调控Bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸及其应用的制作方法

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种反义寡核苷酸，具体涉及一种调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸以及其在制备用于慢性粒细胞白血病化疗增敏、阻止慢性粒细胞白血病进展和抑制耐药的药物和制备用于治疗伴bcl-x剪接异常肿瘤药物中的应用。

背景技术：

选择性剪接(alternativesplicing)是指一个信使核糖核酸(mrna)前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mrna剪接异构体，使最终的蛋白产物会表现出不同或者相互拮抗的功能和结构特性。bcl-x是bcl-2家族成员之一，其通过选择性剪接主要生成两种剪接异构体，bcl-xl和bcl-xs，bcl-xl是重要的抗凋亡蛋白，而bcl-xs则是重要的促凋亡蛋白，两者生物功能相互拮抗，表达处于平衡状态，当bcl-x基因的剪接发生异常时，bcl-xl/bcl-xs比值显著上调，现已证实这是乳腺癌等肿瘤发生、发展的关键分子事件，同时也是肺癌等肿瘤出现化疗抵抗的重要分子基础。如今，慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,cml)作为起源于造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病也面临着化疗抵抗及耐药的问题，靶向bcr-abl的第一、二代酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors,tkis)的化疗耐药已成为其治疗的最主要障碍，尤其是加速期和急变期cml对化疗药物的抵抗更加严重，患者预后极差，应用tkis或其它化疗药物治疗均无法取得长期疗效。本发明申请人前期研究发现，cml中bcl-x基因发生异常剪接大量转录生成bcl-xl，而bcl-xs相应减低，致bcl-xl/bcl-xs比值显著增高，应用第一代tkis伊马替尼(imatinib，im)能纠正cml细胞中该异常剪接事件，并且bcl-xs表达增加是imatinib诱导cml细胞凋亡的重要机制之一。

早在19世纪70年代，反义核苷酸(aon)的概念就被学者提出，它是指一段与靶基因mrna互补的一段单链dna或rna序列，通常由十几到几十个碱基组成，通过碱基互补原理，干扰基因的复制、转录、mrna的剪接加工、输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长分化等。迄今，反义核苷酸类药物成为科学研究的一个热点，也为抗病毒及抗肿瘤治疗提供了新的思路。然而，它也存在着天然的弊端。以第三代反义核苷酸—吗啉反义寡核苷酸(antisensemorpholinooligomer,amo)为例，其最大的缺陷在于特殊的分子结构导致其不带有任何电荷，使得amo无法被细胞表面的任何受体所识别，同时无法通过转染的方式导入到细胞内。因此只有通过物理损伤细胞膜的方式才能将amo分子导入细胞，这个缺陷极大限制了amo的应用。为此，genetools公司开发出了一种特定的传送载体，称之为“三嗪八胍结构树”，该载体的核心为一个三嗪核，三嗪核共有三个n-末端，相对的两个n-末端分别结合四个胍头结构，第三个n-末端则和amo共轭结合。该载体内的八个胍头结构能通过静电引力、氢键与胞膜结构中的磷脂结合，高效携带amo穿越胞膜结构到达胞浆和胞核。这种载体与amo共轭结合形成一个具有转运功能且具有生物学效应的整体，即vivo-morpholino反义寡核苷酸(vivo-morpholinoantisenseoligomer，vmo)(参见uspatentno.7935816及图2)：。

人类基因选择性剪接的调控机制主要有三种，分别为剪接增强、抑制和综合调控机制。其中，剪接增强调控主要由外显子增强子(exonicsplicingenhancer,ese)和内含子增强子(intronicsplicingenhancer,ise)完成，ese和ise能通过结合各种剪接调控蛋白来增强5′或3′剪接位点的剪接，从而增加含有这些外显子的mrna的比例。目前，尚未见有调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸对治疗cml以及相关化疗药物增敏有疗效的报道，研究开发出此类反义寡核苷酸以改变cml患者体内bcl-xl和bcl-xs比例，进而试图阻止cml进展，增强其对tkis等化疗药物的敏感性，是目前临床治疗的迫切需要。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有cml治疗中出现的化疗抵抗及耐药的问题，提供一种调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸可在减少bcl-xl生成的同时，增加bcl-xs的表达，将能有效消除cml进展和形成耐药的分子基础，从而阻止cml进展，增强其对tkis等化疗药物的敏感性，同时还可用于伴bcl-x剪接异常肿瘤的治疗。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸，所述核苷酸包含如下序列：5′-gcttggttcttacccagccgccgtt-3′(seqidno.1，下划线处为外显子2b和内含子2交界处)。

