基于酵母自溶结合机械化学法提取酵母β-葡聚糖的方法与流程

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种基于酵母自溶结合机械化学法提取酵母β-葡聚糖的方法。

背景技术：

酵母β-葡聚糖，又可以称为右旋糖酐，是天然的益生元，广泛的分布于真菌、细菌和植物细胞壁，如美洲姬松茸、香菇、灵芝、燕麦等当中。不仅在各种生物体内发挥多种生物学活性，而且在各种生物间的相互影响中也起着十分重要的作用，是发挥保健作用的主要功效成分。目前研究发现其具有抗肿瘤、抗辐射、降血脂、降胆固醇、调节血糖和预防心血管疾病、修复细胞、改善肠道等作用，作为高效的生物反应调节因子(brm)，是近年来的研究热点。

葡聚糖被发现于许多细菌、真菌和高等植物中。研究发现，酿酒酵母中就存在着很多的β-葡聚糖，存在于姬松茸中的β葡聚糖最为丰富，且生物活性相对较高。β-葡聚糖占据了酵母细胞壁的很大一部分，占比大约为30％～60％。酵母β-葡聚糖属于结构多糖，连接着细胞的原生质体膜，位于细胞壁的最里侧。它能够维持细胞正常的生理形态，保证细胞壁的机械结构。

细胞自溶是由于在特定条件下触发了细胞能消化自身结构的自溶酶的分解作用所致，一般分为诱导自溶和自然自溶，酵母细胞自溶属于内自溶，主要作用酶类为蛋白酶，细胞壁成分很少水解，而内部成分如多糖、蛋白质等可以随着自溶过程而流出细胞外，酵母菌的细胞壁较厚，约1.2μm，在特地特定条件下，酵母细胞内的自溶酶原被激活，并与相应的底物作用，胞内的生物大分子降解，并在细胞内积累，当生物大分子被水解成能通过细胞壁的小分子，水解产物扩散至胞外介质。随着自溶作用的进行，水解酶类本身也发生自身消化，水解自溶活性随之下降，最后趋向于零，并导致自溶作用的结束。合理利用酵母本身自溶作用对于提高葡聚糖产业的综合效益，减少后续提取步骤以及提高产品纯度均有一定的意义。

传统的溶剂制备酵母β-d-葡聚糖的方法，主要有酸法浸提、碱法浸提、酸碱结合法浸提、有机溶剂浸提、超声波提取以及酶法提取等等。其提取速率取决于溶剂扩散到原料颗粒以及bac通过细胞壁或细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)的释放速度。虽然有一些先进的提取技术如超声波辅助萃取、微波辅助萃取和超临界流体萃取目前已经得到迅速发展，不仅酸碱用量大，耗费时间长，容易污染环境，而且会引起多糖分子的降解，缩短设备寿命，而且酵母β-d-葡聚糖功能活性受分子量的影响较大，传统的提取方法会引起提取的β-d-葡聚糖生理活性不高。物理方法制得的多糖对环境污染小，但是纯度较低，酶法制得的得率和纯度都较传统方法高，但是酶本身作为蛋白质对于反应来说属于外来添加的杂质，为后期除杂带来困扰，同时酶的价格昂贵，难以运用到产业化的生产规模。

新型无溶剂机械化学萃取技术(或固态机械化学萃取)已经开发并成功应用在部分天然植物的萃取上。高强度机械力下固态试剂和原料的分散度增加，反应的总接触面积迅速增大，机械化学剪切力对细胞壁造成极强的物理破坏，可以使位于细胞壁内侧的葡聚糖尽可能的暴露出来，而目标化合物通过选择性地与固相试剂反应加大提取率。因此也能进一步改善目标产物在水或其他无毒有机溶剂中的溶解度。

