专利名称：一种海鲜风味的酵母自溶物制备方法
技术领域：
本发明涉及一种海鲜风味的酵母自溶物制备方法。
背景技术：
美拉德反应(Maillard Reaction)是糖类(单糖和多糖)与氨基酸或蛋白质在一定的条件下(时间、温度、pH值等)发生的反应。由法国科学家L.C.Maillard于1912年发现的，当时，他发现甘氨酸与葡萄糖的混合物加热时，形成颜色为黑色的液体，同时产生香味物质，称为非酶褐变反应。影响美拉德反应的因素有很多，除了氨基酸种类及还原糖的种类外，尚与pH值、反应温度、反应时间及添加剂的使用有关。
自从1960年Morton于英国获得了第一项有关美拉德反应制备肉味香精的专利以来(英国专利836694，1960)，艾萍等(中国调味品，2002，(7)32-35)利用美拉德反应制备了牛肉香味料；宋焕禄(食品科学，2001，22(10)83-85)利用鸡肉酶解物/酵母抽提物进行美拉德反应来产生肉香味化合物。
美拉德反应一般可以分为三个阶段①起始阶段还原糖的羰基与氨基进行缩合反应形成希夫碱，再经环化形成相应的N-取代醛基胺，经重排形成Amadori化合物(1-氨基-1-脱氧-2-酮糖)；从Amadori到Heys重排阶段无褐变，亦不产生风味，但它们是风味物质的前体物质。
②中间阶段Amador和Heys重排化合物进一步降解，生成糠醛、呋喃酮和二酮化合物，这些化合物再与胺类、氨基酸、H2S、硫醇类、氮、乙醛和醛类反应形成许多重要风味物质。主要有下条路线一是在酸性条件下进行1，2一烯醇化反应生成羟基甲基吠喃醛或吠喃醛；二是碱性条件下进行的2，3一烯醇化反应，产生还原酮类及脱氢还原酮类；三是继续进行裂解反应形成含羰基或双羰基化合物或与氨基进行Strecker分解反应产生Strecker醛类。
③Strecker降解阶段热降解导致了香味料化合物的形成，它包括α-氨基酸在二酮化合物的存在下脱氨、脱羧，形成比原氨基酸少一个碳原子的醛和α-氨基酮，这些α-氨基酮是形成吡嗪类、嘌唑类、噻唑类等杂环化合物的重要中间产物S.J.O.施凯尔顿(申请号93121653.2)被加味的酵母提取物，通过在酵母自溶过程中渗入一种或几种水果、蔬菜、药草、调味品、真菌或其混合物的水解产物制取一种被加味的酵母提取物。
酵母提取物在欧洲一般是作为肉类提取物替代品，但酵母提取物有一股酵母味，所以国际上对初步制成的酵母提取物进一步加工改性，通过美拉德反应，产生新的肉香味物质。因为酵母提取物中含有的不仅是游离氨基酸，还有不少肽类。它们能和糖类反应产生特殊的芳香。在国内，酵母提取物近几年也逐步为人们所认识和接受，需求量呈不断上升的趋势。但因国内生产厂家少，大多数仍需依赖进口，市场开发潜力极大。由于酵母提取物生产可使用面包酵母、啤酒酵母等，而我国作为居世界第二位的啤酒生产大国，拥有大量的啤酒生产副产品啤酒酵母，如研究出适合于啤酒酵母生产酵母提取物工艺条件，既可生产具有市场潜力的天然调味料，又可解决啤酒生产企业废物排放的难题，此举可产生极大的经济效益和社会效益。
(三)
发明内容
本发明则是为了提供一种海鲜风味的酵母自溶物的制备方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述方法如下以利用酵母和米曲霉共生培养产生的内源酶系降解获得的产朊假丝酵母自溶物为基液，添加质量为酵母自溶物质量1～3％的D-(+)-木糖、0.5～2％的L-谷氨酸、0.5～2％的硫胺素、5～13％的虾粉、10％的鱼酱油，混匀，调pH值为4.0～6.0，于100～125℃下灭菌20～100min，得到所述的海鲜风味的酵母自溶物。鱼酱油，熟称鱼露，在我国浙江、福建、广东沿海一带有着悠久的加工历史，可市购得到，也可用鱼肉经自然发酵并加0.02％的酸性蛋白酶(酶活力pH2.3时320μ/g)的产物替代。
所述产朊假丝酵母自溶物由如下方法制备得到将产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养产物置于带搅拌的保温容器中，调节固形物浓度，得到固形物质量浓度10～30％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加质量为酵母液质量0.2～2.5％的氯化钠，并加入质量为酵母液质量1～5％的黄酒或白酒，以及质量为酵母液质量0.1％的硫胺素和质量为酵母液质量2％的葡萄糖，搅拌下自溶24小时，得到所述的产朊假丝酵母自溶物，所述共生培养产物内源酶活为60～100U/g干菌。U为酶活单位，定义为在pH7.2，40℃，1min内产生1μg酪氨酸的酶量(g)为一个单位。
