一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状相关的snp分子标记及其应用，利用该snp分子标记可以挑选出含肉率高体型的杂交黄颡鱼“黄优1号”，属于黄颡鱼遗传育种领域。

背景技术：

分子标记辅助育种是利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行间接选择，是对目标性状在分子水平的选择，选择强度大，不受环境影响，结果可靠，可加速育种进程。而单核苷酸多态性(snp)作为新一代分子标记已经在育种领域得到认可，具有多态性高、遗传稳定和检测方便等优点，已广泛应用于动植物分子育种研究领域。类胰岛素生长因子2(insulin-likegrowthfactor2，igf-2)是最早发现的内源性印记基因，是促进生长分裂的一个潜在因子，并且在调控生长、代谢和繁殖方面也有着重要的作用。在鱼类中，主要研究了虹鳟鱼、半滑舌鳎、大马哈鱼、斑马鱼等，其在鱼类鳃、肾、肠、心、脑等组织中均有表达。但目前snp位点应用在分子标记辅助育种较少，对应到生长相关基因(如igf-2)联合snp位点进行分子辅助育种应用的报道更少，而有关在杂交黄颡鱼“黄优1号”与生长性状相关igf-2基因的snps研究至今尚未见报道。

黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)，别称黄角丁、黄骨鱼、昂刺、刺黄股等，属于鲶形目(siluriformes)，鲿科(siluridae)，黄颡鱼属(peteobagrus)，主要分布于长江流域，珠江流域等中国东部各太平洋水系。在人工养殖过程中存在着黄颡鱼个体小、生长速度慢的缺点，在高密度池塘养殖中，鱼体整体规格偏小，通过杂交育种，可以显著提高杂种后代生活力、经济性状并获得杂种优势。本文中的杂交黄颡鱼“黄优1号”是由经二代选育的瓦氏黄颡鱼(pseudobagrusvachelli)♂与三代选育的黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)♀组合的杂交后代，经试验发现，其生长速度高于母本，个体大，抗逆性强，肉质鲜美，与父本瓦氏黄颡鱼相比，品质和市场接受度相应提升，显示出良好的市场前景，有较高的经济价值，近年来消费急增。但在杂交规模化制种和养殖过程中，苗种存在一定的畸形率和体型分化，为了早期筛选出含肉率高体型的杂交黄颡鱼“黄优1号”，找到与生长性状连锁的分子标记，从而为该新品种的高效养殖提供技术支撑，迫切需要开发杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状相关的snp分子标记。

技术实现要素：

发明目的：针对上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状相关的snp分子标记，即利用杂交黄颡鱼“黄优1号”igf-2基因编码区上与生长性状显著相关的snp位点进行分子标记辅助育种。

本发明第二个目的是提供用于检测上述snp分子标记的一对引物。

本发明的第三个目的是提供上述snp分子标记的应用。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状相关的snp分子标记，所述的snp分子标记来源基因(igf-2基因)的转录组序列如seqidno:1所示，自5’端起，在该序列的第118位存在snpc.118c>t的snp位点，即所述snp位点位于seqidno:1上第118位，碱基为t或c。

igf-2seqidno:1:

