冷丁反复作用可成瘾，不良反应与吗啡相似，被列为严格管制的麻醉药品。

杜冷丁(dolantin)，是一种抗痉挛的止痛药，在1939年时由赫希斯特研发的，专门用于伤口止痛。1940年初，化学家赫希斯特成功地把这种药的效力提升了20倍。长效的u阿片受体激动剂为“杜冷丁”(polamidon)。度冷丁连续使用1-2周便可产生药物依赖性，停药时出现相似于吗啡戒断后的戒断综合症，症状主要有精神萎靡不振、全身不适、流泪流涕、呕吐，腹泻、失眠，严重者也会产生虚脱。震颤、惊厥，对外界刺激的敏感性增强和幻觉。杜冷丁滥用就会成瘾，成为毒品，严重危害人体健康和生命安全。1987年11月28日，国务院发布《麻醉药品管理办法》，将杜冷丁列入其中进行严格管理。

哌替啶类药物的分析检测过去主要依靠高效液相色谱法(hplc),气相色谱(gc)，质谱(ms)等大型分析仪器，这些分析方法存在仪器昂贵，检测费时，需要专业技术人员操作，样品处理步骤繁杂等缺点。免疫分析法克服上述方法的缺陷，具有专一性强、操作简便、检测时间短、不需要专业人员操作及适用于大规模检测等优点,已广泛使用于快速检测各类疾病、毒品滥用和食品安全等项目。

由于杜冷丁是一个小分子，由于其分子质量小(247道尔顿)，只具备免疫反应性，不具备免疫原性，必须将它连结到蛋白质大分子上，借助大分子的t细胞表位刺激机体才能产生抗体特异性免疫应答。目前国内鲜有生物技术公司成功开发出杜冷丁滥用药物的免疫分析法检测试剂和生产这种试剂盒的关键原料(杜冷丁抗原，抗体)，因为杜冷丁人工抗原还依赖高成本和高风险的杜冷丁原药合成工艺，原料杜冷丁受到各国管制，制约了哌替啶类快速检测实际的发展和市场需求，因此研制和开发出一种新的、有效的杜冷丁人工抗原的合成方法是非常必要的。

技术实现要素：

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种杜冷丁人工抗原及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种杜冷丁半抗原，其具有如通式(ⅰ)所示的结构：

其中，m为1-6个碳原子的碳链。

进一步地，m为1-6个碳原子的直链碳链。

本发明还提供了一种杜冷丁人工抗原，其具有如通式(ⅱ)所示的结构：

其中，m为1-6个碳原子的直链碳链，p为载体蛋白。

进一步地，所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白(bsa)、牛γ球蛋白(bgg)、牛甲状腺球蛋白(btg)、钥孔血蓝蛋白(klh)和鸡卵清白蛋白(ova)中的一种。

本发明还提供了一种制备杜冷丁半抗原或人工抗原的方法，以4-苯基哌啶-4-甲腈为主要原料合成。

进一步地，一种制备杜冷丁半抗原的方法，该方法用于制备以上所述的半抗原，包括如下步骤：

a)碘甲烷与4-苯基哌啶-4-甲腈反应制备哌替啶衍生物(2)：以丙酮为溶剂，在碳酸钾催化下，碘甲烷ch3i与4-苯基哌啶-4-甲腈在室温反应，然后进行纯化，得到产物(2)；

b)产物(2)以无水thf为溶剂，经氢化铝锂催化反应，然后加入氢氧化钠溶液，调ph＝8，过滤旋干得到产物(3)；

c)产物(3)与丁二酸酐在吡啶中回流反应得到杜冷丁半抗原(4)。

进一步地，一种制备杜冷丁人工抗原的方法，该方法用于制备以上所述的杜冷丁人工抗原，杜冷丁人工抗原的制备是在杜冷丁半抗原的基础上，制得活性酯，活性酯与载体蛋白发生偶联反应得到。

进一步地，在n,n-二甲基甲酰胺介质中，杜冷丁半抗原与n-羟基琥珀酰亚胺及n,n-二环己基碳二亚胺在室温下反应，制备得到活性酯。

一种抗体，该抗体是采用以上所述的人工抗原免疫动物而获得的。

进一步地，所述的抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。

本发明的有益效果是：

(1)本发明在杜冷丁半抗原合成过程中，巧妙地将4-苯基哌啶-4-甲腈的腈基还原成了氨基，并引入了可用于交联的羧基基团，既保持了杜冷丁主环的特征原貌，引入丁二酸酐，也在侧链保留了杜冷丁侧链上乙酰基官能团，依据这种工艺路线合成出的半抗原，保持了杜冷丁的特征基团原貌，合成出的相应的人工抗原具有良好的特异性。

(2)本发明提供了一种杜冷丁人工抗原及其制备方法，制备工艺简洁，原料来源不受限；所制备的杜冷丁人工抗原可进行动物免疫，得到相应的抗体，抗体特异性强，可用于免疫分析中，适用于各类杜冷丁免疫分析法的研究，以及作为杜冷丁免疫层析试剂盒生产的关键原料供应。