所述反义寡核苷酸是经过如下结构修饰的吗啉反义寡核苷酸：

其中，b每次出现时独立地为碱基配对部分。

上述结构是基于vivo-morpholinos技术，将amo与特定载体共轭结合形成的一个具有转运功能和生物学效应的整体，该特定载体核心为一个三嗪核，三嗪核共有三个n-末端，相对的两个n-末端分别结合四个胍头结构，第三个n-末端则和amo共轭结合(参见uspatentno.7935816及图2)。该载体内的八个胍头结构能通过静电引力、氢键与胞膜结构中的磷脂结合，高效携带amo穿越胞膜结构到达胞浆和胞核。

本发明所述的反义寡核苷酸作用的bcl-x基因序列为：5′-caggag[aacggcggctgggtaagaaccaagc]cccttgtgtgtc-3′(seqidno.2，其中，大写字母表示外显子序列，小写字母表示内含子序列，中括号内为互补结合区)。

本发明所述的反义寡核苷酸在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。

本发明还提供了一种用于治疗慢性粒细胞白血病的药物组合物，该药物组合物包括药理学有效剂量的本发明所述的调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸以及药理学可接受的载体。本发明所述的反义寡核苷酸以及所述载体可被制备成脂质体、纳米材料、微乳液、微球、凝胶或囊泡等剂型，这些剂型的制备方法和所用的辅料均为现有技术，给药方式可为经静脉、腹腔注射等。

进一步的，本发明所述的治疗是指慢性粒细胞白血病的化疗增敏、阻止慢性粒细胞白血病进展或抑制耐药。

作为本发明优选的实施方案，本发明所述的用于治疗慢性粒细胞白血病的药物组合物，除含有本发明所述的调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸以外，还含有酪氨酸激酶抑制剂。

酪氨酸激酶抑制剂(tkis)为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物，包括第一代药物伊马替尼，第二代药物达沙替尼和尼罗替尼。酪氨酸激酶抑制剂主要通过抑制bcr-abl融合蛋白，从而发挥抗白血病作用。

本发明还提供了一种用于治疗伴bcl-x剪接异常肿瘤的药物组合物，包括药理学有效剂量的权利要求1或2所述的调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸以及药理学可接受的载体。本发明所述的反义寡核苷酸以及所述载体可被制备成脂质体、纳米材料、微乳液、微球、凝胶或囊泡等剂型，这些剂型的制备方法和所用的辅料均为现有技术，给药方式可为经静脉、腹腔注射等。

作为本发明优选的实施方案，本发明所述的用于治疗伴bcl-x剪接异常肿瘤的药物组合物，除含有本发明所述的调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸以外，还含有化疗药物。

综上，本发明具有的有益效果为：

本发明的反义寡核苷酸可直接调控bcl-x基因的异常选择性剪接，特别是结合vivo-morpholinos技术后，可规避反义核苷酸的弊端，发挥它在调控bcl-x基因的异常选择性剪接的优点，在减少bcl-xl生成的同时，增加bcl-xs的表达，有效消除cml进展和形成耐药的分子基础，从而增强对tkis等化疗药物的敏感性，阻止cml进展，本发明的药物可单独使用，或者联合化疗药物使用，用于cml及伴bcl-x剪接异常肿瘤的治疗。