所述产朊假丝酵母优选为产朊假丝酵母1422。
所述共生培养产物由如下方法制备得到共生培养基终浓度组成为麸皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麦芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/6～1/4×105个细胞/mL培养基的接种量接种米曲霉孢子悬液，20～40℃、100～150r/min振荡培养36～72h后，再以1/15～1/10×106个细胞/mL培养基的接种量接种产朊假丝酵母种子液，20～40℃、100～200r/min振荡培养18～36h，获得所述共生培养产物。可将所述共生培养产物即发酵液直接用于酵母自溶物的制备，也可将发酵液过滤，离心收集得到的菌丝体应用于酵母自溶物的制备。
所述产朊假丝酵母优选为产朊假丝酵母1422。
所述米曲霉优选为米曲霉3042。
所述米曲霉孢子悬液由如下方法制备得到将米曲霉菌种转接于斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，即得所述米曲霉孢子悬液。所述斜面培养基可为常用适用于米曲霉的培养基，本发明中采用豆汁斜面培养基，配制方法如下称取一定量的黄豆，加入质量约为黄豆10倍的水浸泡过夜，煮沸2小时，用纱布过滤即得豆汁(加入蔗糖至终浓度为30g/L，即为豆汁液体培养基)；往豆汁中加入蔗糖至终浓度为30g/L和琼脂至终浓度为20g/L即为豆汁斜面培养基。
所述产朊假丝酵母种子液由如下方法制备得到将假丝酵母菌种转接于斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于液体培养基，30℃下恒温培养72h，即得所述产朊假丝酵母种子液。所述斜面培养基和液体培养基可为常见适用于产朊假丝酵母的斜面培养基和液体培养基，本发明中采用麦芽汁斜面培养基和麦芽汁液体培养基，配制称取一定量的麦芽颗粒，加四倍的水浸泡过夜，打碎磨浆，在72℃的恒温水浴锅中糖化一个小时左右，用碘液试验检查糖化完全为止，煮沸30分钟灭酶，离心，得上清液即为麦芽汁(可直接作为麦芽汁液体培养基)，再加入琼脂至终浓度为20g/L即为麦芽汁斜面培养基。
具体的，所述方法如下(1)将米曲霉3042菌种转接于豆汁斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于豆汁斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，获得米曲霉孢子悬液；(2)将产朊假丝酵母1422菌种转接于麦芽汁斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于麦芽汁液体培养基，30℃下恒温培养72h，获得产朊假丝酵母种子液；(3)共生培养基终浓度组成为麸皮10g/L，豆粕30g/L，麦芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/5×105个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(1)所得米曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养48h后，再以1/12×106个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(2)所得产朊假丝酵母种子液，30℃、180r/min振荡培养24h，发酵结束后，过滤，离心收集菌丝体；(4)将步骤(3)所得菌丝体置于带搅拌的保温容器中，调节固形物浓度，得固形物质量浓度20％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加质量为酵母液质量0.2～2.5％的氯化钠，并加入质量为酵母液质量1～5％的黄酒或白酒，以及质量为酵母液质量0.1％的硫胺素和质量为酵母液质量2％的葡萄糖，搅拌下自溶24小时，得到所述的产朊假丝酵母自溶物；(5)以步骤(4)所得产朊假丝酵母自溶物为基液，添加质量为酵母自溶物2％的D-(+)-木糖、1.0％的L-谷氨酸、1.0％的硫胺素、10％的虾粉，10％的鱼酱油，混匀，调pH值为5.0～5.5，于120℃下灭菌60min，得到所述的海鲜风味的酵母自溶物。