机械化学(mechanochemistry)是一种研究在机械力作用下，通过挤压、剪切、摩擦等手段，诱发物质物理化学性质发生变化的边缘学科。机械化学是化学的分支，对着机械行业的发展以及各种高能研磨设备的不断出现，使机械化学在各方面得到了广泛的应用，其在机械合金化、原料合成与制备、粉体表面改性等方面得到广泛应用，在天然产物的提取与纯化方面也显示出独特的优势。将机械化学法用于天然物质改性及植物有效成分提取，使近年来发展起步的一个新的应用领域，使一种新型的无有机溶剂提取技术。将机械化学的原理和方法引入到天然生物有效成分的提取，形成了机械化学提取技术(mechanochemicalextraction)，将生物组织与固相试剂混合，经超细粉碎后形成凝聚状态，在机械力诱发下，有效成分与固相试剂发生化学反应，使内容物更加容易溶出。

机械化学作为一门新兴的学科，机械化学技术与我国传统提取工艺相结合，不但从根本上彻底改变了提取原理，简化了提取工艺，同时大大降低了生产成本，减少了有机溶剂的消耗，干净无污染，属于新型的环境友好型技术。机械化学技术在动植物有效成分的提取，将为发展重要现代化产业开辟新的道路。

目前已有的提取制备酵母β-葡聚糖的专利虽然制备得到一定纯度和高得率的葡聚糖，但n如cn101020915通过高压均质进行破壁处理并用蛋白酶解得到纯度≥93％的酵母葡聚糖，此法对设备的要求较高并且需要搅拌抽提5-8小时，整个提取过程耗费时间长，对仪器损耗也大。cn105925640a利用酶法联合酸解提取制备酵母葡聚糖可以使葡聚糖产率醉最高达25.8％。cn106008741a也利用酶法联合酸解提取制备酵母葡聚糖制备得到较高纯度葡聚糖。但所取的酸解条件为65-120℃下酸解1-5小时，酸试剂耗费量大且过程耗时长，合理利用酵母细胞自溶机制，有利于找到一种大大压缩提取时长、降低试剂消耗并且环境友好的葡聚糖提取新工艺。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种基于酵母自溶以及机械化学辅助提取酵母β-葡聚糖的方法，通过在采用溶剂提取法之前增加机械化学法辅助破壁以及酵母自溶环节，极大缩短了后续的溶剂提取时间，减少酸碱试剂的用量，提高了效率与产量，保护环境，同时除去了一些水溶性的蛋白质和小分子，使酵母葡聚糖产物纯度更高，该工艺简便可行，为其相关制剂和应用奠定了基础。

本发明采用的技术方案是：

一种基于酵母自溶以及机械化学法辅助提取酵母β-葡聚糖的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1)自溶预处理：将高活性干酵母与提取助剂混合后，添加纯水搅拌自溶，所得自溶混合液离心，去上清得到较干净的酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照一定比例混合后，在一定转速下球磨一定时间得到细粉；

步骤3)溶剂提取：经过自溶预处理和球磨破壁的酵母粉经稀碱提取、蛋白酶纯化，调节ph至3.0～9.0，依次采用醇类溶剂和醚类溶剂洗涤数次，干燥得到酵母β-葡聚糖。

在本发明一些实施例中，球磨转速为20-500rpm，优选20-100rpm。

在本发明一些实施例中，球磨时间为10-50min，优选30-40min。

在本发明一些实施例中，所述的提取助剂选自nacl、nachco3、na2co3中的一种或者两种以上，添加纯水后所述提取助剂的质量浓度为2-10％，优选2-5％，更优选3％。

在本发明一些实施例中，稀碱提取采用二次碱提，二次碱提均采用naoh溶液，二次提取法的稀碱浓度分别为4％、3％。

在本发明一些实施例中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶中的一种或多种。

在本发明一些实施例中，所述步骤2)中蛋白酶纯化后调节ph至4.0-7.0；优选为6～7。

在本发明一些具体实施例中，该方法具体包括如下步骤：

步骤1)自溶预处理：将含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与提取助剂混合后，添加纯水搅拌自溶，ph为4.0～7.0，温控及搅拌自溶，在40-50℃下控温搅拌提取8-36h，所得提取液3000rpm离心，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠混合后，经20-700rpm球磨处理20-50min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh溶液、3％naoh溶液提取，所得提取液3000rpm离心，得到沉淀，经蛋白酶纯化，调节至ph为6.0～7.0后，依次采用无水乙醇、无水乙醚洗涤后，产物经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖。