附图说明

图1为本发明vmo直接调节bcl-xpre-mrna剪接示意图；

图2为本发明vmo结构示意图；

图3为本发明实施例倒置荧光显微镜观察荧光标记vmo在48h转染k562/g01细胞(a)，流式细胞仪检测不同vmo量在48h对应胞内荧光强度(b-c)；

图4为本发明实施例cck8法检测不同处理组中k562/g01细胞活力(a)；不同处理组对应k562/g01细胞的ic50值(b)；

图5为本发明实施例流式细胞术检测不同处理组对k562/g01细胞凋亡的作用(48h)(a)；不同处理组条件下k562/g01细胞凋亡率(b)；

图6为本发明实施例vmo处理前后细胞胞内bcl-xl和bcl-xsmrna比值的表达变化；

图7为本发明实施例qpcr进一步验证不同处理前后细胞胞内bcl-xl/bcl-xs比值的表达变化；

图8为本发明实施例bcl-xl部分测序图，箭头位置为2a、2b外显子连接处(a)；bcl-xs部分测序图，箭头表示2a、3外显子连接处(b)；

图9为本发明实施例不同处理组胞内bcl-xl和bcl-xs蛋白变化(a)；不同处理组bcl-xl/bcl-xs比值变化(b)；

图10为本发明实施例裸鼠注射细胞量为5×10⁶后一周左右有明显的瘤体长出实图；

图11为本发明实施例解剖取出瘤体展示并测量瘤体体积；

图12为本发明实施例vmo各处理组瘤体生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。

实施例

一、vmo转染k562/g01细胞效率及稳定性试验

本发明设计的靶向调控bcl-x选择性剪接的vmo序列如下：5′-gcttggttcttacccagccgccgtt-3′(seqidno.1，下划线处为外显子2b和内含子2交界处)，对应bcl-x基因序列为：5′-caggag[aacggcggctgggtaagaaccaagc]cccttgtgtgtc-3′(seqidno.2，大写字母表示外显子序列，小写字母表示内含子序列，中括号内为互补结合区)。(见图1)

本发明所述vmo序列由genetools公司合成(结构式见图2)，采用的k562/g01细胞株购自中国医学科学院天津血液研究所。将合成的vmo序列3′端以荧光素fam标记后，使用pbs配成浓度为1μm。于37℃，5％co2，10％小牛血清，饱和湿度条件下在rpmi1640培养基中(配合endo-porter试剂使用，具体参见endo-porter试剂说明书)与耐药cml细胞株k562/g01共孵育24h，48h，72h，96h。在不同时间点取k562/g01细胞以pbs洗至无游离荧光，流式细胞仪检测胞内荧光强度，得出阳性百分率。同时离心细胞制备涂片，荧光显微镜下观察胞内荧光分布，计算vmo的转染效率，确定vmo转染后在胞内的稳定时间。

结果显示，荧光显微镜观察48h大量细胞发荧光(图3.a)，同时流式细胞仪检测胞内荧光强度，得出阳性率为77.74％。为了进一步优化用量，取2μl，4μl，6μl，8μl，10μl量的vmo分别加入含k562/g01的6孔细胞培养板中，于饱和湿度条件下37℃，5％co2共孵育48h，不同量vmo对应的流式检测转染k562/g01细胞阳性率依次为11.31％，36.63，42.7％，77.74％，54.97％(图3.b-c)，说明8μlvmo在48h后能成功高效的转染目的细胞。

二、vmo调控bcl-x剪接逆转k562/g01细胞对im敏感性

采用cck8实验检测细胞增殖情况。本部分实验中共有4个处理因素，分别为im、对照试验的随机序列(rs-vmo)+im、vmo+im和空白对照组；vmo使用浓度根据genetools公司建议用量并在实验中进行优化后为1μm。取对数生长期细胞调整细胞密度，向三块96孔细胞培养板中每孔接种(2～3)×105个k562/g01细胞，试验中im浓度梯度为：0.2μmol/l，0.4μmol/l，0.8μmol/l，1.6μmol/l，3.2μmol/l。每一药物浓度设4个复孔，置于37℃5％co2的培养箱中培养48h后。每孔加入10μlcck8溶液，在细胞培养箱内继续孵育24h，取出培养板在摇床上摇动1min充分混匀，于450nm处测定吸光度(od)，取4孔的平均od值，根据所得od值计算k562/g01细胞生长抑制率，实验重复三次。计算公式：细胞活力(％)＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100％.。以药物浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标，在半对数坐标纸上画图，分别求出不同组细胞对im化疗药物的ic50值。