本发明的有益效果主要体现在提供了一种具有海鲜风味的酵母自溶物，利于进一步开发利用，具有重大应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1培养基配制豆汁斜面培养基组成称取一定量的黄豆，加10倍质量的水浸泡过夜，煮沸2小时，用纱布过滤得豆汁；加入蔗糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为20g/L即为豆汁斜面培养基。
麦芽汁斜面培养基组成称取一定量的麦芽颗粒，加4倍质量的水浸泡过夜，打碎磨浆，在72℃的恒温水浴锅中糖化一个小时左右，用碘液试验检查糖化完全为止，煮沸30分钟灭酶，离心，得麦芽汁，再加入终浓度20g/L的琼脂即为麦芽汁斜面培养基。
麦芽汁液体培养基组成称取一定量的麦芽颗粒，加4倍质量的水浸泡过夜，打碎磨浆，在72℃的恒温水浴锅中糖化一个小时左右，用碘液试验检查糖化完全为止，煮沸30分钟灭酶，离心，得上清液即为麦芽汁，即麦芽汁液体培养基。
米曲霉3042以无菌操作方式，将米曲霉3042菌种(由杭州食品酿造有限公司提供)转接于豆汁斜面培养基上，于30℃下培养96h，获得斜面活化菌种；再以无菌操作方式，将活化菌种转接于茄子瓶豆汁斜面培养基上，于30℃下恒温培养96h，用50毫升无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，制成孢子悬液，细胞浓度为105个/mL；产朊假丝酵母1422以无菌操作方式，将产朊假丝酵母1422菌种(由中国工业微生物菌种保藏中心提供)转接于麦芽汁(50Bê)斜面培养基上，于30℃下恒温培养72h，获得斜面活化菌种；再以无菌操作方式，将斜面活化菌种转接于麦芽汁液体培养基，30℃下恒温培养72h，即得所述产朊假丝酵母种子液，细胞浓度为106个/mL。
实施例2共生培养基终浓度组成为麸皮10g/L，豆粕30g/L，麦芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；1.5L三角瓶中装液量300mL，调pH7.0，灭菌，冷却至室温，接入实施例1所得米曲霉孢子悬液60mL，30℃、120r/min振荡培养48h后，再接入实施例1所得产朊假丝酵母种子液25mL，30℃、180r/min振荡培养24h，发酵结束后，过滤，离心收集菌丝体，内源蛋白酶酶活为85U/g干菌。
实施例3取实施例2所得菌丝体20g(内源酶活82U/g干菌)置于带搅拌的保温容器中，调节固形物浓度为20％，调节pH5.8、温度保持50±2℃，添加2.5g氯化钠，并加入5g黄酒(市售含16％酒精的绍兴黄酒)，以及0.1g的硫胺素和2g葡萄糖，搅拌下自溶24小时，得到产朊假丝酵母自溶物(其游离氨基酸含量为8.5％)。
实施例4木糖添加量对海鲜风味的影响(下列百分比含量均为质量百分比含量)取按实施例3方法制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加0.5％硫胺素，1.0％L-谷氨酸，5％虾粉(由浙江海蕴生物有限公司提供，下同)，10％鱼酱油(由舟山兴业有限公司海洋调味品厂提供，下同)。然后调整还原糖D-(+)-木糖的含量分别为1％、1.5％、2％、2.5％和3％，调pH值5.0～5.5之间，120℃下加热60min。结果表明，添加D-(+)-木糖的质量含量为2％的反应产物海鲜风味较逼真。随着木糖添加量的增多，颜色也越来越深，导致海鲜风味的相对减弱。
谷氨酸添加量对海鲜风味的影响取按实施例3方法制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加0.5％硫胺素，2.0％D-(+)-木糖，5％虾粉，10％鱼酱油。然后调整L-谷氨酸的含量分别为0、0.5％、1％、1.5％和2％，调pH值5.0～5.5之间，120℃下加热60min。结果表明，谷氨酸添加量为1％时的海鲜风味最逼真。
硫胺素添加量对海鲜风味的影响硫胺素的降解对肉香味的产生起到很大的作用，硫胺素的热降解生成许多有香味的物质，有呋喃、呋喃硫醇、噻吩和脂肪族含硫化合物等。
取按实施例3方法制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加2％D-(+)-木糖，5％虾粉，1.0％L-谷氨酸，10％鱼酱油，然后改变其中的硫胺素含量分别为0、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％，调pH值5.0～5.5之间，120℃下加热60min。结果表明，硫胺素含量为1％时，美拉德反应的海鲜风味最逼真。
