一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母菌株，属于分子生物学和微生物 学领域。
【背景技术】
[0002] 酵母是最为重要的工业微生物之一，尤其在啤酒生产领域，被誉为啤酒生产的灵 魂。然而近年来，酵母在啤酒生产的过程中，伴随着自然老化所发生的酵母自溶现象严重的 影响了啤酒的风味稳定性、泡沫稳定性等品质，因此改善酵母的自溶性能是啤酒生产领域 一个亟待解决的问题。
[0003] 目前，针对防止酵母自溶的问题的研宄多数集中于改善啤酒生产工艺，少数通过 优化菌种来改善。由于技术和条件的限制，人们对酵母自溶机理的认识并不透彻，使得目前 的这些解决方案往往无法从根本上解决问题。
[0004] 本发明针对1，3-β -葡聚糖，通过过表达该物质的合成基因 fksl来增加葡聚糖的 合成量，改变细胞壁的厚度，从而改善酵母菌的自溶性能。本发明证明可以通过改变葡聚糖 的含量来调控酵母的自溶，该方法为更好的控制和利用酵母自溶现象提供了新思路，获得 的菌株在改善啤酒品质方面有着很好的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明首先提供了一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No. 9628,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研宄所。
[0006] TEM切片分析、抗逆性分析、模拟自溶实验及SEM分析结果表明，本发明提供的酿 酒酵母相比野生菌，抗自溶的性能明显提高，且能耐受50ng/mL米卡芬净、8%的乙醇、0.4M NaCl和无菌水中饥饿培养24h。
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种增强酿酒酵母抗自溶能力的方法，是 通过过表达编码1，3-β -葡聚糖合成酶的基因 fksl来增加葡聚糖的合成量，从而改变细胞 壁的厚度，改善酵母菌的自溶性能。
[0008] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种获得所述酿酒酵母CGMCC No. 9628的 方法，是以酿酒酵母基因组中具有多拷贝数的ISSrDNA作为同源重组整合位点，将强启动 子 PGK1(SEQ ID NO. 1)、抗性筛选基因 KanMX(SEQ ID NO. 2)以及 fksl(SEQ ID NO. 3)基因 连接整合入酵母的基因组，通过G418抗性筛选获得阳性转化子。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：（1)扩增酿酒酵母基 因组中的18SrDNA-上游、18SrDNA-下游、PGKl及fksl，以pUG6质粒为模板扩增KanMX片 段；（2)将获得的各个片段通过亚克隆的方式分别与PMD-19T载体连接，最终通过双酶切获 得目的片段；（3)采用醋酸里化学转化方法将该目的片段导入酵母细胞，通过同源重组整 合入酵母基因组中，以G418抗性影印平板的方式筛选阳性转化子。
[0010] 通过TEM切片分析、抗逆性分析、模拟自溶实验及SEM分析，本发明的酿酒酵母 CGMCC No. 9628的抗自溶的性能明显优于原始菌株，结果如图3、4、5、6及表1、2所示。与现 有其他改善酵母自溶现象的方法相比，本发明建立了 1，3-β -葡聚糖含量和酵母自溶性能 之间的关系，可从根本上解决酵母自溶的问题。本发明提供的酿酒酵母将能更好地用于啤 酒酿造及相关食品行业。
[0011] 生物材料保藏
[0012] 一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9628,保藏地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
【附图说明】
[0013] 图1为构建fksl基因过表达质粒的全过程。
[0014] 图2为采用不同引物对重组菌基因组PCR的电泳结果；A :泳道M为maker2000,泳 道1为过表达重组菌，泳道2为野生菌，泳道3为空白对照；B :泳道M为maker2000,泳道1 为过表达重组菌CGMCC No. 9628,泳道2为野生菌，泳道3为空白对照。
[0015] 图3为重组菌与野生菌的TEM分析（a、c图为重组菌，放大倍数相同；b、d图为野 生菌，放大倍数相同）。
[0016] 图4为重组菌与野生菌的平板抗逆性分析结果。
[0017] 图5为重组菌与野生菌的模拟自溶实验结果（选取模拟自溶12h、24h、36h、48h、 60h、84h、108h的样品，三角形：过表达重组菌CGMCC No. 9628 ;正方形：野生菌；圆形：敲除 重组菌）。
[0018] 图6为模拟自溶实验过程中重组菌与野生菌的扫描电镜（a、b为野生菌，c、d为重 组菌）
【具体实施方式】
[0019] 1，3-β -葡聚糖含量的测定方法如下：1. Omol/L氢氧化钠溶液100mL，加入酵母泥 5g，在90°C下反应3h。3000g离心15min，沉淀物水洗2次，然后用无水乙醇洗涤后蒸馏水 定容。取0. ImL样品+1. 9mL蒸馏水+4. OmL刚果红，混勾，于20°C精确保温10min，于550nm 测吸光值。以2. OmL蒸馏水+4. OmL刚果红做空白。
[0020] β -葡聚糖含量（mg/L) =ΑΧΚΧ1/νΧ20
[0021] A-试样吸光值；
[0022] K-标准曲线上吸光度为1时对应的β -葡聚糖μ g数；
[0023] V-吸取稀释试样体积的毫升数；
[0024] 20-试样稀释倍数。
[0025] 实施例Ifksl基因过表达质粒的构建
[0026] 以酿酒酵母模式菌株W303 (模式菌株）为宿主菌，提取其基因组，通过PCR扩增所 需片段：18SrDNA-up、18SrDNA-down、PGKl及fksl，以pUG6质粒为模板扩增KanMX片段。将 获得的各个片段通过亚克隆的方式分别与PMD-19T vector连接，最终通过双酶切获得目的 片段。分子操作全过程如图1所示。
[0027] 实施例2重组酵母菌的构建与验证
[0028] 采用醋酸里化学转化方法将该目的片段导入酵母细胞，通过同源重组整合入酵母 基因组中，以G418抗性影印平板的方式筛选转化子。结果如图2所示。提取转化子基因组， 设计引物1、2来筛选验证阳性转化子，其中引物1截取ISSrDNA中间部分作为上游引物， PGKl中间位置作为下游