Amh基因定点敲入2A-Cre的杂合子小鼠模型构建方法及其应用与流程

本发明涉及生物技术，具体涉及amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型构建方法及其应用。
背景技术：
：卵巢颗粒细胞作为支持细胞对卵泡发育成熟具有重要意义。但是卵巢颗粒细胞的作用机制尚不明确。amh，即抗苗勒氏管激素，由卵巢颗粒细胞分泌，具有调节卵泡细胞发育及分化的作用。由于目前，没有卵巢颗粒细胞内特异性cre转基因工具小鼠，制约了卵巢发育和功能研究的进展。amh基因：抗穆勒氏管激素(anti-mullerianhormone，amh)是转化生长因子β超家族的成员之一，由两个相同的70kd亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140kd；人类amh编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。2a-cre：片段名称。本发明人利用crispr/cas9技术构建amh3’utr定点2a-cre基因敲入小鼠模型。为生殖发育遗传学和卵巢疾病研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。技术实现要素：本发明所要解决的·技术问题在于克服上述不足之处，研究设计amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型及其构建方法与应用。目的基因名称(mgi号)：amh(mgi:88006)目的基因mgi网址链接：http://www.informatics.jax.org/marker/mgi:88006目的基因ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/mus_musculus/gene/summary？g＝ensmusg00000035262；r＝10:80805248-80807648；t＝ensmust00000036016针对的转录本(ensembl号)：amh-201(ensmust00000036016.5)敲入位置：终止密码子处敲入片段名称：2a-cre-polya本发明提供了amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型构建方法，该方法为：利用crispr/cas9技术,通过同源重组的方式，在amh基因终止密码子处定点敲入2a-cre-polya表达框。本发明提供的amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型构建方法，所述小鼠如seqidno.1所示的氨基酸序列具体的，本发明amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型构建方法包括下列步骤：(1)通过体外转录的方式，获得cas9mrna和grna；(2)确定小鼠5号和3号染色体上的amh基因所在位点为site1如seqidno：1所示；设计grna1的设计识别位点如seqidno：2和seqidno：3所示；(3)构建表达grna1的表达载体；通过in-fusioncloning的方法构建同源重组载体(donorvector)，该载体包含4.7kb5’同源臂、1.4kb2a-cre-polya和4.3kb3’同源臂；(4)将cas9mrna、grna和供应载体显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠，经长片段pcr鉴定，共获得3只正确同源重组的f0代小鼠；(5)f0代小鼠与c57bl/6j小鼠(1921年little用abbylathrop的小鼠株，雌性小鼠57号与雄性小鼠52号交配而得的c57bl，为“标准”近交系小鼠)交配获得10只阳性f1代小鼠。本发明最后获得的f1代小鼠为c57bl/6j-amhem(2a-cre)2smoc。本文中相关英文注释：mrna：信使rna，由dna的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息，指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。grna：向导rna，作用于动质体体内一种称为rna编辑的后转录修饰过程中，可与pre-mrna配对，并在其中插入一些尿嘧啶(u)，产生具有作用的mrna。向导rna编辑的rna分子，长度大约是60～80个核苷酸，是由单独的基因转录的，具有3'寡聚u的尾巴，中间有一段与被编辑mrna精确互补的序列，5'端是一个锚定序列，它同非编辑的mrna序列互补。in-fusioncloning：是clontech的in-fusion专利酶，此酶通过识别dna片段和线性化载体末端的15bp同源序列将dna片段和线性化载体高效精确地融合在一起。donorvector：供应载体c57bl/6j小鼠：1921年little用abbylathrop的小鼠株，雌性小鼠57号与雄性小鼠52号交配而得的c57bl，为“标准”近交系小鼠f0代小鼠：原代小鼠f1代小鼠：子代小鼠，由f0代小鼠繁育而成。