本发明通过以上方法获得高纯度的酵母β-葡聚糖，本发明所述的酵母β-葡聚糖外观呈淡黄色，颗粒状，且本发明获得酵母β-葡聚糖持水性、凝胶强度高；经过结构表征，本发明制备的酵母β-葡聚糖经结构表征和分析为β-1,3-和β-1,6-糖苷键连接的β-型葡聚糖。

本发明的另一个目的在于将本发明获得的酵母β-葡聚糖用于制备治疗或者预防便秘、改善肠道菌群疾病药物、食品或者保健品；在本发明一些具体活性试验例中，取balb/c小鼠30只，总共3组，每组10只，雄性，体重18～22g，连续4周灌胃葡聚糖(10mg/kg体重，来自实施例1-8)，双歧杆菌益生菌(30mg/kg体重)，模型组和空白组不做处理，灌胃等体积生理盐水。四周后，葡聚糖组和模型组灌胃盐酸洛派丁胺(10mg/kg)5天，空白组(no组)不造模，用生理盐水做相同处理。记录各组小鼠的日常行为情况。取粪便样品用于16srrna高通量测序，并通过pcoa和pls-da等进行数据分析；结果发现，本发明获得的酵母β-葡聚糖可以显著提高小鼠肠道中粘液性细菌mucispirillumschaedleri和丁酸弧菌butyricimonasvirosa的相对丰度，显著减少变形杆菌proteushauseri和罗氏杆菌helicobacterwinghamensis相对丰度，表明葡聚糖对洛派丁胺造成的小鼠肠道菌群紊乱有调节作用；此外本发明的发明人发现葡聚糖调节结肠中异常的苯丙氨酸代谢和甘油磷脂代谢通路，调节心脏组织中的淀粉和蔗糖代谢通路，调节精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和酪氨酸代谢通路，以及肝脏组织中脂质代谢通路，此代谢通路表明葡聚糖通过改善小鼠糖脂代谢和氨基酸代谢途径来保护便秘小鼠的肠道损伤和菌群失衡。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明在溶剂提取法之前添加了自溶以及机械化学方法辅助破壁环节，合理控制介质条件，利用酵母细胞自身的酶系活化来水解破坏细胞壁，最大限度的促使酵母自溶，增加细胞壁和细胞膜的通透性，利于细胞内容物的流出提高产品纯度；

2.本发明在溶剂提取法之前添加了机械化学方法辅助破壁环节，机械化学将机械力和化学反应相结合，通过强大的剪切、摩擦、冲击、挤压等手段，对固体、液体等凝聚态物质施加机械能，诱导其结构及物理化学性质发生变化促使细胞壁破碎；

3.由于自溶以及机械化学方法辅助破壁环节，本发明大大缩短了酸碱提取的反应时间，节省试剂成本，减少对环境的污染，保护环境，提高了产品得率；

4.本发明对面包酵母自溶条件进行了优化，为后续其他副产品的开发提供了参考；本发明建立了先自溶，再机械化学辅助破壁后溶剂提取的酵母β-葡聚糖的高效制备新工艺，这样不仅显著性简化了提取步骤，减少了提取时间，大大降低了酸碱试剂的用量，而且提高了化合物的纯度，为酵母β-葡聚糖相关制剂开发及应用奠定基础。