结果显示，根据计算得出im和im+vmo处理48h后k562/g01细胞活力(图4.a)，随着im浓度增加，rs-vmo与单独im处理组相比，细胞活性几乎无变化，提示vmo试剂几乎无毒性作用。相同时间作用下，与单独im组比较，im+vmo组的k562/g01细胞活力明显降低，表明vmo增加k562/g01细胞对im敏感性，抑制其细胞活性。通过k562/g01半抑制药物浓度(ic50值)计算：以不同药物浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，并计算出k562/g01细胞在细胞活力为50％时所对应im浓度值，即ic50值。与单独im组比，im+vmo组的k562/g01细胞对im的ic50显著降低，提示vmo增强k562/g01细胞对化疗药物im的敏感性(图4.b)。(*p﹤0.05，**p﹤0.01，***p﹤0.001)

三、vmo调控bcl-x剪接调控诱导k562/g01细胞的凋亡

采用流式细胞仪检测经各处理因素处理后的k562/g01细胞的凋亡情况。技术路线：收集悬浮细胞到15ml的离心管中，1000r/min离心5min，去除培养液，培养基重悬细胞，调整细胞浓度为(2～3)×106/ml；向6孔细胞培养板中每孔接种(2～3)×105个细胞，设置4个处理因素，分别为im、vmo、vmo+im和空白对照组；用上述同样方法处理k562/g01细胞，培养48h后收集不同处理组对应的k562/g01细胞，经预冷的pbs洗涤三次后，重悬于100μl反应缓冲液中，加入annexinv-fitc染液(美国bd公司)和pi染液(美国bd公司)各5ul，轻轻混匀，室温避光保存15min，再加入400μlpi缓冲液，将制成的细胞悬液上机检测，实验重复三次。

细胞凋亡结果判断：annexinv-fitc染色和pi染色均阴性为正常活细胞；annexinv-fitc染色阳性，细胞核pi染色阴性为早期凋亡细胞；细胞核pi染色和annexinv-fitc染色均阳性为中晚期凋亡细胞。细胞凋亡率＝早期凋亡率(annexinv-fitc阳性，pi阴性)+中晚期凋亡率(annexinv-fitc阳性，pi阳性)。

结果显示，流式细胞仪测定空白对照组、im、vmo以及im+vmo四组不同处理条件下的细胞凋亡情况，k562/g01细胞凋亡率呈逐渐上升趋势(图5.a)；单独im和单独vmo均可诱导部分k562/g01细胞凋亡，但总的凋亡率显著低于im+vmo组，且这种变化趋势与上述cck8法检测不同处理组对k562/g01细胞活性的结果相一致。参见不同处理条件下k562/g01细胞凋亡率的直方图(图5.b)。

四、vmo联合im有效调节bcl-xl/bcl-xsmrna比值

本发明从mrna和蛋白质水平两个层次来检测该vmo调控bcl-x异常剪接影响k562/g01细胞的增殖，实验中共有4个处理因素，分别为im、对照试验的随机序列(rs-vmo)+im、vmo+im和空白对照组。

