一种用于检测抗赤霉病QTLQfhb.hbaas-5AS的分子标记及使用方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测抗赤霉病qtlqfhb.hbaas-5as的分子标记及使用方法。

背景技术：

由禾谷镰刀菌等引起的小麦赤霉病(fusariumheadblight，fhb)是一种广泛流行的真菌病害，严重影响小麦产量和品质。更重要的是，感病籽粒含真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，危害人畜健康，影响食用和饲用。

我国长江中下游和东北麦区是小麦赤霉病常发、重发区域。近年来，受全球气候变化、小麦–玉米轮作制度下秸秆还田的普及等影响，该病呈扩张、加重趋势，已成为黄淮麦区常发病害。当前我国小麦赤霉病年均发生面积超过533.3万hm²，2010～2015年造成年均总损失高达337万t，居小麦病害之首。

培育利用抗病品种是降低赤霉病危害的经济有效手段。国内外对赤霉病抗性遗传进行了大量研究，已定位约100个抗赤霉病qtl，分布在小麦所有染色体，fhb1～fhb7等7个抗病基因被正式命名，其中来自苏麦3号位于3b染色体短臂的fhb1抗性最强且稳定。然而，除fhb1外，其它基因育种应用的报道较少。因此进一步挖掘抗赤霉病位点，开发其分子标记对于小麦抗赤霉病育种意义重大。

技术实现要素：

为了挖掘抗赤霉病位点开发其分子标记，本发明的一个目的是检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质的用途。

本发明提供了检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性中的应用；

或本发明提供了检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性产品中的应用。

本发明还提供了检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质在选育抗赤霉病小麦中的应用；

或，本发明还提供了检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质在制备选育抗赤霉病小麦产品中的应用。

本发明还提供了检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质在抗赤霉病小麦育种中的应用；

或，本发明还提供了检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质在制备抗赤霉病小麦育种产品中的应用。

上述应用中，所述snpiwb21456位点为位于小麦染色体5as上，物理位置为9.6mb的位点；

或，所述snpiwb21456位点的基因型为gg或aa。

上述应用中，所述检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质如下1)或2)：

1)成套引物，所述成套引物由序列表中序列1所示的单链dna分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链dna分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链dna分子组成；

2)含有所述成套引物的pcr试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

上述应用中，所述序列表中序列1所示的单链dna分子的衍生物为序列1所示的单链dna分子的5'端连接一种荧光序列；

所述序列表中序列2所示的单链dna分子的衍生物为序列1所示的单链dna分子的5'端连接另一种荧光序列；

或，所述荧光基团序列为荧光序列fam或荧光序列hex。

本发明另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其为上述检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型的物质；

所述产品具有如下1)或2)或3)至少一种功能：

1)鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性；

2)选育抗赤霉病小麦；

3)抗赤霉病小麦育种。

本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性的方法。

本发明提供的方法，为检测待测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型为gg还是aa，根据基因型判断所述待测小麦的赤霉病抗性；

snpiwb21456位点的基因型为aa的待测小麦赤霉病抗性高于snpiwb21456位点的基因型的基因型为gg的待测小麦。

本发明第4个目的是提供一种选育抗赤霉病小麦的方法。

本发明提供的方法，为检测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型为gg还是aa，选育基因型为aa的待测小麦，得到抗赤霉病的小麦。

上述方法中，所述检测待测小麦染色体5as的snpiwb21456位点的基因型为gg还是aa的方法为如下a)或b)：

a)90ksnp芯片分析；

b)用上述成套引物对所述待测小麦基因组dna对所述待测小麦基因组dna进行kasp反应，对产物进行基因分型。

所述基因分型的方法如下：采用荧光酶标仪照射产物，若所述产物仅显示序列1所示dna分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦snp位点iwb21456的基因型为aa；若所述产物仅显示序列2所示dna分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦snp位点iwb21456的基因型为gg。

以上任一所述小麦可为但不限于实施例部分表1中所示的240份小麦品种。

本发明专利通过全基因组关联分析(gwas)发现了位于小麦5a染色体短臂上抗赤霉病位点qfhb.hbaas-5as，解释表型变异5.0％，在4个环境下，含抗病等位基因材料平均fhbindex比含感病等位基因材料低4.3％–16.2％。本发明专利进一步将其关联snpiwb21456转化为kasp(kompetitiveallelespecificpcr)标记kasp-fhb5as，两者对240份材料分型一致率为96.7％。该标记可用于检测抗赤霉病qtlqfhb.hbaas-5as的基因型，并用于抗赤霉病分子育种。

