引物，若扩增成功则有1270bp ;引物2截取KanMX与18SrDNA各自 中间位置作为上下游引物，若成功则有975bp条带。
[0029] 所得阳性转化子于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9628,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0030] 实施例3重组菌株TEM分析
[0031] 为了直观的观察菌株的细胞壁变化，重组菌与野生菌细胞的切片在透射电镜下进 行了观察。图3显示重组菌的细胞壁较野生菌明显增厚。经计算，野生菌的细胞壁厚度约 200nm，重组菌CGMCC No. 9628的约为500nm，是野生菌的两倍之多。细胞壁厚度的增加源 于1，3-β-葡聚糖含量的积累，重组菌CGMCC No. 9628细胞壁中的1，3-β-葡聚糖的含量 较野生菌提高了 62. 51%，该结果证明了基因过表达方法的良好效果。
[0032] 实施例4重组菌株抗逆性分析
[0033] 在啤酒的生产过程中，酵母会受到来自于环境的各种压力，溶氧、渗透压、高乙醇 浓度、饥饿压力等。为检验菌株的抗逆性，首先将重组菌CGMCC No. 9628与野生菌分别在 28°C下于YH)液体培养基中培养20h，然后离心收集细胞，用0. 9%的生理盐水将菌浓调节 至OD = 1. 0。最后采用10倍稀释梯度的方式点种于含有适当浓度的乙醇、NaCl、米卡芬净 的Yro平板。培养结果如图4所示。表明重组菌对环境的各种压力条件有着更高的抵抗能 力。这种表象和菌株细胞壁的葡聚糖成分增加有着直接的联系，也从侧面证明了该过表达 方法的有效性。
[0034] 实施例5重组菌株模拟自溶实验及SEM分析
[0035] 模拟自溶实验是评价酵母自溶性能的最直接依据。将酵母在0. lmol/L柠檬酸缓 冲液（1L:10. 507g柠檬酸+14. 705g柠檬酸钠）即模拟自溶液中于150rpm条件下28°C培养， 定期取样，测定样品的酵母细胞死亡率及A26tlA 28tl，这两组数据分别反映了不同菌株的生长 状况，同时也可以作为评价酵母自溶性能的辅证，结果见表1、2(表中W303代表出发菌株， Fksl-KT代表过表达fksl的菌株，Fksl-QT为将fksl基因敲除后的酿酒酵母菌株）。然而， 最重要的指标是两者的比值，即（A 26tlA28tl)/酵母细胞死亡率，随着酵母自溶程度的增加，该 比值逐渐减小，如图5所示，重组菌CGMCC No. 9628的A26tZA28tl高于野生菌及敲除了 fksl的 菌种，重组菌的自溶性能，也就是抗自溶的能力明显优于野生菌。同时，实验中选取模拟自 溶60h的酵母细胞进行SEM观察，结果如图6所示，重组菌CGMCC No. 9628生长状况良好， 抗自溶性能明显优于原始菌株，该结果表明已成功构建一株抗自溶性能良好的酵母菌株。 Fksl-QT为将fksl基因敲除后获得的酿酒酵母菌株，通过三者的对比更能说明问题。
[0036] 模拟自溶实验方法如下：1)酵母细胞死亡率的测定：定时对自溶液取样，适当稀 释后与等量〇. 1 %美蓝染色液混匀染色5min后加到血球计数板上镜检，蓝色为死细胞无色 为活细胞，记录细胞总数和死细胞数，酵母死亡率=死细胞数/细胞总数*100% ;2)'。和 八28。的测定与比值计算：取一定量的缓冲液过滤分别测滤液在260nm和280nm处的分光光度 值，计算A26(l/A28(l比值，DNA纯品的A 26(|/48(|为1. 8,若比值高则说明含有RNA，比值低说明有 残余蛋白质的存在。
[0037] 表1不同菌株在模拟自溶液中死亡率随时间的变化
[0038]
【主权项】
1. 一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，于2014年9月1日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9628,保藏地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
2. -种获得权利要求1所述酿酒酵母CGMCC No. 9628的方法，其特征在于，是以酿酒酵 母基因组中具有多拷贝数的ISSrDNA作为同源重组整合位点，将强启动子PGK1、抗性筛选 基因KanMX以及fksl基因连接整合入酵母的基因组，通过G418抗性筛选获得。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：（1)扩增酿 酒酵母基因组中的18SrDNA上下游的基因、PGK1及fksl，以pUG6质粒为模板扩增KanMX片 段；（2)将获得的各个片段通过亚克隆的方式分别与PMD-19T载体连接，最终通过双酶切获 得目的片段；（3)采用醋酸里化学转化方法将该目的片段导入酵母细胞，通过同源重组整 合入酵母基因组中，以G418抗性影印平板的方式筛选阳性转化子。
4. 一种增强酿酒酵母抗自溶能力的方法，其特征在于，是通过过表达编码1，3-0 -葡 聚糖合成酶的基因fksl来增加葡聚糖的合成量，从而增加细胞壁的厚度，改善酵母菌的抗 自溶性能。
5. -种使酿酒酵母细胞壁增厚的方法，其特征在于，是通过过表达编码1，3-0 -葡聚 糖合成酶的基因fksl来增加葡聚糖的合成量，从而增加细胞壁的厚度。
6. 权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No. 9628的应用。
7. 权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No. 9628在啤酒酿造中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株具有优良抗自溶性能的酿酒酵母菌株，属于分子生物学和微生物学领域。该菌于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9628，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株相对于原始菌株细胞壁增厚一倍，能耐受50ng/mL米卡芬净、8％的乙醇、0.4M NaCl和无菌水中饥饿培养24h，模拟自溶实验数据及60h的扫描电镜结果均显示重组菌株的自溶性能明显优于原始菌株。本发明为更好地控制和利用酵母自溶现象提供了新思路，获得的菌株在改善啤酒风味、泡沫稳定性等品质方面有着很好的应用价值。CGMCC No.962820140901
【IPC分类】C12N15-81, C12N1-19, C12C11-00, C12R1-865
【公开号】CN104531544
【申请号】CN201410790020
【发明人】李崎, 李佳, 王金晶, 李永仙, 朱林江, 刘春凤, 郑飞云
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月18日