进一步地，本发明amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型构建方法包括下列步骤：(1)通过体外转录的方式，获得cas9mrna和grna；图1(2)确定小鼠5号和3号染色体上的amh基因所在位点为site1如seqidno：1所示，序列表2，设计grna1的设计识别位点如seqidno：2和3所示，前者为序列表3，后者为序列表4；敲入位点上下游序列信息将2a-cre共表达结构定点插入至终止密码子前。针对amh的第5个外显子设计引物rna。exon5部分序列信息如下(大写为编码区，小写为3’下游序列)：site1(位点1)catcccggagacctaccaagccaacaactgccaaggcgcctgcgcgtggccgcagtctgaccgtaatccgcgctacgggaaccacgtggtgctgctgctaaaaatgcaggctcgcggggctgccctgggccgcctgccctgctgcgtgcccactgcctacgcgggcaagctgctcatcagcctgtccgaggagcgcatcagcgcgcaccacgtgcccaacatggtagccaccgagtgcggctgccggtgacgcccgccctcctcctcccctccccccccccccccgcccccagtcagcgccctaataaagatcagcaaacactcagctggggtatctgtgggtggaggaaactcctgtcaacctcccttctggaatgcaaggcctgagtccttcccatccagccccta上述序列中适宜设计guide-rna的靶序列：seqidno：2guide#1aacatggtagccaccgagtgcggseqidno：3guide#2tcaccggcagccgcactcggtggcas9和grna体外转录结果(图2、表2)表1grna序列(5’-3’)grna1aacatggtagccaccgagtgggggrna2tcaccggcagccgcactcggtgg图2：体外转录cas9、grna电泳结果。表2(3)同源重组质粒构建同源重组质粒图谱(见图3、表3)图3：同源重组载体质粒图谱表3同源重组质粒酶切鉴定(见图4)图4：同源重组载体酶切鉴定电泳图。b：bamhi酶切鉴定结果，理论条带大小为9.1kb、5.8kb、1.3kb；m：1kbdnaladder。图5：同源重组阳性小鼠pcr鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.5kb片段，阴性基因组无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.3kb片段，阴性基因组应扩增出11.1kb片段。(4)f0代小鼠基因型鉴定经受精卵显微注射，本发明共获得16只f0代小鼠。通过长片段pcr的方式，对f0代小鼠的基因型进行鉴定，pcr结果经测序确认，该项目共获得3只正确同源重组的阳性f0代小鼠；同源重组阳性小鼠pcr鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.5kb片段，阴性基因组无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.3kb片段，阴性基因组应扩增出11.1kb片段；同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定结果：双臂同源重组阳性的f0代小鼠为6,7,8号，长片段pcr鉴定电泳结果如图5所示：图5：同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定电泳图。6,7,8为阳性。同源臂重组阳性f0代小鼠pcr鉴定方法：(表4)表4引物序列5'-->3'引物类型ictcctttctctttgcaggggforwardiigcatcttccaggtgtgttcareverse反应体系：反应组件体积(μl)ddh2o13.2gxlpcrbuffer22.5mmdntp2primeri(10pmol/μl)0.5primerii(10pmol/μl)0.5gxldnapolymerase*0.8tailgenomicdna1total20*primestargxl(takara，codeno：r050a)反应条件：同源臂重组阳性f0代小鼠pcr鉴定方法：表5引物序列5'-->3'引物类型iiitgtgtgctctgggaatgaccforwardivaagagtgacagccagaagccreverse反应体系：反应组件体积(μl)ddh2o13.2gxlpcrbuffer22.5mmdntp2primeri(10pmol/μl)0.5primerii(10pmol/μl)0.5gxldnapolymerase*0.8tailgenomicdna1总量20*primestargxl(takara，codeno：r050a)反应条件：(5)f1代小鼠获得及基因型鉴定f0代阳性小鼠与野生型c57bl/6j小鼠交配，繁育获得f1代小鼠。经pcr鉴定及测序确认，共获得阳性f1代小鼠3只，号码为：2,3,4号；f1代小鼠5’和3’同源臂pcr鉴定pcr鉴定策略及方法同f0代小鼠鉴定部分，f1代小鼠5’和3’同源臂pcr鉴定电泳结果如图6所示。