附图说明

图1为qfhb.hbaas-5as不同基因型材料fhbindex比较。

图2为kasp-fhb5as对部分品种检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

赤霉病病原菌黄冈1号：参考文献：朱展望,杨立军,佟汉文,等.湖北省小麦品种(系)的赤霉病抗性分析[j].麦类作物学报,2014,34(1):137–142.公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。

实施例1、qfhb.hbaas-5as及其关联snp标记的发现

供试材料：国内外小麦品种(系)240份组建的waps(wheatassociationpanelforscabresearch)群体，见表1。所用材料记载于文献：朱展望,徐登安,程顺和,等.中国小麦品种抗条锈病基因fhb1的鉴定与溯源[j].作物学报,2018,44(4):473–482.公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。

表1waps群体品种(系)及其来源

^a为90ksnp芯片分型结果；^b为kasp标记检测结果；^c4个环境下fhbindexblue值(bestlinearunbiasedestimate)，“nn”为芯片数据缺失。

一、qfhb.hbaas-5as及其关联snp标记的发现

1、赤霉病抗性鉴定

于2014～2017连续4年在湖北省农业科学院南湖试验田进行赤霉病接种鉴定，病原菌菌株为黄冈1号。试验采用完全随机区组设计，2行区，行长1m，行距0.25m，2次重复。2014～2016年，采用喷雾接种，2017年采用地表撒病麦粒方法接种。接种后20d调查发病穗数、每穗小穗数和病小穗数，用公式：赤霉病病情指数(fhbindex)＝发病率×严重度，计算fhbindex，其中发病率为发病穗数与总穗数的比值，严重度为每穗病小穗数与小穗数比值的平均值，均以百分率计。然后计算4年fhbindexblue值(bestlinearunbiasedestimate)。

2、基因型分析

waps群体用90ksnp芯片进行基因型分析，选择其中22922个分型结果好的snp用于后续分析，去掉缺失率超过20％、最小等位基因频率小于5％的标记，共剩余19803个snp用于gwas。

3、gwas分析

采用tasselv5.0软件kinship(k)+pca方法的混合线性模型进行关联分析。当p≤0.001时，认为该标记与性状显著关联。

4、qfhb.hbaas-5as及其连锁snp标记

关联分析发现位于5as上抗赤霉病位点，在2014和205两个环境下显著，解释表型变异5.0％，代表性关联标记为iwb21456，其侧翼序列为：

5’-gcttcaacaatactttgctcaatgccatcgacaattacatcaaatgactg[a/g]cgaacaaacccaagtgatgtgataatatagactacatactgcagataacc-3’(序列3，snp位点在序列4第51位)。在小麦品种中国春参考基因组序列(iwgsc，http://www.wheatgenome.org)上物理位置为9.6mb(表2)。在4个环境下，含抗病等位基因材料平均fhbindex比含感病等位基因材料低4.3％–16.2％(图1)。

图1中，**和*分别表示两种基因型材料间表型在0.01、0.05水平差异显著，ns表示差异不显著。

表2qfhb.hbaas-5as及其连锁snp标记

^a代表性snp标记，^b下划线所示为抗病等位基因，^c中国春参考基因组物理位置(iwgsc，http://www.wheatgenome.org)，^d解释表型变异。

snp位点iwb21456位于5as染色体物理位置为9.6mb，其多态性为a/g，该snp位点的基因型为aa或gg，snp位点iwb21456也是序列4第51位。

二、kasp-fhb5as标记专用引物的设计及其方法的建立

1、基因组特异引物设计

用snpiwb21456的侧翼序列，在ensemblplants数据库(http://plants.ensembl.org)比对，获取其同源序列，设计其5a染色体特异引物p1456(序列1、序列2和序列3)，又名kasp-fhb5as标记，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

鉴定snp位点iwb21456的kasp引物为p1456引物组，该引物组由5’末端添加特异荧光序列fam的dna分子、5’末端添加特异荧光序列hex的dna分子和序列表中序列3所示的单链dna分子组成；