1、mrna检测使用rt-pcr，并采用qpcr方法进行验证。

技术路线如下：

按照trizol试剂(invitrogen公司)说明提取细胞总rna。①收集细胞离心，弃上清，按比例每5×106个细胞加入1mltrizol试剂，反复吹打悬浮细胞，移入无核酶ep管中，室温静置3～5min；②加入0.2ml氯仿/1mltrizol，剧烈震荡15s，室温静置3-5min；③4℃、12,000rpm/min、离心15min，离心后混合物分三层，rna主要存在于最上层的无色水相层，转移至无核酶ep管中，勿吸中间层(动作尽可能轻柔，避免动作过大导致三层液体出现混合)；④根据实际情况，轻轻吸取上层水相400-600ul至新的无核酶ep管中，加入0.5ml异丙醇/1mltrizol，颠倒混匀，室温放置30min，中间每10min颠倒混匀一次；⑤4℃、12,000rpm/min、离心10min，弃上清，留下胶状沉淀物；⑥沿管壁加入1ml75％无水乙醇(用无水乙醇和无核酶水现配现用)洗涤rna沉淀，颠倒混匀数次，于4℃、12000rpm/min离心5min；⑦倒掉上清后，室温干燥rna沉淀，然后根据沉淀物量加入适量的depc水(约20ul～50ul)溶解rna，-80℃保存备用。吸取2μlrna样品加至100μl三蒸水的检测杯中，根据标准操作程序，测定所提取rna浓度和a260及a280值。

按照takara逆转录试剂盒操作说明书对提取的总rna进行反转录，配制反应体系见表1。其中，总rna的加入量为100ng，根据其浓度算出所加入的体积。在配制体系的过程中，加样需要尽量精确，避免操作误差，同时所有加样操作都需在冰上完成。体系配制完成后，点动混匀并离心，放置pcr扩增仪上进行逆转录，反应条件设置为37℃15min、85℃5s及4℃60min，逆转录结束后及时取出。其产物即为模板cdna，用于后面目的基因的pcr扩增，-20℃保存备用。

表1rna反转录反应体系

利用目的基因相应的模板cdna、特异的扩增引物及其他必须试剂，按照一定的反应体系，在pcr扩增仪上完成各种目的基因的扩增。各目的基因的扩增引物序列、退火温度及扩增产物大小如表2(其中gapdh作为本实验的内参)：

表2pcr反应引物序列

按照以下pcr扩增反应体系2×taqpcrmastermix10μl，上下游引物各1μl，cdna2μl及dh2o6μl，总反应体积为20μl进行加样，点动混匀，离心后放入pcr扩增仪进行扩增，反应条件为：95℃5min；(95℃30s；退火温度(见表2)35s；72℃30s)35个循环；72℃延伸5min；以gapdh作为内参。反应结束后，取pcr产物10μl，进行2％琼脂糖凝胶电泳。利用bio-rao凝胶成像仪进行图像检测，并用其分析软件(imagelab)进行定量分析。

结果显示，按照上述条件同时提取4个不同处理组细胞的rna，经过逆转录、pcr扩增和琼脂糖电泳，pcr琼脂糖电泳条带显示：与单独im和单独vmo组处理k562/g01细胞相比，im+vmo组的bcl-xlmrna表达量显著降低，同时bcl-xsmrna表达量明显升高。bcl-xl和bcl-xsmrna进行灰度值半定量分析，则bcl-xl/bcl-xs比值下降更明显(图6)。通过qpcr检测上述同样处理组中k562/g01细胞胞内bcl-xl和bcl-xsmrna相对表达量，结果与rt-pcr结果基本相符(图7)。为了进一步证实扩增条带为目的条带，本发明申请人将qpcr扩增产物送至上海生工测序，并通过blast进行比对，结果显示bcl-xl反应体系扩增出来164bp亮条带为bcl-xl(图8.a)；bcl-xs反应体系扩增出来的104bp条带为bcl-xs(图8.b)，均为本实验的目的条带。

