泊洛沙姆P338在提高病毒对细胞的感染效率中的应用和方法与流程

本发明属于病毒感染细胞技术领域，更具体地说，本发明涉及基于泊洛沙姆p338的使用提高病毒感染细胞效率的应用和方法。

背景技术：

利用慢病毒载体、腺相关病毒载体等携带的外源核酸物质实现对真核细胞基因组的编辑成为研究基因功能和精准基因治疗的有效手段，目前已被广泛应用于基础研究和部分临床研究阶段。然而，病毒对细胞尤其是原代细胞的感染效率以及其对个体内细胞的感染效率依旧偏低，且存在着不同程度的细胞依赖性。另外，使用高剂量的病毒提高感染效率，不仅增加了病毒包装的复杂度和使用量，提高了实际使用成本，而且大量外源核酸物质的侵入增加了对细胞基因和功能的影响风险，这些影响因素对于以后的临床研究是非常不利的。因此，寻找在对细胞和个体无毒性的情况下提高病毒对细胞的感染效率的方法是进一步推动病毒在基因功能研究和基因治疗领域内大范围使用的关键。

聚凝胺（polybrene）是一种多聚阳离子聚合物，目前广泛用于反转录病毒介导的基因感染，慢病毒介导的基因感染等，可显著提高病毒对细胞的感染效率。它的作用原理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进病毒对细胞的吸附作用。但是，聚凝胺对末端分化的神经元，dc细胞等一些细胞中毒性较大，实验前要进行毒性测试，增加了实验操作，并且限制了polybrene在这些种类细胞中对病毒感染效率的功效。

泊洛沙姆（poloxamer）是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，属于一类新型的高分子非离子表面活性剂，具有双水性特点。研究显示泊洛沙姆可促进裸dna核酸在心脏，肌肉或肿瘤内的局部表达。并且泊洛沙姆p407可促进慢病毒对人源上皮细胞的感染效率。其工作原理是亲水性区域偶联目的物质，疏水性区域降低细胞膜的微黏度，提高磷脂的交换，增强细胞膜对离子和溶液的运输，从而促进偶联的物质进入细胞。泊洛沙姆对细胞膜的通透性的这种直接作用并不影响细胞的形态和细胞功能，对普通细胞本身并没有不利影响。但有研究指出，泊洛沙姆更倾向于识别肿瘤细胞，不仅诱导细胞凋亡信号的起始，而且抑制肿瘤细胞mdr蛋白的功能和atp的产生。

然而，本领域中还未曾公开或证明泊洛沙姆可提高病毒（包括慢病毒，腺相关病毒）对细胞的感染效率，同时增强对肿瘤细胞的杀伤作用。

技术实现要素：

为了更好的探究和运用提高病毒感染细胞的效率的方法，本研究采用了泊洛沙姆p338化合物，作为感染辅助剂，应用于慢病毒和腺相关病毒感染体系中，在不同的moi（multiplicityofinfection，感染复数）条件下，比较在不同的细胞中感染效率的情况，从而确立了泊洛沙姆p338化合物作为病毒感染增强剂的使用。

本发明提供的技术方案之一是本发明提供了泊洛沙姆p338在提高病毒对细胞的感染效率中的应用。

泊洛沙姆是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，属于一类新型的高分子非离子表面活性剂，具有双水性特点。本发明采用泊洛沙姆p338作为例子，然而应该理解，在本发明的教导之下，本领域技术能够采用其他合适的泊洛沙姆作为辅助剂用于病毒对细胞的感染，并且在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施方式中，泊洛沙姆p338的使用量可以为0.1mg/ml-15mg/ml、1mg/ml-10mg/ml，例如0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml，或其他使用量。

优选地，泊洛沙姆p338的使用量可以为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml或10mg/ml。

最优选地，泊洛沙姆p338的使用量为1mg/ml。

应该，在本发明的教导之下，本领域技术人员根据使用的病毒种类、感染的细胞种类，能够选择合适的泊洛沙姆p338使用量，而不限于上述的使用量，并且在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施方式中，病毒为慢病毒或腺相关病毒。优选地，所述慢病毒为慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag，所述腺相关病毒为腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag。

病毒是一种个体微小、结构简单、只含一种核酸(dna或rna)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型的微生物。病毒不仅分为植物病毒、动物病毒和细菌病毒，从结构上还分为:单链rna病毒、双链rna病毒、单链dna病毒和双链dna病毒等。