5’末端添加特异荧光序列fam的dna分子为在序列1所示的单链dna分子的5’末端添加特异荧光序列fam得到；

5’末端添加特异荧光序列hex的dna分子为在序列2所示的单链dna分子的5’末端添加特异荧光序列hex得到；

p1456a：5’-atcgacaattacatcaaatgactga-3’(序列1)；

p1456b：5’-atcgacaattacatcaaatgactgg-3’(序列2)；

p1456c：5’-aataacgtggctatcagtggt-3’(序列3)。

特异荧光序列fam为5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’；

特异荧光序列hex为5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’；

上述5’端添加特异荧光序列fam序列1所示的单链dna分子与序列3所示的单链dna分子扩增snp位点基因型为aa的片段，携带fam的序列pcr扩增后的产物经荧光照射显示红色；

上述5’端添加特异荧光序列hex序列2所示的单链dna分子与序列3所示的单链dna分子扩增snp位点基因型为gg的片段，携带hex的序列pcr扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。

2、检测方法建立

供试材料：国内外小麦品种(系)240份(表1)组建的waps群体。

提取待测小麦的基因组dna，加ddh2o稀释其浓度至30ng/μl作为模板，采用引物p1456a、引物p1456b和引物p1456c组成的引物对进行kasp反应。

上述kasp反应体系如表3所示；

表3引物p1456的kasp反应体系

kasp反应程序：95℃热激活15min；95℃变性20s，65℃退火延伸30s，共10个touchdown循环，每个循环降低0.6℃；然后95℃变性20s，57℃退火延伸1min，共32个循环；4℃保存。

kasp反应产物用pherastar^plus(bmglabtech,ortenberg,germany)读取荧光，用klustercaller软件(lgcgenomics,teddington,uk)进行分型。红色基因型为aa，蓝色基因型为gg。结果如图2所示，左上方为iwb21456基因型为aa的品种，右下方为iwb21456基因型为gg的品种；表明该标记可以区分iwb21456基因型，并进一步区分抗赤霉病qtlqfhb.hbaas-5as的等位基因，该标记标记命名为kasp-fhb5as。

该标记waps群体检测结果与snpiwb21456分型结果一致率为96.7％，说明该标记转化成功。

因此，snpiwb21456标记可用于辅助检测待测小麦是否抗赤霉病，并用于抗赤霉病分子育种；具体方法如下：

检测待测小麦基因组中snp位点iwb21456的基因型，按照如下方法判断：

snp位点iwb21456基因型为aa的待测小麦的赤霉病抗性高于或候选高于iwb21456基因型为gg的待测小麦。

上述检测待测小麦基因组中snp位点iwb21456的基因型的方法如下：

1)90ksnp芯片分析；

2)引物p1456a、引物p1456b和引物p1456c进行kasp反应，用pherastar^plus对产物进行检测，用klustercaller软件进行数据分析；若颜色为红色，则所述待测小麦snp位点iwb21456的基因型为aa；若为蓝色，则所述待测小麦snp位点iwb21456的基因型为gg。

实施例2、实际样本检测

供试材料：表1所示的waps群体品种。

一、赤霉病抗性鉴定

同实施例1。

二、kasp-fhb5as标记检测

用kasp-fhb5as标记按照实施例1中的方法，对表1所示的240个品种进行kasp反应，检测kasp反应产物；用pherastar^plus对产物进行检测，用klustercaller软件进行数据分析；若颜色为红色，则所述待测小麦snp位点iwb21456的基因型为aa；若为蓝色，则所述待测小麦snp位点iwb21456的基因型为gg。

240份小麦品种标记检测结果和fhbindex平均值如表1所示。将表1的结果进行统计分析，得到表4的结果。

表4kasp-fhb5as不同基因型品种赤霉病抗性差异

从上述可以看出，snp位点iwb21456为aa基因型待测小麦的赤霉病抗性高于或候选高于snp位点iwb21456为gg的基因型待测小麦。

sequencelisting

<110>湖北省农业科学院粮食作物研究所中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种用于检测抗赤霉病qtlqfhb.hbaas-5as的分子标记及使用方法

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