虾粉添加量对海鲜风味的影响取按实施例3方法制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加1％硫胺素，2.0％D-(+)-木糖，1.0％L-谷氨酸，10％鱼酱油。分别添加虾粉为2％、5％、7％、10％和13％，调pH值5.0～5.5之间，120℃下加热60min。结果表明，虾粉添加量在10％时，风味较佳，随着虾粉添加量的增多，海鲜味会越来越浓，但有异味；反应时间过短，美拉德反应不够充分，风味不够浓郁；反应时间过长，会产生不愉快的刺激味。
反应时间对海鲜风味的影响不同的反应时间对美拉德反应的影响不一样，实验取按实施例3方法制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加2％D-(+)-木糖，1.0％L-谷氨酸盐酸盐，1％硫胺素，10％虾粉，10％鱼酱油的配比混合均匀，调pH值5.0～5.5之间，在120℃加热20min、40min、60min、80min、100min。结果表明，在时间为60min时，风味最佳。
反应温度对海鲜风味的影响温度的升高有利于美拉德反应及脂类氧化，较高温度不仅加速各种化学反应速度，而且增加肉中游离氨基酸和其他风味前体物的释放速度。温度不仅影响美拉德反应中各种风味物质的浓度，而且可影响他们之间的相互作用，美拉德反应中底物相同，不同温度下产生的风味也各不相同。
取按实施例3方法制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加2％D-(+)-木糖，1.0％L-谷氨酸，1％硫胺素，10％虾粉，10％鱼酱油的配比混合均匀，调pH值5.0～5.5之间，在105℃、110℃、115℃、120℃、125℃的下加热60min。结果表明，温度在120℃时的风味较佳。
pH值对海鲜风味的影响取按实施例3方法制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加2％D-(+)-木糖，1.0％L-谷氨酸，1％硫胺素，10％虾粉，10％鱼酱油的配比混合均匀，美拉德反应随着pH值的提高，有色聚合物的数量增加，碱性条件下易生成含氮挥发物，故调pH值4.0、4.5、5.0、5.5、6.0之间，在120℃下加热60min。结果表明，pH值在5.0～5.5之间，其风味最佳。
实施例5取按实施例3制得的产朊假丝酵母自溶物50mL，添加1％硫胺素，1.0％L-谷氨酸，10％虾粉，2％D-(+)-木糖，10％鱼酱油，调pH值5.0～5.5之间，120℃下加热60min，制得酵母自溶物具有浓郁的海鲜风味。
权利要求
1.一种海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述方法如下以利用酵母和米曲霉共生培养产生的内源酶系降解获得的产朊假丝酵母自溶物为基液，添加质量为酵母自溶物质量1～3％的D-(+)-木糖、0.5～2％的L-谷氨酸、0.5～2％的硫胺素、5～13％的虾粉、10％的鱼酱油，混匀，调pH值为4.0～6.0，于100～125℃下灭菌20～100min，得到所述的海鲜风味的酵母自溶物。
2.如权利要求1所述的海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述产朊假丝酵母自溶物由如下方法制备得到将产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养产物置于带搅拌的保温容器中，调节固形物浓度，得到固形物质量浓度10～30％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加质量为酵母液质量0.2～2.5％的氯化钠，并加入质量为酵母液质量1～5％的黄酒或白酒，以及质量为酵母液质量0.1％的硫胺素和质量为酵母液质量2％的葡萄糖，搅拌下自溶24小时，得到所述的产朊假丝酵母自溶物，所述共生培养产物内源酶活为60～100U/g干菌。