pcr鉴定阳性小鼠为：2,3,4,10,11,13,14,15,16,22号；经测序确认均为阳性；图6：f1代小鼠5’同源臂(5’arm)和3’同源臂(3’arm)pcr鉴定电泳图。(数字：f1代小鼠编号；wt：野生型对照；m：1kbdnaladder)上图：5arm鉴定电泳图下图；3arm鉴定电泳图f1代小鼠pcr鉴定测序比对结果f1代阳性小鼠pcr鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。测序反应对应的区域，其中，5’同源臂鉴定，pcr产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：1、2；3’同源臂鉴定，pcr产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：3、4。1#测序反应比对结果见图9：2#测序反应比对结果见图10；3#测序反应比对结果见图11；4#测序反应比对结果，见图12；query为目的序列(amhkirecombinatedgenomicdnasequence)，subject为测序结果。f1代阳性小鼠编号和基本信息f1代阳性小鼠编号和基本信息见表6。表6：f1代阳性小鼠基本信息本发明最后获得的小鼠是c57bl/6j-amhem(2a-cre)2smoc(3)pcr鉴定表7本发明的另一目的是提供了本发明构建方法amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型在筛选制备检测/治疗生殖发育疾病药物中的应用。提供了所述构建方法得到的小鼠模型在筛选制备检测/治疗卵巢疾病药物中的应用。提供了所述构建方法得到的小鼠模型在筛选制备检测/治疗卵巢颗粒细胞的老化和凋亡疾病药物中的应用。本发明首次提供了利用crispr/cas9技术构建amh3’utr定点2a-cre基因敲入小鼠模型，未见任何国内外文献报道。本发明方法构建的小鼠模型为生殖发育遗传学和制备检测/治疗卵巢疾病药物以及相关药物筛选提供有效的实验动物模型，具有良好的医学临床应用前景，在制备检测/治疗卵巢疾病药物中有很大的应用价值，有较大的社会效益。附图说明图1:通过体外转录的方式，获得cas9mrna和grna；通过in-fusioncloning的方法构建同源重组载体(donorvector)，该载体包含4.7kb5’同源臂、1.4kb2a-cre-polya和4.3kb3’同源臂图2：体外转录cas9、grna电泳结果图3：同源重组载体质粒图谱图4：同源重组载体酶切鉴定电泳图b：bamhi酶切鉴定结果，理论条带大小为9.1kb、5.8kb、1.3kb；m：1kbdnaladder。图5：同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定电泳图6,7,8为阳性，m：1kbdnamarker图6：f1代小鼠5’同源臂(5’arm)和3’同源臂(3’arm)pcr鉴定电泳图(数字：f1代小鼠编号；wt：野生型对照；m：1kbdnaladder)图7：f1代小鼠pcr产物测序验证示意图图8:利用crispr/cas9技术建立基因敲入小鼠流程图9:1#测序反应比对结果：图10:2#测序反应比对结果：图11:3#测序反应比对结果：图12:4#测序反应比对结果。具体实施方式实施例使用的原料和试剂除有特别说明外，均由市售得到。实施例1一、实验动物5周龄健康的c57bl/6型小鼠(体重在18±2g)，雌雄各100只，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，经隔离饲养一周后即可达到实验要求的6周龄；6～8周龄健康的icr小鼠60只，雌雄各半，体重在24±2g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，小鼠均在spf级环境下喂养，严格按照动物房管理规定，保证每天温度在22℃，湿度40％～60％，动物房内光照时间和黑暗时间各半，动物实验所有相关操作处理严格遵循动物中心相关管理条例。二、实验试剂cas9nuclease(neb美国)；premixtaqtmpcr酶(takara日本)；dna纯化回收试剂盒(天津tiangen中国)；注射用cas9mrna(北京百奥生物中国)；短链rna纯化试剂盒(invitrogen美国)；孕马血清(pmsg)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)(宁波第二激素厂中国)；ksom培养液(millipore美国)；透明质酸酶、m2、ksom培养基(sigma美国)；小鼠基因组dna提取试剂盒(成都嘉诚中国)；水合氯醛(浙江嘉之源中国)。三、实验方法1.cas9mrna、grna和donorvector制备通过体外转录的方式，获得cas9mrna和grna；通过in-fusioncloning的方法构建同源重组载体(donorvector)，该载体包含4.7kb5’同源臂、1.4kb2a-cre-polya和4.3kb3’同源臂；如图1所示。2.c57bl/6供体雌鼠受精卵准备(1)于下午17：00～18:30之间给供体雌鼠腹腔注射pmsg5iu。(2)48小时后，给每只雌鼠腹腔注射hcg(10iu/ml)0.5ml,将注射后的雌鼠与雄鼠进行合笼，次日上午10:00挑栓。