tttggggacagagtcacacacatgcatacatctctacagtacaatctgggaaaactacctgttttttcctaccaaatacgacgaattctttttctatttccgtttttttgttttgtttttgatttttgtgacactgacatggagcaagaacacaacctcagttaccattctgtttgccacagttgcatgaggagaaacagtggcatcgataagggccgaaagctgtgctcgtccagtcagatgctcgtatgcacgcttgttttatccctctgcctgtttcaaatggctgcagcagagacgctgtgcggcggagaattggtggatgcgctgcagttcgtgtgcgaagacagaggcttctatttcagtaggccaataagcaggtcgaatagccgacgttctcaaaaccgtgggattgtcgaggagtgttgttttaggagttgtgatcttacactattggaacagtactgtgccaagccagccaagtcagagagggacgtctcagccacttcccttcaggtcatacctgtgatgccagcattaaaacagaattccccaagaaagcatgtcactgtaaaatattccagcattggagtctggcaacaaaatgcagcccagagactacgaagaggcatcccagctatcctgagatcgagaaagttcagccctcaggcacagaagaaaaaaaaccaggaacaggccaatgtccacaaacgtcttatcacacttcccagcaaacgccctcccttatggcatcccacagaagactacgtaagacacaagtgaagacaggacagtttgctctgagttacaagagtagaggatcatagctttgtatctggcttaatttctgtgatggtcctctacatcctgcctccctccctcacacataaatgtttgaaatcttccagtccttacatttgctgttttgttcatcaacacagacaaacgggactgaaataaggatggaagttgacagtttggatgaccgaagatcaggtggatgctaaaaatattaaagaggcacaagggaagtatatacgatgatagagatacatggcttgcaagagtcaatggacagtcgtttcggaggacctcagaactgctagcatggacaataagcattcaacaacattctcccatggcagaagtatatcttcacagttaatccgtatcattattatttactttgcaccgctcactataaagggacatccacactgttaaggaattgttttgtaaaaaattagattcctgttccagcaccttctaatcacaaacaaaaaagcagaaaagtgtctgcaaattgcacattgccacggattacgtcagagttcttgttgagtaaataaaggcactatttttttacggacaataaacgtgtagctcaaaaaaatgtcatggtgctagcgttgtgaatggactcaaaggaaaggaggtttgaaaagcacgtttttttgttcttcaaataattattaagctttccgttttaaggaaagtgacttacaaagaggtaaaatgagcatatcggttgtggcaatgtgtgaagagggtgccactgtgtatggacatgtctggtatcaaaatgtgcaacagtcgtgccgtgccccccttgcttcagttctcaccgcactcaactgaaggagctgtacgtgaggacacagaaagggtgatgctcaggcctggactgcacatagccctggccttgcactgcaggaagtgggagtaaagggacttggaataagtgggatgtttttttaaccttctgttttcttttcaagaagatgtttaaaaaaagggtaaatcaaaacctgttcagtctctggtaccgtgatgttcctgttgatgcaaaattgacttttttggtcctttacgttgagatgttactttactgttctgaagaaaggcacaaatattatttcaaagggaataaatacgcaataatttcaactaacatttatttttaaatttgtatcagtagtattcacatgcttttgcctgaaaacagatacttgaatatataaattttaaaatacatactttatatat

所述snpc.118c>t位点的cc基因型个体的体长、体长/头长2个生长性状显著高于tt基因型个体。

用于检测所述的snp分子标记的引物对，其上游引物序列为5’-tttggggacagagtcacacac-3’(seqidno:2)；下游引物序列为5’-tcgatgccactgtttctcct-3’(seqidno:3)。

用于检测所述snp分子标记的试剂盒，其包含所述的引物对。

所述的snp分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在杂交黄颡鱼“黄优1号”选育中的用途，进一步为在检测杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状中的用途，所述生长性状包括体长、体长/头长2个生长性状。

一种检测杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状的方法，包括通过对待测杂交黄颡鱼“黄优1号”进行所述的snp分子标记的检测，确定所述待测杂交黄颡鱼“黄优1号”的生长性状，包括体长、体长/头长两部分数据，包括以下步骤：

提取待测杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组dna，利用权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒进行pcr扩增，检测权利要求1所述snp位点基因型是tt、tc还是cc，最后进行不同基因型与黄优1号生长性状的相关性分析，所述生长性状为体长、体长/头长。

所述检测杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状的方法，具体包括以下步骤：

a)杂交黄颡鱼“黄优1号”群体的获得；

b)杂交黄颡鱼“黄优1号”尾鳍dna提取；

c)基于权利要求3所述的引物对，对杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组dna进行pcr扩增，以获得pcr扩增产物；

d)对pcr扩增产物进行测序，基于测序结果，确定snp分子标记的基因型；

e)snpc.118c>t位点基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状的相关性分析。

通过对杂交黄颡鱼“黄优1号”基因组dna提取、pcr扩增、扩增产物测序以及测序结果分析，所述snpc.118c>t位点的cc基因型个体的体长、体长/头长2个生长性状显著高于tt基因型个体。