3.如权利要求2所述的海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于其特征在于所述共生培养产物由如下方法制备得到共生培养基终浓度组成为麸皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麦芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/6～1/4×105个细胞/mL培养基的接种量接种米曲霉孢子悬液，20～40℃、100～150r/min振荡培养36～72h后，再以1/15～1/10×106个细胞/mL培养基的接种量接种产朊假丝酵母种子液，20～40℃、100～200r/min振荡培养18～36h，获得所述共生培养产物。
4.如权利要求3所述的海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母1422。
5.如权利要求3所述的海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述米曲霉为米曲霉3042。
6.如权利要求3所述的海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述米曲霉孢子悬液由如下方法制备得到将米曲霉菌种转接于斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，即得所述米曲霉孢子悬液。
7.如权利要求3所述的海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述产朊假丝酵母种子液由如下方法制备得到将假丝酵母菌种转接于斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于液体培养基，30℃下恒温培养72h，即得所述产朊假丝酵母种子液。
8.如权利要求2所述的海鲜风味的酵母自溶物制备方法，其特征在于所述方法如下(1)将米曲霉3042菌种转接于豆汁斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于豆汁斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，获得米曲霉孢子悬液；(2)将产朊假丝酵母1422菌种转接于麦芽汁斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于麦芽汁液体培养基，30℃下恒温培养72h，获得产朊假丝酵母种子液；(3)共生培养基终浓度组成为麸皮10g/L，豆粕30g/L，麦芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/5×105个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(1)所得米曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养48h后，再以1/12×106个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(2)所得产朊假丝酵母种子液，30℃、180r/min振荡培养24h，发酵结束后，过滤，离心收集菌丝体；(4)将步骤(3)所得菌丝体置于带搅拌的保温容器中，调节固形物浓度，得固形物质量浓度20％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加质量为酵母液质量0.2～2.5％的氯化钠，并加入质量为酵母液质量1～5％的黄酒或白酒，以及质量为酵母液质量0.1％的硫胺素和质量为酵母液质量2％的葡萄糖，搅拌下自溶24小时，得到所述的产朊假丝酵母自溶物；(5)以步骤(4)所得产朊假丝酵母自溶物为基液，添加质量为酵母自溶物2％的D-(+)-木糖、1.0％的L-谷氨酸、1.0％的硫胺素、10％的虾粉，10％的鱼酱油，混匀，调pH值为5.0～5.5，于120℃下灭菌60min，得到所述的海鲜风味的酵母自溶物。
全文摘要
本发明提供了一种海鲜风味的酵母自溶物制备方法，以利用内源酶系降解获得的产朊假丝酵母自溶物为基液，添加质量为酵母自溶物质量1～3％的D－(+)－木糖、0.5～2％的L－谷氨酸、0.5～2％的VB
文档编号C12N1/14GK101050431SQ20071006748
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者丁玉庭, 聂小华, 刘书来 申请人:浙江工业大学