2、采用western-blot方法检测bcl-xl和bcl-xs蛋白表达水平

技术路线如下：

收集不同处理组的细胞，按照试剂说明书操作步骤，进行细胞总蛋白提取，定量检测合格后，进行sds-page电泳。①首先使用80v电压恒压电泳约40min左右，待样本完全从浓缩胶进入分离胶后，然后再调整其电压为120v恒压电泳约2h左右，直到溴酚蓝至分离胶下缘即可立即关闭电源，终止电泳。②剥胶，将其转移至缓冲液中。③随后将聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，pvdf)膜放在甲醇中浸泡使之激活后放置于1×转膜缓冲液中平衡20min左右；根据目的蛋白分子量进行切胶，转膜夹按照海绵垫、三层滤纸、胶、pvdf膜、三层滤纸和海绵垫的自下到上的顺序依次叠放，将转膜夹固定好，按照指定的位置插入电泳槽中，调整恒流为260ma，根据分子量大小选择转膜时间，进行转膜。④转膜结束以后，然后再将pvdf膜浸泡于封闭液中，在水平摇床上缓慢摇动2h左右；⑤取出封闭好的pvdf膜置于盛放1×tbst的皿中，放在摇床上缓慢摇动，清洗四遍，每次8min；⑥孵育一抗：用一抗稀释液对一抗体进行稀释(bcl-x稀释：1:4000；内参稀释：1:1000)，将pvdf膜完全浸没于稀释后一抗液中，置于4℃冰箱过夜，次日取出膜后用1×tbst缓冲液在摇床上漂洗四次，室温，每次8min；⑦孵育二抗：用1×tbst或者封闭液稀释二抗(anti-rabbit：1:10000)，将pvdf膜完全浸没于二抗液中，于摇床上缓慢摇动1～2h；⑧洗膜后暗室曝光拍照存图，利用bio-rao凝胶成像仪进行图像检测，并用其分析软件(imagelab)进行定量分析，实验重复三次。

结果显示，按照上述相同条件提取4个不同处理组细胞的总蛋白，通过相关软件分析，经过蛋白电泳、转膜、孵抗体和曝光后，最终得到蛋白条带结果如下(图9a)。bcl-xl在vmo联合im处理之后表达量明显降低，同时bcl-xs表达量明显升高(图9b)。说明，im联合vmo转染k562/g01细胞对im耐药性的逆转很有可能是通过影响bcl-xl/bcl-xs比值介导的细胞凋亡。

五、vmo处理耐药cml细胞裸鼠移植瘤模型

构建耐药cml细胞裸鼠移植瘤模型：取5周龄balb/c裸鼠，于实验前1d用sliprecise直线加速器全身照射，每只裸鼠总剂量为300cgy,以增加cml急变细胞的致瘤率。收集对数生长期的k562/g01细胞，用pbs洗涤2次，去除培养液，离心浓集，以pbs调整细胞密度为5×107个/ml后，迅速送入无特殊病原菌级动物实验室。在每只裸鼠的右腋下皮下注射0.2ml(1×107个)细胞，可见在皮下形成液泡，小心抽出针头，以防液体漏出。作好标记后继续常规饲养。用普通k562细胞进行裸鼠成瘤实验，成功长出瘤体，实验顺利(见图10)。

取k562细胞成瘤实验成功的裸鼠以imatinib灌胃，同时以vmo分高、中、低剂量进行瘤内注射，并于随后的饲养过程中每间隔一定时间(时间间隔根据vmo稳定性实验确定)加注半量，检测瘤体变化。4周后取瘤体称重并测量瘤体体积(图11)。根据计算公式：v＝1/2×a×b2计算肿瘤体积，其中a、b分别为瘤体的长、短径。结果显示，高剂量组vmo注射的小鼠瘤体生长速度明显低于中剂量和低剂量组，而低剂量组小鼠瘤体生长速度最快。(图12)。

序列表

<110>南昌大学第二附属医院

<120>调控bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

gcttggttcttacccagccgccgtt25

<210>2

<211>43

<212>dna

<213>未知()

<400>2

caggagaacggcggctgggtaagaaccaagccccttgtgtgtc43

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

cagcctcaagatcatcagca20

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<211>20

<212>dna

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<400>4

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<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

atggcagcagtaaagcaagcg21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>6

tcatttccgactgaagagtga21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>7

atggcagcagtaaagcaagcg21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>8

tcatttccgactgaagagtga21