本发明以杂交黄颡鱼“黄优1号”igf-2基因的单核苷酸多态位点为研究目标，发现位于igf-2基因外显子区域的snp位点(snpc.118c>t)与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长显著相关，其中snpc.118c>t位点的cc基因型个体的体长，其性状显著高于tt基因型(p<0.05)个体；snpc.118c>t位点的cc基因型个体的体长/头长，其性状极显著高于tt基因型(p<0.01)个体。在以生长性状为选育指标，培育含肉率高体型的食用杂交黄颡鱼“黄优1号”个体养殖研究过程中，可以优先选择snpc.118t>c位点基因型为cc的个体为养殖对象，这对于提高杂交黄颡鱼“黄优1号”的养殖效益具有重要的指导意义。

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1)本发明公开的snp位点可以进行分子标记辅助育种，可以不受杂交黄颡鱼“黄优1号”的年龄、性别等限制，可用于杂交黄颡鱼“黄优1号”的大规格苗种挑选和分体型，从而提高杂交黄颡鱼“黄优1号”的含肉率，并显著增加杂交黄颡鱼“黄优1号”的养殖经济效益。

2)通过seqidno:2和seqidno:3所示的一对引物，检测如seqidno:1所示核苷酸序列自5’端第118位snp位点的方法，准确可靠，操作方便。

附图说明

图1：tt基因型杂交黄颡鱼“黄优1号”igf-2基因自5’端第118位点测序部分峰图；

图2：cc基因型杂交黄颡鱼“黄优1号”igf-2基因自5’端第118位点测序部分峰图

图3：tc基因型杂交黄颡鱼“黄优1号”igf-2基因自5’端第118位点测序部分峰图

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

本发明基于seqidno:2和seqidno:3所示的一对引物，通过对杂交黄颡鱼“黄优1号”基因组dna提取、pcr扩增、扩增产物测序以及测序结果分析。得到了一个与培育含肉率高体型的杂交黄颡鱼“黄优1号”、促进其生长相关的snp位点(snpc.118c>t)，可应用于杂交黄颡鱼“黄优1号”早期体型挑选和培育。

实施例

a)杂交黄颡鱼“黄优1号”群体的获得；

b)杂交黄颡鱼“黄优1号”尾鳍dna提取；

c)基于所述snp引物，对杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组dna进行pcr扩增；

d)对pcr扩增产物进行测序，基于测序结果，确定snp的基因型；

e)snp位点基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状的相关性分析；

f)snp位点应用于杂交黄颡鱼“黄优1号”不同体型的挑选。

具体操作如下：

a)杂交黄颡鱼“黄优1号”群体的获得：

本发明实验用鱼均为池塘养殖鱼类于2018年6月取自江苏南京市水产科学研究所禄口基地，共计2龄杂交黄颡鱼“黄优1号”253尾。用游标卡尺和电子天平测量其体长、全长、头长、尾柄长、体高、尾柄高、体宽、吻长、眼径、眼间距、体重这11项生长计量性状并计算出11项标准化性状包括肥满度、体长/头长、眼径/吻长、体长/体高、体长/体厚、体长/尾柄长、头长/吻长、头长/眼径、体高/体厚、尾柄长/尾柄高、体长/全长。剪取鱼体尾鳍于95％乙醇-20℃保存，用于基因组dna提取。

b)杂交黄颡鱼“黄优1号”dna的提取：

(1)取15mg尾鳍，加入400μlaclsolution，剪碎，再加10μl的proteinasek，震荡混匀1分钟，置于55℃裂解约2h，至裂解液澄清。

(2)然后依次加入300μlextsolution和300μlabsolution，用力摇匀，在12,000rpm离心5分钟。

(3)将枪头穿过上层溶液深入到下层溶液中，将溶液仔细吸出到gencleancolumn中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀。

(4)8000rpm离心1分钟，取下gencleancolumn，倒掉收集管中废液。

(5)将gencleancolumn放回收集管中，加入500μlwashsolution，8,000rpm室温离心1分钟。

(6)重复步骤(5)一次。

(7)取下genclean柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12,000rpm室温离心1分钟，以除去残留washsolution。

(8)将柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱中央加入60μlelutionbuffer，室温放置2分钟。然后12,000rpm室温离心1分钟。离心管中的液体即为所提取的dna，-20℃保存。

c)基于所述snp引物，对杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组dna进行pcr扩增

pcr产物扩增长度为213bp，pcr引物为：

上游引物：5’-tttggggacagagtcacacac-3’

下游引物：5’-tcgatgccactgtttctcct-3’

pcr反应体系为20μl:2×taqmastermax10μl，正反向引物各0.8μl，dna模板1μl，灭菌水7.4μl。

pcr反应共计35个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后于72℃延伸5min。

扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的pcr产物于-20℃保存用于后续的测序反应。

d)对pcr扩增产物进行测序，基于测序结果，确定snp的基因型

基于hiseq2000高通量测序平台，对上述的杂交黄颡鱼“黄优1号”253尾个体的pcr扩增产物于abi3730测序仪上进行双向测序。基于测序结果，将杂交黄颡鱼“黄优1号”snp位点基因分型。

e)snp位点基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状的相关性分析

杂交黄颡鱼“黄优1号”253尾个体的snp位点基因型与生长性状如表1所示：(见末尾表1)

根据表1的数据，利用spss(19.0)glm程序，根据性状及试验群体的特点，构建线性分析模型从而进行基因多态性与性状间的关联分析：yij＝u+gi+eij式中，yij为性状表型值，u为群体均值，gi为标记为基因型效应(i＝1，2，1，4)，eij为随机残差效应。统计数据用平均值±标准误表示。snp位点基因型与生长性状相关性如表2所示，只列出与snp位点显著相关的生长性状。

表2杂交黄颡鱼“黄优1号”igf-2基因snp位点与生长性状的相关性

注：表中体长、体长：头长的表达方式为均值±标准差。snpc.118c>t不同基因型的体长、体长：头长具有显著差异(p<0.05)，其中体长:头长表现为极显著差异(p<0.001)。

结果显示：snpc.118c>t三种基因型中tt基因型频率最高，但对比各基因型体长与头长比发现，cc基因型个体体长/头长显著高于tt基因型。表明在培育多肉型可食用杂交黄颡鱼“黄优1号”的过程中，利用snpc.118c>t进行目标基因筛选的必要性，也表明snpc.118c>t是一个与生长显著相关的snp位点。

f)snp位点应用于杂交黄颡鱼“黄优1号”分子标记辅助育种

如上文所述杂交黄颡鱼“黄优1号”igf-2基因上，snpc.118c>t位点的cc基因型个体的体长、体长/头长两个生长性状显著高于tt基因型个体，但tc基因型个体的体长与体长/头长两项性状相较于tt、cc基因型没有显著差异。因此可以优先选择snpc.118c>t位点基因型为cc的个体作为育种亲本。

本发明选取253尾杂交黄颡鱼“黄优1号”的样本，通过对每个个体igf-2基因的单核苷酸多态位点分析，发现snpc.118c>t与杂交黄颡鱼“黄优1号”的体长与体长/头长两项生长性状存在显著的相关性，并且能够有效地支持此次实验结果。因此，在多肉食用型杂交黄颡鱼“黄优1号”的选择育种过程中，可以优先选择snpc.118c>t位点基因型为cc的个体作为育种亲本，能够有效辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育杂交黄颡鱼“黄优1号”优良品种。