附图说明

图1为本发明中杜冷丁人工抗原的合成路线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。

(1)杜冷丁人工半抗原的制备：

(a)称取500mg(即2mmol)4-苯基哌啶-4-甲腈，加入150ml单口圆底烧瓶中，然后再加入25ml丙酮，1g碳酸钾，431mg(即3mmol)碘甲烷，加入搅拌子，室温下搅拌反应20小时；反应结束后，减压蒸干溶剂，过滤，滤液用3×10ml乙醇提取，再次过滤旋干，得到678mg白色固体产物(2)；薄层色谱法纯化，tlc：层析液为乙酸乙酯，产物rf＝0.5～0.7；

(b)在50ml单口圆底烧瓶中，加入上一步骤(a)得到的固体产物(2)300mg，加入1g的氢化铝锂和15ml的无水thf，氮气保护下，68℃回流反应18小时；停止反应，冷却后加入6.8ml质量分数为38％的氢氧化钠溶液，调ph＝8，过滤旋干，得到258mg油状产物(3)；tlc：层析液为乙酸乙酯，产物rf＝03～0.5；

(c)称取200mg油状物(3)于50ml圆底烧瓶中，加入5ml无水吡啶，再加入141mg(1.41mmol)丁二酸酐搅拌溶解，反应温度逐渐提高至100℃反应20小时；反应结束后自然冷却，进行减压蒸馏得到粗产物，薄层层析法纯化得到188mg半抗原(4)；tlc：层析液为二氯甲烷：体积分数为95％乙醇：浓氨水：1,4-二氧六环＝10:8:1:1，产物rf＝0.4～0.5。

本实施例中，制得的杜冷丁人工半抗原结构为：

其中，m＝1个碳原子。

将丁二酸酐替换成不同碳数的酸酐就可以制得如通式(ⅰ)所示结构的人工半抗原，其中，6＝>m>1个碳原子的碳链。同样地，此结构的杜冷丁人工半抗原，可以进行以下所述步骤，制得杜冷丁人工抗原及相应的抗体。

(2)杜冷丁人工抗原的制备，如图1所示；

a.称取188mg半抗原(4)于50ml圆底烧瓶中，加入8.95mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)，再加入64mg(0.558mmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和114mg(0.558mmol)n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液记为a液。

b.称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0l，得到pbs缓冲液，ph为7.2～7.4。

c.称取0.25g牛血清白蛋白溶于50mlpbs缓冲液中，得到的溶液记为b液。

d.在快速搅拌下，将a液缓慢滴加到b液，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

e.将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述pbs缓冲液透析9次，透析结束后，离心取上清液即得到杜冷丁人工抗原。

以下所述的鉴定实验、检测实验均是针对以上实验步骤制得的杜冷丁人工抗原，其中，m＝1。

将牛γ球蛋白(bgg)、牛甲状腺球蛋白(btg)、钥孔血蓝蛋白(klh)和鸡卵清白蛋白(ova)中的任一种替换牛血清白蛋白(bsa)进行以上所述的步骤，同样地，可以制备得到不同的杜冷丁人工抗原。

(3)杜冷丁人工抗原的鉴定：

偶联比的测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸收系数ε：以pbs缓冲液来配制杜冷丁半抗原溶液，其中，杜冷丁半抗原的浓度分别为0,5,10,20,30,40μg/ml，通过紫外扫描可知，杜冷丁半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样。本发明计算得ε＝4915l/(mol*cm)。

偶联物蛋白浓度的测定：

分别配制浓度为0，10，20，30，40，60，80，100，120μg/ml的牛血清白蛋白pbs溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光度值，绘制牛血清白蛋白浓度与吸光度值的关系曲线。

将杜冷丁人工抗原溶液按一定比例稀释，在655nm处测得杜冷丁人工抗原的吸光度值，从曲线上可以得到杜冷丁人工抗原溶液中的相应蛋白浓度值。本发明计算得杜冷丁人工抗原溶液中的蛋白浓度为3.3mg/ml。

偶联比的测定：配制浓度为100μg/ml的牛血清白蛋白pbs溶液，将偶联物即杜冷丁人工抗原溶液，用pbs缓冲液稀释到杜冷丁人工抗原的浓度为100μg/ml，在276nm处测得吸光度值a1，以pbs缓冲液为空白，测得吸光度值a2，则偶联比率γ为：γ＝[(a1－a2)/ε]/(100×10^-3/65000)，本发明计算得γ≈18。

其中ε为摩尔吸光系数l/(mol*cm)，65000为牛血清白蛋白的分子量，100×10^-3为牛血清白蛋白浓度(μg/ml)。

本发明在杜冷丁半抗原合成过程中，巧妙地将4-苯基哌啶-4-甲腈中的腈基还原成了氨基，并引入了可用于交联的羧基基团，保持了杜冷丁主环的特征原貌，引入丁二酸酐，在侧链保留了杜冷丁侧链上乙酰基官能团；依据这种工艺设计合成出的半抗原，保持了杜冷丁的特征基团原貌，合成出的相应的人工抗原具有良好的特异性。