应该理解，本发明并不限于慢病毒或腺相关病毒，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适病毒种类来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施方式中，慢病毒的moi为moi=0.25、moi=0.5、moi=0.75、moi=1、moi=1.25、moi=1.5，优选地，慢病毒的moi为moi=0.25、moi=1。应该理解，本发明并不限于上述moi，任何合适的moi都在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施方式中，腺相关病毒的的moi为moi=1×10¹、moi=1×10²、moi=1×10³、moi=1×10⁴、moi=1×10⁵、moi=1×10⁶、moi=1×10⁷、moi=1×10⁸、moi=1×10⁹、moi=1×10¹⁰，优选地，moi=1×10³、moi=1×10⁴、moi=1×10⁵。应该理解，本发明并不限于上述moi，任何合适的moi都在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施方式中，用于感染的细胞可以为293t细胞、llc-mk2细胞或人源原代细胞。应该理解本发明并不限于上述细胞，本领域技术人员能够根据采用的病毒，根据需要，在本发明的教导之下，能够选择任何感染细胞，并且都在本发明的保护范围之内。

本发明提供的又一技术方案是本发明提供了一种使用泊洛沙姆p338提高病毒对细胞的感染效率的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

s1：细胞铺板，

s2：在添加泊洛沙姆p338下，用病毒感染细胞。

应该理解，在上述步骤的基础上，增加其他步骤也在本发明的保护范围之内。

可选地，所述病毒为慢病毒或腺相关病毒。如上所述，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的病毒种类，并且本发明的保护范围之内。

可选地，所述细胞为293t细胞、llc-mk2细胞或人源原代细胞。如上所述，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的细胞种类，并且本发明的保护范围之内。

可选地，泊洛沙姆p338的使用量为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml或10mg/ml。如上所述，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的病毒使用量，并且本发明的保护范围之内。

本发明提供的再一技术方案是本发明提供了一种使用泊洛沙姆p338提高低moi值病毒感染对细胞的感染效率的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

s1：细胞铺板；

s2：在添加泊洛沙姆p338下，用病毒感染细胞。

应该理解，在上述步骤的基础上，增加其他步骤也在本发明的保护范围之内。

可选地，所述病毒为慢病毒或腺相关病毒。如上所述，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的病毒种类，并且本发明的保护范围之内。

可选地，所述慢病毒的moi为moi=1、moi=0.25，所述腺相关病毒的moi为moi=1×10³、moi=1×10⁴、moi=1×10⁵。如上所述，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的moi，并且本发明的保护范围之内。

可选地，所述细胞为293t细胞、llc-mk2细胞或人源原代细胞。如上所述，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的细胞种类，并且本发明的保护范围之内。

可选地，泊洛沙姆p338的使用量为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml或10mg/ml。如上所述，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的病毒使用量，并且本发明的保护范围之内。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点和效果：

本发明提供了泊洛沙姆p338在1mg/ml浓度下提高病毒对细胞的感染效率的方法和应用，首次证明了（1）泊洛沙姆p338的使用可显著提高病毒感染效率，（2）在较低moi情况下使用较少的病毒量来达到意想不到的良好感染效果。

附图说明

图1为本发明实施例提供的慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在moi=1的情况下对293t细胞的感染效果图。其中，左图为未添加增强剂的效果，中图为添加6μg/ml聚凝胺的效果，右图为添加1mg/ml的泊洛沙姆p338的效果。

图2为本发明实施例提供的慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在moi=0.25的情况下对293t细胞的感染效果图。其中，左图为未添加增强剂的效果，中图为添加6μg/ml聚凝胺的效果，右图为添加1mg/ml泊洛沙姆p338的效果。

图3为本发明实施例提供的慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在moi=10的情况下对llc-mk2细胞的感染效果图。其中，左图为未添加增强剂的效果，中图为添加6μg/ml聚凝胺的效果，右图为添加1mg/ml的泊洛沙姆p338新型增强剂的效果。

图4为本发明实施例提供的腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在moi=1×10³的情况下对293t细胞的感染效果图。其中，左图为未添加增强剂的效果，右图为添加1mg/ml的泊洛沙姆p338新型增强剂的效果。

图5为本发明实施例提供的腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在moi=1×10⁴的情况下对293t细胞的感染效果图。其中，左图为未添加增强剂的效果，右图为添加1mg/ml的泊洛沙姆p338新型增强剂的效果。

图6为本发明实施例提供的腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在moi=1×10⁵的情况下对293t细胞的感染效果图。其中，左图为未添加增强剂的效果，右图为添加1mg/ml的泊洛沙姆p338新型增强剂的效果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的采用的主要步骤如下：

一、泊洛沙姆p338提高慢病毒对细胞的感染，包括以下步骤：

1）慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在辅助剂聚凝胺或者泊洛沙姆p338添加下，感染293t细胞，llc-mk2细胞等；