(3)脱颈处死供体见栓雌鼠，取其输卵管，放入提前备好的m2培养液滴的培养皿中。(4)体视显微镜下用注射器针头撕破壶腹部，收集释放出来的受精卵-卵丘细胞复合体。(5)将收集到的细胞用口吸管转移至透明质酸酶液滴中，37℃消化3～5min后，放入平衡好的ksom液滴中，37℃温箱孵育，过夜培养，保证温箱内为5％的co2环境。3.显微注射cas9mrna、grna、donorvector混合物将合成后纯化的grna、cas9mrna、donorvector稀释后等量混合，吸取少量rna混合物加入注射针头中，将针头装入显微注射臂上，取过夜培养的受精卵细胞在m2培养基中洗三次后置于显微注射平台上进行显微注射。将注射成功的受精卵细胞，放入新的ksom培养液中培养0.5h。4.胚胎移植(1)取6周龄的发情icr雌鼠，与结扎的雄鼠合笼，次日受精卵细胞显微注射之后挑栓，于下午进行胚胎移植。(2)装好移卵管，取出温箱中注射后的胚胎，在m2培养液中洗三遍后待用，吸入一定量m2培养基，吸入空气，再吸入要回植的胚胎，再吸入一段空气后，吸入m2培养基，避免虹吸作用，控制移卵管的液体流出。(3)挑选见栓的icr小鼠，称重后按每千克体重5mg剂量进行腹腔给药麻醉。(4)待母鼠失去知觉后，将其侧卧保定，背腹部除毛，酒精消毒后置于纸巾上。体式显微镜下在小鼠最后一根肋骨下皮肤切开一个1cm左右的小创口。(5)根据小鼠的解剖生理位置找到卵巢和输卵管部位，剪开腹壁，用弹性脂肪镊夹持脂肪组织，在体视显微镜下找到输卵管壶腹部。(6)用注射器针头轻轻刺破输卵管壶腹部，将移卵管尖端刺入壶腹部，将胚胎吹入输卵管壶腹部，移植后将组织回填，缝合伤口，同样的操作移植对侧输卵管壶腹部。(7)将母鼠放置到保温台上待其自然苏醒后，放回鼠笼并记录日期、移卵数等信息。待其生产后鉴定。5.f0代阳性鼠的基因型鉴定(1)icr受体雌鼠胚胎回植后将其单独饲养，水料充足妊娠三周后，观察产仔情况并做好记录工作。(2)产仔后，在每只小鼠尾部剪取0.5～1cm组织,加入400μl的buffertl1溶液。(3)再向混合液中加入40μl的蛋白消化酶proteaseplus，65℃水浴半小时以上，注意每隔5分钟混匀一次。(4)消化至管内只剩毛发、骨骼后，加入400μlbuffertl2溶液，待管内出现分层现象，颠倒混匀。(5)水浴锅调至65℃，水浴10min，13400×g离心8min。(6)吸取上清至离心柱，13400×g离心2min后弃液，尽量避免将下层沉淀吸入离心柱中。再加入500μlbufferpw,13400×g离心1min后弃液。(7)用700μlbufferwb洗一次离心柱，13400×g离心1min后弃液。(8)用700μlbufferwb再洗一遍。13400×g空离1min。(9)丢弃下层收集管换成新的1.5mlep管，用100μlbuffereb，13400×g离心1min洗脱收集dna。(10)将回收液重新加入硅胶膜上,13400×g离心1min再次洗脱。(11)用酶标仪检测提取的基因组dna浓度和od260/280值。(12)以提取的小鼠组织dna为模板，进行pcr扩增并送测序。6.获取f1代小鼠选取f0代阳性小鼠与野生型c57bl/6j小鼠交配得到f1代小鼠。f1代小鼠基因鉴定方法与f0代小鼠相同。四、实验结果1.获得小鼠情况f0代小鼠获得16只，其中3只阳性结果，f1代小鼠获得阳性结果10只。2.基因敲入鼠的基因型鉴定结果5’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.5kb片段，阴性基因组无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.3kb片段，阴性基因组应扩增出11.1kb片段。双臂同源重组阳性的f0代小鼠为6,7,8号，长片段pcr鉴定电泳结果如图5所示。序列表<110>上海市中医老年医学研究所<120>amh基因定点敲入2a-cre的杂合子小鼠模型构建方法及其应用<130>/<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>8400<212>dna<213>musmusculus<400>1taggacacacagccgacttctctgtcctcaaagcatctttcccttagtgttgccaagagc60ccccaggtgctgataagtaccatccctactggcaatctccagaagcaggagggggaggct120ggctgttgcagtcactgcccctggagcccctctgcagaggcccctgggtgacgtggccta180gccagaagaccaatcacatggccagcaggagcccagggacccaagttgccaagagtcccc240tttggcaggcagggtccgtcctggggaggctgtgacacagcacctccctcctcatactct300tcttggacttcaacagctgcccctgcatagagtgctgggttgggttgccctccctcactt360taggtcctagccagtggccttaggcagagaagccaggccttgtgttgaggaaccctgttc420tgttgtgcacacacagcacataacagccccatcccttctgttgcagtgaccaagcagagg480gacacagagatgggccagcagagcctgctgttccaggtgaggtgggaccagtcaggggtg540gaccagacacacgggtggtgatgccaatagtgctgtgcatgttttacagattgactaccc600tgagatcgcagagggtatcatgccacgccaccgtttcatgtctgcttatgagcagaggat660cgagcctccagaccgccgctggcagtacctgctcatggctgctgagccctatgagaccat720tgctttcaaggtagcgaccctacaggacagagagagcagctaaattcagctgtctgtgta780tcctagcccctccttggggtgctgcagcctctgactttctccctaggtgccaagccggga840gattgacaaggctgagggcaagttttggacccactggaacagagaaaccaagcaggtgag900gttccacaggccttgcgtgggtactctctcagcgctcctcagtggccctgccccagtcac960tgaccctctctcctacagttttttcttcagttccactttaagatggagaagcccccagca1020cctcccagcctcccagcaggacccccaggcgtcaagcggcccccgcccccactcatgaat1080ggactgcctcctcgcccaccactccctgatgccttgcccccacctccacctggtggcctg1140cctctccctcctatgccccccactgggcctgctccctctgggccccctggacctccccag1200atgcccccaccagctcctggggtgcaccccccggccccagtagtacacccaccaacatct1260ggagtccatcccccagctcctggggtacaccccccagcaccagtggtccatccaccaaca1320tctggggtccatcccccagcccctggagtgcacccacccacccctggagtgcacccacca1380gccccaggagtgcacccaccagctccaggtgtccacccaccagctccaggggtacacccc1440ccaactccaggggtgcacccaccagctccaggggtgcacccaccagctccaggggtgcac1500ccaccagctccaggggtacaccctcctccatcagctggagttcatcctcaggctccaggg1560gtacacccacctgctcctgcagtacaccctcaagcccctggggtacaccccccagcccct1620gggatccaccctcaggcaccaggggttcaccctcagccgcctcctggagtccaccctgct1680gccccgggggtccaccctcagcctccaggggttcacccctcaaatcctggggtgcaccct1740gctcctatgccccccatgctgaggcccccactcccctcagatggccctgggaacatgcct1800ccccctcccccaggcaactgagcagtccccccaccagcctctgttgtctgtgtggtcttt1860tcccattgccagtccttggaaggttttctatttgtcctgccttgagcctattaaacagcc1920tcccccgtgtctccctgtctgctgtgtgtttggtagtggggagggtggatactgcttgtc1980tctgttgaagctgtggtgacctggggcgtcctccaggtgggctccccagggagatgggag2040ctactcaaggacagctcaggcctctgcagttatgggcccagctctgaggacagaaagccc2100tttgagacagtcgcctcccacctgctgggcatgaaaagtgccaggcactgtcccccaagg2160tcacctttggtgttgataggggcgtccctcccaagcaagcaatctggctcagccatacat2220ataagcagggccacccggaccttgctgtaccaccgtacgtgatggactctgtctcagcgc2280ccatgatgccttgggactgagtgagttagggcagaagctgggggaggggggtttggggga2340gggggcctcgctggattgctaggcagaaccttatacaccctttcaggaactgtagtgggc2400aagatggcaggacacaccccaatgatcacaccttccagacagatgacagcagagctgctg2460tgtccttacaagcaaggtctccacaccttggatcagggtccctcaggcctacatggcccc2520agaagatctccagtgaagagtccagctgagggaatttctgtaggacagatcttgagggac2580tgaagctaatggcctcagagactcagtcaaccaatatttgcccacaggtaccagagactg2640gcatgggcccatcccctaacagccttctggttgaggttgtgccaaatggaagggttggtg2700gggttaggagtacacctgggaggctattcccagtatggcaggggtggtgcctgtagcctg2760accatcttccccagtcctgctgacaagagtccctgtgtccacaggtaggtcctggcagag2820gggaggggacagagtggaaggaagctgcccttaaccccagccctcagccagcacgtgccc2880accctctacaggtgcgcacagggatggaggaggaactgggacgttggagggggtagttgg2940tccaccatagcctcttgtgctcacagctggcccacttcgttctattccagaggaagcgga3000gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatg3060gtgcccaagaagaagaggaaagtctccaacctgctgactgtgcaccaaaacctgcctgcc3120ctccctgtggatgccacctctgatgaagtcaggaagaacctgatggacatgttcagggac3180aggcaggccttctctgaacacacctggaagatgctcctgtctgtgtgcagatcctgggct3240gcctggtgcaagctgaacaacaggaaatggttccctgctgaacctgaggatgtgagggac3300tacctcctgtacctgcaagccagaggcctggctgtgaagaccatccaacagcacctgggc3360cagctcaacatgctgcacaggagatctggcctgcctcgcccttctgactccaatgctgtg3420tccctggtgatgaggagaatcagaaaggagaatgtggatgctggggagagagccaagcag3480gccctggcctttgaacgcactgactttgaccaagtcagatccctgatggagaactctgac3540agatgccaggacatcaggaacctggccttcctgggcattgcctacaacaccctgctgcgc3600attgccgaaattgccagaatcagagtgaaggacatctcccgcaccgatggtgggagaatg3660ctgatccacattggcaggaccaagaccctggtgtccacagctggtgtggagaaggccctg3720tccctgggggttaccaagctggtggagagatggatctctgtgtctggtgtggctgatgac3780cccaacaactacctgttctgccgggtcagaaagaatggtgtggctgccccttctgccacc3840tcccaactgtccacccgggccctggaagggatctttgaggccacccaccgcctgatctat3900ggtgccaaggatgactctgggcagagatacctggcctggtctggccactctgccagagtg3960ggtgctgccagggacatggccagggctggtgtgtccatccctgaaatcatgcaggctggt4020ggctggaccaatgtgaacatagtgatgaactacatcagaaacctggactctgagactggg4080gccatggtgaggctgctcgaggatggggacgtcagcgccctaataaagatcagcaaacac4140tcagctggggtatctgtgggtggaggaaactcctgtcaacctcccttctggaatgcaagg4200cctgagtccttcccatccagcccctaactcccgtgtgtccctctcacttttctgatttca4260aaacaggatctgtgtagccctggtggtcctggaactctaactcactcactctcaccctct4320ctctcctctctctgctctctcttctctctctcttctctcctctctcgaccagcttgcctc4380tgtctccccagtgctaggattaaactcctggaccctgtcactttttaattagttaattaa4440tttgttatgtgtggcggggagagataggtgtctggccggaaggaagttaaagcaggagaa4500atgcttcaagtcagcctgaaattaaagagcaaaactgtttcaaaaacaggggagctggag4560aaatggctcagccccaaaggacacttgcacaccccaacatacacgcgcccagatctttaa4620aagcaaaacaaacagccaagtatagcggtgcacacctgtcaccccagcactctggaggtg4680gacccaagaggatcaggacttaaagccaggcttggttgcacaggcttacgcaggcgcata4740gggtacagatggattgcagaaggcagaactaagtggagttcattccgtgtgggtcgcgag4800atcgaactcaggcggtcaggcttggcagcaagcgcctttacccatttcactatctcaccg4860gccctatccccatctctgcgacccttagggtccaggcacaaaggagtagatgatcttgct4920gtcacaacacggcctttatttgctggtgctacagggagaagggacacaggattcgcccag4980gggacacaggatcagtcacgccccttccctcgcttctgtctgggccggtcatcacggtca5040tgccttcgccggggagcccaggcctgcagcttcccatgctcgaggaggtccctggagtcc5100cgtccccatggccgacggcctccttcccgcgcctcccagcgccgtggcagtgattgacgg5160ggctccccagtgacctgtgacttatcctctctcctcggcttctcccttctcggcttctcc5220ttcttcagtttctcccctttacttggcttctctttccgtggcttctcctgggaccctcgg5280tccccaaggggtacgctctcctccccagaggcttccgagatggaccctccacgttctacc5340cgggtttctgtagcttcagggctcccgggaagctcaggctcatcctgcatccgtgcctgg5400ggtggcccaggcttcggctgaggagacccggatggagacaccaaaaccggaggcttaggc5460tgccaagagacaaagtggggacttgggatccgcgtgctcaggcctggtctccttctccct5520tggtgagcagccccatcaggtgaaatctctggaaggaaggcttaccgctggcgacgcttc5580cttctttggtggagagctgggcgggacccatgggtgaggggcagccacgacctccccagc5640cactgcgtctgaaaggcaggcagtctgaagtggaggaatgagcacagccacccacctctt5700ctttgccctcacccccagaactccactgggataccccaacctcctcctagagacctctct5760tttttctctttggagtggccattccccgcccccagctgcacgagggttgctagcaataat5820aatcgtgggggcgatcctctgctccaggatgaagtggagaacccttctcggatggagtgg5880gaggacccggctcagtcgtgtatgtctgtcatcctggctggaggaatgctgaggcacaag5940gattgccatgagacccaggctagcttgtgcctttgtaaagggagcccttgattcaaaaca6000aaagccagggcccaaggtatactcctgccattcctagatcttgggaggtcaaagtaggga6060gggtcaggagaccagcctaagctacatagagaggttgaggtcttgagagttttgtctttt6120ttctttcttttttttttcttttctttttttctttttctttttcttttcttttcttttttt6180tttttttaaggtctggatggtggtggcacactttccagcattcaggagggagagacaggc6240agagctctctaagtttgtggccagcctggaatatatattggattccagccagctagggct6300acatagtgagactctgtctcaaaatgaatgaatgaatgaatgaatgaatgaatgaatgaa6360tgaaaagctcagaacatctggaactaggcctggttgtgaaacttaaggtagacaccataa6420aactaggagctaggtgtgaccgtgggcctctcaggctggcggactggctattccaggaat6480aggggcagagacgcttgaggataaggtttgtaggaacagaagagtcgcagcctgggcaag6540gctacagggaatgcccccaacccctgtggagaccctgtcttgtggagctcaccccgacac6600agctgaagagccgagcccagcagggccaccagcgaggccagtaccaggcacttgttgagc6660gtcagatctccccagggcaggtcatcgcttggcgtccttgggggcggctgcaggggaggc6720gggggcggctgcaggggaggcggagcctgcggcttcctacgtgcaggaacgatccggggg6780cctgaaggacaagcatggatccgcctgtcgcctatggttcctactccgtcccagtgtgca6840gaccatccccacctgctcaccctcccccgagcagacccacttgttcccgctttgccagct6900gtgctctccttgcccgctagctctt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