用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种dna提取方法，具体为用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法。

背景技术：

在鱼类种群遗传学的研究中，以鱼类基因组dna为研究对象，运用ssr等分子标记对种群进行遗传多样性分析以及种群鉴定。而在dna提取过程中，通常以血液、肌肉、鳍条等组织为样品，应用酚-仿、磁珠富集、dna提取试剂盒等方法提取dna，dna长度能达到100kb以上，质量稳定可靠，可直接应用于pcr、q-pcr、southern杂交等分子生物学实验。但在分子标记应用上，pcr扩增模板不需要长链dna，质量不高的短片段dna也能扩增目的条带，获得相同效果。另外，血液样品的采集虽然是一种非伤害性取样，但费时费力，而且还需要熟练操作的技术人员，准确快速的从尾静脉抽取血液。肌肉、鳍条等组织的取样则是一种伤害性取样，影响鱼类的生理功能，而且极易引起鱼类伤口感染，导致病害发生，最终引起鱼类死亡。鱼类鳞片取样则简便易行，既可从鱼体表取样，也可收集鱼自身脱落的鳞片。虽然鳞片取样也是一种伤害性取样，但1至2片鳞片的缺失显然不会对鱼体造成严重的伤害，而且鱼类的生理功能也不会受到影响。

技术实现要素：

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种减少因取样引起的鱼类伤口感染或病害发生的方法，建立一套可从鱼鳞片中快速提取dna，为鱼类高通量微卫星分析的广泛应用提供平台，本发明提供了用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法。

技术方案：用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法，所述方法包含以下步骤：

(1)用镊子从鲤鱼尾部取鳞片1至2片，剪碎，放入1.5ml的ep管中；

(2)向ep管中加入75μl碱性裂解液，放入95℃水浴锅中加热20～60分钟；

(3)将步骤(2)中的反应液迅速置于冰水中冷却2～5分钟；

(4)向步骤(3)中的加入中和缓冲液75μl；

(5)收集步骤(4)中的dna，直接取1～3μl作为模板，用于高通量微卫星pcr扩增。

优选的，所述碱性裂解液组成成分及浓度为：25mmnaoh，0.2mmedta，ph为12。

优选的，中和缓冲液的组成成分及浓度为40mmtris-hcl，ph为5。

优选的，所述高通量微卫星pcr扩增体系中dna的模板量为2μl。

优选的，所述高通量微卫星pcr扩增体系中的引物序列为seqidno.1～2。

本发明所述方法的原理在于：naoh作为一种强碱，使细胞中的蛋白质变性并分解蛋白质，也可降低dna酶的活性，而edta作为一种螯合剂，螯合dna酶的辅助因子mg²⁺和ca²⁺，使dna酶活性降低，最后加入的tris-hcl作为一种缓冲液，降低提取液的ph值，使提取的dna适合保存，染色体dna最终从细胞中分离出。

有益效果：本发明所述方法通过取鱼类鳞片，加入变性液，煮沸，最后加入中性液来快速提取鱼类dna，该方法相较于传统的dna提取方法具有取样方便、操作简单、快速提取和经济实惠等优点；所述方法提取的dna，能够作为高通量微卫星分析的模板，与传统方法提取的dna具有相同的效果。

附图说明

图1是本发明所述方法提取的dna用于高通量微卫星pcr扩增的电泳结果图；

m：dl1000marker1和2:血液dna,3和4:鳞片dna

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法，所述方法包括以下步骤：

1、用镊子从鲤鱼尾部取鳞片1片，剪碎，放入1.5ml的ep管中。

2、向ep管中加入75μl碱性裂解液，放入95℃水浴锅中加热40分钟。其中裂解液的组成成份及浓度为：25mmnaoh，0.2mmedta，ph为12。

3、迅速将反应液置于冰水中冷却5分钟。

4、加入中和缓冲液75μl，其中中和缓冲液的组成成份及浓度为40mmtris-hcl，ph为5。

5、获得dna，直接取2μl作为模板，用于pcr扩增。

6、pcr反应体系为15μl，其中含2μl模版，1μl正向引物f(10μm)、1μl反向引物r(10μm)、7.5μlpcrmix(transgen)、3.5μlddh2o。pcr反应流程为：94℃预变性3min，然后30个循环(94℃30s，58℃30s，72℃40s)，最后72℃延伸3min，4℃保存。正向引物为(seqidno.1)f:tggactgttaaagaagggtatgtg；反向引物为(seqidno.2)r：tgcttgggtactggatgaac)。

取10μlpcr扩增液，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳(含nared核酸染色剂，5μl/100ml)，电压140v，电泳20min。在凝胶成像系统下观察，并拍照记录。结果显示(图1)：扩增条带清晰，和对照组(血液dna模板)无明显差异，这表明从鱼类鳞片中快速提取dna的方法可行，提取的dna可直接用于pcr扩增。

序列表

<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120>用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggactgttaaagaagggtatgtg24

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgcttgggtactggatgaac20

技术特征：

技术总结
本发明公开了用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，所述方法通过取鱼类鳞片，加入变性液，煮沸，最后加入中性液来快速提取鱼类DNA，该方法相较于传统的DNA提取方法具有取样方便、操作简单、快速提取和经济实惠等优点；所述方法提取的DNA，能够作为高通量微卫星分析的模板，与传统方法提取的DNA具有相同的效果。

技术研发人员：唐永凯
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
技术研发日：2019.03.22
技术公布日：2019.05.17