2）感染48h后，进行拍照，观察荧光信号。

或者

1）腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在未添加辅助剂或者添加泊洛沙姆p338下，感染293t细胞；

2）感染48h后，进行拍照，观察荧光信号。

二、泊洛沙姆p338化合物提高低moi值病毒感染对细胞的感染效率，包括以下步骤：

1）慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在在辅助剂聚凝胺或者泊洛沙姆p338添加下，以moi=1、moi=0.25感染293t细胞

2）感染48h后，进行拍照，观察荧光信号。

或者

1）腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在未添加辅助剂或者添加泊洛沙姆p338下，以moi=1×10³、moi=1×10⁴、moi=1×10⁵感染293t细胞；

2）感染48h后，进行拍照，观察荧光信号。

通过比较荧光信号的比例和强弱，即可得到使用例如1mg/ml的泊洛沙姆p338可以有效提高病毒对细胞的感染效率，同样适用于较低的moi感染。

实施例一、泊洛沙姆p338和慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag共作用于293t细胞

1.293t细胞感染

1.1293t细胞铺24孔板6个孔；

1.2第二天细胞汇合度达到75%左右时安排感染；感染时按照（细胞数×moi值/病毒原液滴度）×10³=病毒加量（μl），在每孔中加入对应的病毒体积；在聚凝胺孔中加入终浓度为1ug/ml的聚凝胺，在泊洛沙姆p338孔中加入终浓度为1mg/ml的泊洛沙姆p338；感染12-20h后弃去培养基，加入新鲜的细胞培养基；感染48h之后进行拍照。

荧光图显示泊洛沙姆p338显著提高慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在较低moi下对293t细胞的感染效率。

参见图1，慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在moi=1的情况下对293t细胞的感染效果图，添加1mg/ml的泊洛沙姆p338的感染效果（右图）优于未添加泊洛沙姆p338的感染效果（左图和中图）。

参见图2，慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在moi=0.25的情况下对293t细胞的感染效果图，添加1mg/ml的泊洛沙姆p338的感染效果（右图）优于未添加泊洛沙姆p338的感染效果（左图和中图）。

实施例二、泊洛沙姆p338和慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag共作用于llc-mk2细胞

1.llc-mk2细胞感染

1.1llc-mk2细胞铺24孔板3个孔；

1.2第二天细胞汇合度达到75%左右时安排感染；感染时按照（细胞数×moi值/病毒原液滴度）×10³=病毒加量（μl），在每孔中加入对应的病毒体积；在聚凝胺孔中加入终浓度为1μg/ml的聚凝胺，在泊洛沙姆p338孔中加入终浓度为1mg/ml的泊洛沙姆p338；感染12-20h后弃去培养基，加入新鲜的细胞培养基；感染48h之后进行拍照。

荧光图显示泊洛沙姆p338显著提高慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在同等moi下对llc-mk2细胞的感染效率。

参加图3，慢病毒plenti-cmv-egfp-3flag在moi=10的情况下对llc-mk2细胞的感染效果图，添加1mg/ml的泊洛沙姆p338的感染效果优于未添加泊洛沙姆p338的感染效果（左图和中图）。

实施例三、泊洛沙姆p338和腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag共作用于293t细胞

1.293t细胞感染

1.1293t细胞铺24孔板6个孔；

1.2第二天细胞汇合度达到75%左右时安排感染；感染时按照（细胞数×moi值/病毒原液滴度）×10³=病毒加量（μl），在每孔中加入对应的病毒体积；在泊洛沙姆p338孔中加入终浓度为1mg/ml的泊洛沙姆p338；感染12-20h后弃去培养基，加入新鲜的细胞培养基；感染48h之后进行拍照。

荧光图显示泊洛沙姆p338显著提高腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag对293t细胞的感染效率。

参加图4，腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在moi=1×10³的情况下对293t细胞的感染效果图，添加1mg/ml的泊洛沙姆p338新型增强剂的感染效果（右图）优于未添加泊洛沙姆p338新型增强剂的感染效果（左图）。

参见图5，腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在moi=1×10⁴的情况下对293t细胞的感染效果图，添加1mg/ml的泊洛沙姆p338新型增强剂的感染效果（右图）优于未添加泊洛沙姆p338新型增强剂的感染效果（左图）。

参见图6，腺相关病毒paav-cmv-mcs-egfp-3flag在moi=1×10⁵的情况下对293t细胞的感染效果图，添加1mg/ml的泊洛沙姆p338新型增强剂的感染效果（右图）优于未添加泊洛沙姆p338新型增强剂的感染效果（左图）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。