本发明的杜冷丁半抗原结构式(左)与杜冷丁结构式(右)

抗体的制备

可以用以上制备的杜冷丁人工抗原来免疫动物，例如鼠，兔，或其他哺乳动物来生产多克隆抗体，也可以用杂交瘤细胞来产生单克隆抗体，这些方法是本领域现有公知的技术，在此不再赘述，可以参见一些教科书或免疫手册来获得本发明的抗体或抗体片段(制备和使用抗体-实用手册(makingandusingantibodies-apracticalhandbook).crcpress,2007)。这些抗体可以特异识别人工抗原或者半抗原或者小分子物质，而不能识别其它无关的抗原或者小分子物质。这里所谓“特异性”是指该抗体仅能识别或结合某一特定类型的抗原，而不识别或结合其他类型的抗原。

杜冷丁人工抗原及抗体的应用

本发明合成的杜冷丁半抗原或者杜冷丁人工抗原以及利用他们产生的抗体(此处抗体指的是：单克隆抗体或者多克隆抗体)可以被用来利用免疫检测方法检测样本中是否含有杜冷丁以及一些苯基哌替类药物，这里的样本一般是指哺乳动物或者人的体液样本，例如唾液、尿液、汗液，或者哺乳动物或者人的组织样本，例如肝脏、脾等组织。所述的“免疫检测方法”一般是利用抗体与抗原结合的原理进行的免疫分析或者检测方法，这种免疫检测方法包括酶联免疫(elisa)方法，也包括横向流动(lateralflow)测试试纸的方法，也可以包括竞争方法。

横向流动测试试纸它可以用吸水或者非吸水性材料制成，一个测试条可以使用多种材料，用于液体的传递。测试条的一种材料可以叠加在另一种测试条材料上，例如，滤纸叠加在硝化纤维上。或者，测试条中至少含有一种材料的一个区域位于另一种至少含有一种不同材料的区域之后。在这种情况下，各区域之间液体是流通的，它们之间可以相互叠加或者不叠加。测试条上的材料可以固定在例如塑料衬片的支持物上或者硬质表面，以加强测试条可持力。测试条各区域可按如下排列：加样区，至少一个试剂区，至少一个检测结果区，至少一个控制区，至少一个掺假检测区和液体吸收区。如果检测区包括一个控制区，优选控制区位于检测结果区的被分析物检测区之后。所有这些区或其组合可以在含有一种材料的单一试纸条上。另外，这些区由不同的材料制成，并按液体传递的方向连接在一起。例如，不同区域可以直接或者间接进行液体传递。在本实施例中，不同的区可以沿液体传递的方向末端和末端相连，或沿液体传递方向相互叠加，或者通过其他材料相连接，例如连接介质材料(优选吸水性材料例如滤纸，玻璃纤维，无纺布或硝酸纤维素)。连接材料能够使包含各区域的末端与末端相接的材料、包含各区域的末端与末端相接但液体不流通的材料、或包含各区域相互重叠(例如但不限于从头到尾重叠)但液体不流通的材料，形成液体流通。

除此之外，也可以将本发明的杜冷丁人工抗原制备的抗体用于免疫治疗因为杜冷丁引起的各种疾病，例如，用于治疗杜冷丁成瘾的一种免疫试剂。这样抗体就作为一种药物试剂来使用。

用以上所制备的杜冷丁人工抗原及抗体作为主要原料制成胶体金侧向层析检测试纸条，胶体金侧向层析检测试纸条的制备采用本领域现有公知的技术制备即可；用此试纸条对杜冷丁标准品进行检测，检测样品的使用量为50ul；具体检测数据如表1所示，其中，n表示单个样品重复检测的次数；结果两列的数字分别表示：检测结果为阴性的次数、检测结果为阳性的次数，进一步地，可以得到检测结果的准确率；例如杜冷丁的浓度为0ng/ml表示阴性，30次检测结果全部为阴性，即阴性的检测次数为30，则准确率为100％。

表1检测结果

表1中检测结果表明本发明所制备的杜冷丁人工抗原、抗体具有较高的特异性，抗体对杜冷丁具有很高的灵敏度，本实施例中，灵敏度为100ng/ml，完全符合市场检测的需求；而且也说明本发明制备得到的抗体具有灵敏度高，特异性强等特点。

交叉反应实验：用本发明的杜冷丁人工抗原及抗体作为主要原料制成胶体金侧向层析检测试纸条，对表2中物质的标准品进行检测，样品使用量为50ul。

表2交叉反应结果

注：“+”表示有交叉反应，“-”表示没有反应。

表2的交叉反应结果显示本发明制备得到的杜冷丁人工抗原，抗体具有高度特异性，与其他药物没有交叉反应。