5.本发明制备的酵母β-葡聚糖具有调节肠道微生态平衡、抗病毒、抗肿瘤的保健效果，也有提高免疫力的功效。

附图说明：

图1是本发明实施例的工艺流程图；

图2是本发明实施例1中的酵母β-葡聚糖的水解hplc图谱。

图3是本发明实施例1中的酵母β-葡聚糖的uv图谱。

图4是本发明实施例1的酵母β-葡聚糖的ftir图谱。

图5是本发明实施例1中面包酵母β-葡聚糖的最佳提取工艺图。

图6是本发明实施例1对动物肠道菌群的影响图。

图7是本发明实施例2对动物肠道菌群的影响图。

图8是本发明实施例3对动物肠道菌群的影响图。

图9是本发明实施例4对动物肠道菌群的影响图。

图10是发明实施例5对动物肠道菌群的影响图。

图11是发明实施例6对动物肠道菌群的影响图。

图12是发明实施例7对动物肠道菌群的影响图。

图13是发明实施例8对动物肠道菌群的影响图。

图14是空白对照组动物肠道菌群的影响图。

图15是便秘模型组动物肠道菌群的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明方案进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与nahco3混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：3，ph为5.0，温控及搅拌自溶，在30℃下控温搅拌提取8h，所得提取液3000rpm离心，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：5混合后，经75rpm球磨处理30min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心15min，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心，得到沉淀用冰乙酸调节ph至4.5，3000rpm离心20min，去上清，经过纤维素酶纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到的高纯度酵母葡聚糖的多糖含量达到84.649％，葡聚糖的得率达到18.66％。

实施例2

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与氯化钠混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：4，ph为4.0，温控及搅拌自溶，在40℃下控温搅拌提取12h，所得提取液3000rpm离心15min，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：4混合后，经50rpm球磨处理60min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心15min，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心15min，经过木瓜蛋白酶纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph6.0-7.0，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到的高纯度酵母葡聚糖的多糖含量达到81.418％，葡聚糖的得率达到21.43％。

实施例3

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与提取助剂混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：4，ph为4.0，温控及搅拌自溶，在50℃下控温搅拌提取24h，所得提取液3000rpm离心15min，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：5混合后，经20rpm球磨处理60min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心15min，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心15min，经过木瓜蛋白酶纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到酵母β-葡聚糖纯度为88.906％，葡聚糖的得率达到23.40％。

实施例4

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与na2co3混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：5，ph为5.0，温控及搅拌自溶，在60℃下控温搅拌提取24h，所得提取液3000rpm离心15min，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：7混合后，经100rpm球磨处理75min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心，得到沉淀用冰乙酸调节ph至4.5，3000rpm离心20min，去上清，沉淀用200ml蒸馏水洗出，100℃水浴20min，3000rpm离心20min，经过复合酶(纤维素酶与木瓜蛋白酶1：1混合得到)纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到的高纯度酵母葡聚糖的多糖含量达到80.071％，葡聚糖的得率达到17.43％。

实施例5

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与nacl混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：5，ph为6.0，温控及搅拌自溶，在60℃下控温搅拌提取36h，所得提取液3000rpm离心，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：7混合后，经200rpm球磨处理75min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心15min，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心15min，得到沉淀用冰乙酸调节ph至4.5，3000rpm离心20min，去上清，沉淀用200ml蒸馏水洗出，电动搅拌棒搅拌15min，100℃水浴20min，3000rpm离心20min，经过复合酶(纤维素酶与木瓜蛋白酶3：7混合得到)纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到的高纯度酵母葡聚糖的多糖含量达到81.418％，葡聚糖的得率达到22.186％。

实施例6

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与nacl混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：6，ph为6.0，温控及搅拌自溶，在70℃下控温搅拌提取36h，所得提取液3000rpm离心，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：9混合后，经300rpm球磨处理90min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心15min，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心15min，得到沉淀用冰乙酸调节ph至4.5，3000rpm离心20min，去上清，沉淀用200ml蒸馏水洗出，电动搅拌棒搅拌15min，100℃水浴20min，3000rpm离心20min，经过复合酶(纤维素酶与木瓜蛋白酶4：6混合得到)纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到的高纯度酵母葡聚糖的多糖含量达到85.498％，葡聚糖的得率达到22.339％。

实施例7

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与nahso3混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：6，ph为7.0，温控及搅拌自溶，在80℃下控温搅拌提取48h，所得提取液3000rpm离心，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：10混合后，经400rpm球磨处理90min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心，得到沉淀用冰乙酸调节ph至4.5，3000rpm离心20min，去上清，沉淀用200ml蒸馏水洗出，电动搅拌棒搅拌15min，100℃水浴20min，3000rpm离心20min，经过复合酶(纤维素酶与木瓜蛋白酶1：4混合得到)纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到的高纯度酵母葡聚糖的多糖含量达到82.914％，葡聚糖的得率达到22.479％。