表1，其中：

a.杂交黄颡鱼“黄优1号”253尾个体snp位点基因型与11项生长计量性状

b.杂交黄颡鱼“黄优1号”253尾个体snp位点基因型与11项生长标准化性状a

b

注：：体长、全长、头长、尾柄长、体高、尾柄高、体宽、吻长、眼径、眼间距的单位为(cm)，体重单位为(g)。

序列表

<110>南京师范大学

<120>一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”生长性状相关的snp分子标记及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2046

<212>dna

<213>igf-2(igf-2)

<400>1

tttggggacagagtcacacacatgcatacatctctacagtacaatctgggaaaactacct60

gttttttcctaccaaatacgacgaattctttttctatttccgtttttttgttttgttttt120

gatttttgtgacactgacatggagcaagaacacaacctcagttaccattctgtttgccac180

agttgcatgaggagaaacagtggcatcgataagggccgaaagctgtgctcgtccagtcag240

atgctcgtatgcacgcttgttttatccctctgcctgtttcaaatggctgcagcagagacg300

ctgtgcggcggagaattggtggatgcgctgcagttcgtgtgcgaagacagaggcttctat360

ttcagtaggccaataagcaggtcgaatagccgacgttctcaaaaccgtgggattgtcgag420

gagtgttgttttaggagttgtgatcttacactattggaacagtactgtgccaagccagcc480

aagtcagagagggacgtctcagccacttcccttcaggtcatacctgtgatgccagcatta540

aaacagaattccccaagaaagcatgtcactgtaaaatattccagcattggagtctggcaa600

caaaatgcagcccagagactacgaagaggcatcccagctatcctgagatcgagaaagttc660

agccctcaggcacagaagaaaaaaaaccaggaacaggccaatgtccacaaacgtcttatc720

acacttcccagcaaacgccctcccttatggcatcccacagaagactacgtaagacacaag780

tgaagacaggacagtttgctctgagttacaagagtagaggatcatagctttgtatctggc840

ttaatttctgtgatggtcctctacatcctgcctccctccctcacacataaatgtttgaaa900

tcttccagtccttacatttgctgttttgttcatcaacacagacaaacgggactgaaataa960

ggatggaagttgacagtttggatgaccgaagatcaggtggatgctaaaaatattaaagag1020

gcacaagggaagtatatacgatgatagagatacatggcttgcaagagtcaatggacagtc1080

gtttcggaggacctcagaactgctagcatggacaataagcattcaacaacattctcccat1140

ggcagaagtatatcttcacagttaatccgtatcattattatttactttgcaccgctcact1200

ataaagggacatccacactgttaaggaattgttttgtaaaaaattagattcctgttccag1260

caccttctaatcacaaacaaaaaagcagaaaagtgtctgcaaattgcacattgccacgga1320

ttacgtcagagttcttgttgagtaaataaaggcactatttttttacggacaataaacgtg1380

tagctcaaaaaaatgtcatggtgctagcgttgtgaatggactcaaaggaaaggaggtttg1440

aaaagcacgtttttttgttcttcaaataattattaagctttccgttttaaggaaagtgac1500

ttacaaagaggtaaaatgagcatatcggttgtggcaatgtgtgaagagggtgccactgtg1560

tatggacatgtctggtatcaaaatgtgcaacagtcgtgccgtgccccccttgcttcagtt1620

ctcaccgcactcaactgaaggagctgtacgtgaggacacagaaagggtgatgctcaggcc1680

tggactgcacatagccctggccttgcactgcaggaagtgggagtaaagggacttggaata1740

agtgggatgtttttttaaccttctgttttcttttcaagaagatgtttaaaaaaagggtaa1800

atcaaaacctgttcagtctctggtaccgtgatgttcctgttgatgcaaaattgacttttt1860

tggtcctttacgttgagatgttactttactgttctgaagaaaggcacaaatattatttca1920

aagggaataaatacgcaataatttcaactaacatttatttttaaatttgtatcagtagta1980

ttcacatgcttttgcctgaaaacagatacttgaatatataaattttaaaatacatacttt2040

atatat2046

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tttggggacagagtcacacac21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcgatgccactgtttctcct20