一种硫酸软骨素酶的筛选，鉴定及优化表达的制作方法

本发明涉及一种硫酸软骨素酶的筛选，鉴定及优化表达，属于生物工程技术领域。

背景技术：

硫酸软骨素酶(chondrosulphatase，简称chsase)是能够将硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸等糖胺聚糖降解成不饱和二糖及寡糖的1种裂解酶。chsase根据其作用底物的不同分为chsaseabc、chsaseac、chsaseb及chsasec等。硫酸软骨素酶在生物化工及医药领域具有重要的应用价值，在基础研究中，它可以作为工具酶，用于硫酸软骨素质量研究和高效制备具有多种生物活性的硫酸软骨素低聚糖；在医药上，硫酸软骨素酶做为药用酶，具有降解囊性纤维变性部位的黏液、促进神经轴的再生、减轻腰椎间盘突出的症状、抗肿瘤和增强软骨细胞与软骨之间的黏附力等多种药用功能。硫酸软骨素酶主要来源于微生物，且多为裂解酶，肝素黄杆菌、彭氏变形杆菌和温和气单孢菌、普通变形杆菌等均可产硫酸软骨素裂解酶。然而大多数微生物来源的硫酸软骨素裂解酶为胞内酶且酶活力较低。陶科等人(硫酸软骨素裂解酶abc产生菌的筛选及发酵工艺研究[j].中国抗生素杂志,2004,(29)3:138-140.)曾报道过利用一株彭氏变形杆菌发酵生产chsase，该过程工艺较为复杂，而且在发酵后期，chsase的酶活下降较为明显，整个过程的最高酶活仅为322.17u/l。苏昕等人(发酵法制备硫酸软骨素裂解酶及其酶分离纯化的研究[j].微生物学杂志,2005,(25)4:64-67.)报道了从鱼腹中筛选得到的一株温和气单孢菌，虽然其产酶能力较高，但是需要经过1步透析和4步柱层析的纯化工艺，过程较为复杂，成本较高，不利于工业放大。除了发酵来源微生物进行产酶，li等人(expression,purificationandcharacterizationofgapdh-chsaseabcifromproteusvulgarisinescherichiacoli[j].proteinexpressionandpurification,2016,(128):36-41.)也报道了将来源于变形杆菌的chsase在大肠杆菌中进行异源表达，为提高chsase的表达量，报道中共表达了甘油醛-3-磷酸脱氢酶，但是纯化后的酶活却降低了3.1倍，因此不利于工业放大。目前国内没有产品供应，几乎全部依靠进口，价格非常昂贵，限制了硫酸软骨素酶在制备低分子硫酸软骨素和医药方面的应用，因此，筛选高酶活的硫酸软骨素酶具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂等处采集土样，污水或淤泥进行筛选，鉴定出一种硫酸软骨素酶。取适量土样，用生理盐水浸提，经富集培养后，梯度稀释涂筛选平板，比较并挑选透明圈与菌株直径比值最大的菌落，将该菌落接种到液体发酵培养基中培养并提取菌群基因组进行宏基因组测序，分析并筛选出硫酸软骨素酶可能性最高的序列，然后人工合成该序列并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进一步鉴定与优化表达，所用表达载体为质粒pbrsfduet-1、pht01、pht43-his、pma5或pwb980。本发明从自然界中筛选鉴定出一种硫酸软骨素酶，其氨基酸序列与ncbi(全称nationalcenterofbiotechnologyinformation)报道的已知硫酸软骨素酶最高相似度为85％，然后在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中优化表达，实现了高酶活的硫酸软骨素酶高效生物合成，其最高酶活为11976.5u/l。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素酶从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂等处采集土样，污水或淤泥进行筛选，鉴定得到的其氨基酸序列与ncbi报道的硫酸软骨素酶最高相似度为85％。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素酶在工程菌株大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中优化表达，包括大肠杆菌mg1655，大肠杆菌dh5α，大肠杆菌w3110，大肠杆菌bl21，枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌wb600、枯草芽孢杆菌wb800等宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株进一步优选为枯草芽孢杆菌，因为该菌种安全性更高，应用范围更广泛。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素酶基因的表达载体为质粒pbrsfduet-1或pht01。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素酶基因进行优化表达，包括密码子优化、核糖体结合位点rbs优化、启动子优化等。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基组分为：酵母粉12～18g/l，葡萄糖32～48g/l，硫酸钾3.2～4.8g/l，硫酸镁1.8～2.2g/l，磷酸盐缓冲液40～60mm，fecl2·6h2o为10.8～16.2mg/l；mncl2·4h2o为0.8～1.2mg/l；zncl2为1.36～2.04mg/l；cucl2·2h2o为0.344～0.516mg/l；ph5～9。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株发酵方法为将重组菌接种至发酵培养基，在30～40℃发酵20～80h。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素酶的酶活测定方法为：将发酵液超声破碎细胞，12000rpm4℃离心20min取上清作为粗酶液；粗酶液经过mbp柱纯化(10mm的麦芽糖洗脱)。将40微升适当稀释的酶液加到960微升的底物溶液中(2g/l的c4s溶于20mm的tris-hcl)基于动力学的酶活测定方式取1min内的初始反应速率。酶活定义:单位时间内每消耗1微摩尔的底物所需要的酶量定义为一个酶活单位。

本发明还提供所述的硫酸软骨素酶在医药、化妆品、生物领域制备含低分子量硫酸软骨素的产品中的应用。

本发明相对现有技术的有益效果如下所示：本发明从自然界中筛选鉴定出一种硫酸软骨素酶，其氨基酸序列与ncbi报道的硫酸软骨素酶最高相似度为85％，然后在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中优化表达，表达载体为质粒pbrsfduet-1、pht01、pht43-his、pma5或pwb980，实现了高酶活硫酸软骨素酶的高效生物合成，其最高酶活为11976.5u/l，而且整个工艺和后处理相对更简单，在医药、化妆品、生物领域制备含低分子量硫酸软骨素的产品中具有潜在而广泛的应用价值。

附图说明

图1所示为硫酸软骨素酶优化表达的大肠杆菌载体构建示意图；

图2所示为硫酸软骨素酶优化表达的枯草芽孢杆菌载体构建示意图；

图3所示为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中优化表达硫酸软骨素酶摇瓶上培养50h的酶活。

具体实施方式

实施例涉及的氨基酸序列信息：

seqidno.1序列信息为本发明从自然界中筛选鉴定出的新型硫酸软骨素酶氨基酸序列。

实施例1：硫酸软骨素酶的筛选与鉴定

从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂等处采集土样，污水或淤泥，取适量土样，用生理盐水浸提，经富集培养后，梯度稀释涂筛选平板，37℃培养3天后，挑选出有透明圈的菌落进行复筛。所用的筛选培养基(g/l)为：硫酸软骨素4.5，氯化铵2.5，氯化钠0.95，硫酸镁1.0，磷酸氢二钾1.0，琼脂20.0，牛血清白蛋白5.0，ph7.0。在复筛平板中比较并挑选透明圈与菌株直径比值最大的菌落，将该菌落接种到液体发酵培养基中培养并提取菌群基因组进行宏基因组测序，分析并筛选出硫酸软骨素酶可能性最高的序列，将筛选出硫酸软骨素酶可能性最高的氨基酸序列与ncbi报道的硫酸软骨素酶进行对比，最终结果为该酶与ncbi报道的硫酸软骨素酶最高相似度为85％，然后人工合成该序列并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进一步鉴定，结果证明该酶确实是硫酸软骨素酶。

实施例2：在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中优化表达硫酸软骨素酶

表达系统的构建：

使用引物cs(pbrsf)-f/cs(pbrsf)-r通过pcr扩增csdna片段(使用人工合成csdna为模板)，将所得的csdnapcr产物与骨架pbrsfduet-1组装(使用引物pbrsf-f/pbrsf-r扩增)以产生pbrsfduet-1-cs重组质粒。

使用引物cs(pht)-f/cs(pht)-r通过pcr扩增csdna片段(使用人工合成csdna为模板)，将所得的csdnapcr产物与骨架pht01组装(使用引物pht01-f/pht01-r扩增)以产生pht01-cs重组质粒。

重组菌的构建：

分别向大肠杆菌mg1655，大肠杆菌dh5α，大肠杆菌w3110，大肠杆菌bl21，转入重组质粒pbrsfduet-1-cs，得到重组菌csmg，csdh，csw300，csbl。

分别向枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌wb600、枯草芽孢杆菌wb800转入重组质粒pht01-cs，得到重组菌cs168，cs600，cs800。

硫酸软骨素酶优化表达的大肠杆菌载体构建如图1所示；硫酸软骨素酶优化表达的枯草芽孢杆菌载体构建如图2所示。

引物信息如下：5’-3’方向

分别挑取上述构建的7株重组菌株及对照菌(大肠杆菌转化pbrsfduet-1空质粒，枯草芽孢杆菌转化pht01空质粒)单克隆接种于5mllb培养基，根据需要添加相应的抗生素(大肠杆菌加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素(kan)，枯草芽孢杆菌加入终浓度为25ug/ml的氯霉素)，置于200rpm37℃培养10h，然后按10％的接种量转接于装液量为25ml的250ml三角摇瓶，培养基为发酵培养基，根据需要添加1.5mmol/liptg的诱导剂和相应的抗生素(大肠杆菌加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素，枯草芽孢杆菌加入终浓度为25ug/ml的氯霉素)，然后置于220rpm37℃培养，培养50h后进行酶活测定。硫酸软骨素酶的酶活测定方法为：将发酵液超声破碎细胞，12000rpm4℃离心20min取上清作为粗酶液；粗酶液经过mbp柱纯化(10mm的麦芽糖洗脱)。将40微升适当稀释的酶液加入960微升的底物溶液中(2g/l的c4s溶于20mm的tris-hcl)基于动力学的酶活测定方式取1min内的初始反应速率。酶活定义:单位时间内每消耗1微摩尔的底物所需要的酶量定义为一个酶活单位。酶活测定结果如图3所示，重组菌都能实现高酶活硫酸软骨素酶的高效生物合成，其中csdh的硫酸软骨素酶的酶活较高，达为11976.5u/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>南京汉欣医药科技有限公司

<120>一种硫酸软骨素酶的筛选，鉴定及优化表达

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