实施例8

步骤1)自溶预处理：将30g含水率不大于12％的干燥高活性耐糖面包酵母与nacl混合后，添加纯水搅拌自溶，料液比1：7，ph为8.0，温控及搅拌自溶，在80℃下控温搅拌提取48h，所得提取液3000rpm离心，倾倒去上清得到酵母细胞壁；

步骤2)球磨破壁：所得酵母细胞壁与球磨珠按照球料比1：10混合后，经500rpm球磨处理120min后得到细粉；

步骤3)溶剂提取：将步骤2)获得的酵母细胞壁依次经4％naoh100℃剧烈搅拌1小时，冷却至40-50℃后，3000rpm离心，倾倒去上清，加3％naoh重新悬浮100℃维持15min，3000rpm离心，倾倒去上清，再加3％naoh重复一次，所得提取液3000rpm离心，得到沉淀用冰乙酸调节ph至4.5，3000rpm离心20min，去上清，沉淀用200ml蒸馏水洗出，电动搅拌棒搅拌15min，100℃水浴20min，3000rpm离心20min，经过复合酶(纤维素酶与木瓜蛋白酶1：4混合得到)纯化和100-300ml无水乙醇和无水乙醚分别洗涤脱水数次，最后调节至适当ph，沉淀得到产物，经冷冻干燥得到酵母β-葡聚糖成品。得到的高纯度酵母葡聚糖的多糖含量达到85.372％，葡聚糖的得率达到23.562％。

实施例9

如图5所示，将球料比、球磨时间、球磨转速、步骤1)中的水溶液ph、料液比以及提取温度作为考察因素，通过单因素试验发现，自溶料液比为1:4、自溶ph为4、自溶时间24h，自溶提取温度为50℃，球磨球料比为1:5、球磨时间60min、球磨转速为20rpm，获得酵母葡聚糖的多糖含量较高。

如下详细介绍对使用本发明提供的方法制作的酵母β-葡聚糖进行结构表征和含量测定、溶解性实验、uv以及ftir官能团测定、hplc以及纯度及特征峰检测。

试验例1溶解性实验

取酵母葡聚糖10mg在室温20℃和高温80℃下加到不同溶剂(纯水、发烟盐酸、1m氢氧化钠、无水乙醇、石油醚、丙酮、dmso以及浓硫酸)中，观察其溶解性并记录。

表1酵母葡聚糖溶解度

试验例2含量测定

称取样品10mg，先用5ml8mol/l的h2so4水解5min后，加水稀释至1.5mol/l，于100℃下水解3h，冷却至室温后，定容至250ml，称取1.0ml按苯酚硫酸法进行测定。

式中，x——β-d-葡聚糖含量；

c——样品水解液中葡萄糖浓度，g/ml；

v——样品水解液定容体积；

m——被测样品的质量，g；

f——0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的系数。

试验例3得率测定

酵母葡聚糖的提取率计算：按照该方法制备样品溶液，根据分光光度法测定样品浓度。按照公式计算酵母多糖的提取率。

式中：y——酵母多糖的提取率，％；

m——分光光度计检测得到的酵母多糖的质量，g；

m——面包酵母粉干重，g。

试验例4ftir

制样方法：kbr压片法；仪器：ft-irspectrometer,傅里叶变换红外光谱仪；型号：nicoletnexus470，dtgs检测器；扫描次数：32次，分辨率：4cm^-1

试验例5hplc

称取10mg多糖样品于具塞试管中，加入2ml2mol/l硫酸溶液于121℃水解1h，冷却后加入4mol/lnaoh溶液2ml中和，离心，取上清液。取1ml水解样液，加入0.5mol/lpmp甲醇溶液1ml和0.3mol/lnaoh溶液1ml，在70℃下水浴反应30min，冷却至室温后加入0.3mol/lhcl溶液1ml，混匀后加入等体积氯仿萃取三次，弃去有机层，水层稀释后过0.45μm膜，供hplc分析。

酵母β-葡聚糖水解提取物hplc的色谱条件：采用aglient-c18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相采用0.1％冰乙酸(a)-乙腈(b)，等度洗脱，0～35min；柱温35℃；检测波长为250nm、210nm；流速1.0ml/min；进样量：10μl。检测时间为35min。

试验例6肠道菌群调节及免疫活性实验

将实施例1-8制备的酵母β-葡聚糖进行小鼠肠道菌群调节及免疫活性实验。

长期的肠道酸性环境促进了益生菌的生长，维持肠道内益生菌的菌群优势，有机酸和益生菌共同作用改善了肠粘膜的功能，增强了肠道的自我调节功能，而服用过程中产生的大量有机酸以及co2和h2等气体，导致了肠道内ph值下降，渗透压升高，增强了局部黏膜的蠕动反射而增加肠蠕动，减少了肠道内物体与肠黏膜的接触，从而减少了肠内水分的吸收，使粪便变得稀软，促进了肠管蠕动，保持大便通畅，缓解便秘。同时酵母葡聚糖可以作为结肠微生物的发酵底物，恢复失衡的肠道菌群并维持肠道菌结构起到关键作用。

取balb/c小鼠30只，总共3组，每组10只，雄性，体重18～22g，连续4周灌胃葡聚糖(10mg/kg体重，来自实施例1-8)，双歧杆菌益生菌(30mg/kg体重)，模型组和空白组不做处理，灌胃等体积生理盐水。四周后，葡聚糖组和模型组灌胃盐酸洛派丁胺(10mg/kg)5天，空白组(no组)不造模，用生理盐水做相同处理。记录各组小鼠的日常行为情况。取粪便样品用于16srrna高通量测序，并通过pcoa和pls-da等进行数据分析。

测试结果见图1-8。

在所有样品中，鉴定了11个主要菌门，模型组小鼠肠道菌群中脱铁杆菌deferribacteres、拟杆菌门bacteroidetes、变形菌门proteobacteria以及螺旋体门spirochaetes丰度下降，而厚壁菌门firmicutes和放线菌门actinobacteria等数量增多。厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度上升，而脱铁杆菌门丰度明显低于空白组，葡聚糖给药后显著性改善失调的肠道菌群结构。

基于种的水平发现，葡聚糖可以显著提高小鼠肠道中粘液性细菌mucispirillumschaedleri和丁酸弧菌butyricimonasvirosa的相对丰度，显著减少变形杆菌proteushauseri和罗氏杆菌helicobacterwinghamensis相对丰度。通过饼状图可以表明模型组样本与空白对照组样本很好的分离，而给药组分布于模型组与空白对照组之间，表明葡聚糖对洛派丁胺造成的小鼠肠道菌群紊乱有调节作用。葡聚糖发挥通便及改善肠道菌群的作用主要通过以下几方面：调节机体免疫应答，增强免疫，抑制促炎因子的分泌，改变便秘个体的肠道菌群组成。其相互作用和引发便秘的可能机制解释如下：微生物群对免疫应答具有重要影响，并且慢性炎症是便秘确定的风险因素。可能是由于结肠黏膜持续暴露于肠道微生物群及其代谢产物，免疫反应的细菌刺激有可能引起连续的低度炎症。通过分析肠道微生物多样性可以得出，洛哌丁胺导致小鼠便秘以后，会抑制肠道内有益微生物的生长，而有害微生物增加，且葡聚糖受到结肠微生物发酵代谢后帮助有益菌的定植，从而使得有害菌的数量和多样性得到控制。

对代谢通路的分析发现，葡聚糖调节结肠中异常的苯丙氨酸代谢和甘油磷脂代谢通路，调节心脏组织中的淀粉和蔗糖代谢通路，调节精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和酪氨酸代谢通路，以及肝脏组织中脂质代谢通路。表明葡聚糖通过改善小鼠糖脂代谢和氨基酸代谢途径来保护便秘小鼠的肠道损伤和菌群失衡。