KCP基因在宫颈癌紫杉醇敏感性检测中的应用的制作方法

文档序号：18145658发布日期：2019-07-10 11:47阅读：1049来源：国知局

本发明涉及生物医学领域，具体涉及kcp基因的应用。

背景技术：

宫颈癌是危害全球女性健康的第四位常见恶性肿瘤。据2012年统计，全球每年宫颈癌新发病例53万，新增死亡病例27万。我国是新发病例和死亡病例最多的国家，每年新发病例达13.15万，新增死亡人数约5.3万，占我国女性恶性肿瘤死亡人数的18.4％。在不发达国家宫颈癌5年生存率不高<50％，尤其是ⅲ-ⅳ期，其生存率仅为5％-15％，宫颈癌严重威胁女性生命。虽然多年来拥有完善的宫颈癌筛查体系，可以早发现，早治疗。但是，基于我国国情，直至目前近一半宫颈癌患者就诊时已为中晚期，并有年轻化趋势。

紫杉醇(paclitaxel)为基础一线化疗应用于所有中晚期宫颈癌患者，对紫杉醇不敏感的宫颈癌患者，会导致五年生存率降低20％-30％，紫杉醇作为一线药物治疗中晚期宫颈鳞癌患者敏感率为57.7％-80％，腺癌81％；而作为二线药物或者单药化疗药物，其总敏感率为20％-40％。美国和日本研究报道，对于局部晚期宫颈癌患者，20％患者对紫杉醇为基础新辅助化疗不敏感而导致治疗失败。

目前尚未发现特异性评估紫杉醇敏感性的标志物，若对紫杉醇不敏感宫颈癌患者进行试验性化疗，增加患者经济费用和化疗副反应，甚至导致疾病进展。因此，寻找评估紫杉醇是否敏感特异标志物，筛查出哪些患者会在紫杉醇为基础化疗中获益，哪些会导致耐药，对改善患者预后及延长患者生命尤为重要。

技术实现要素：

本发明通过全基因组crispr/cas9-pool文库筛选技术在宫颈癌siha细胞中筛选出紫杉醇的潜在增敏基因，通过混合sgrna靶点进行增殖抑制效应实验与化疗敏感性协同系数统计。高内涵筛选方法找到了7个潜在的增敏基因，进一步通过单靶点验证实验，发现kielin/chordin样蛋白(kielin/chordin-likeprotein,kcp)基因敲除后能够实现紫杉醇的增敏效应，kcp单靶点(05002-1)增敏倍数最高。通过功能试验证明，敲除kcp基因增加siha细胞对紫杉醇敏感性，主要表现为抑制细胞增殖和克隆。

根据本发明，提供一种宫颈癌紫杉醇治疗敏感性标志物，所述标志物为kcp基因，kcp基因序列如seqidno:1所示，kcp基因作为标志物用于评价宫颈癌患者对紫杉醇的药物敏感性。

根据本发明，提供一种宫颈癌紫杉醇治疗敏感性标志物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)全基因组crispr/cas9敲除技术筛选siha细胞中紫杉醇化疗增敏基因，选择倍数变化fc、贝叶斯因子bf满足以下筛选条件的基因作为候选基因：

在药物组中fcpaclitaxel≤-2，在对照组中|fcdmso|<2；并且

在药物组中bfpaclitaxel>2，在对照组中bfdmso<0；

(2)高内涵筛选单靶点敲除后增加紫杉醇化疗敏感性基因，针对上述步骤(1)筛选出的候选基因，每个基因6个靶点，选择在4ng/ml紫杉醇作用下增敏倍数大于1.5的sgrna靶点为阳性靶点；

(3)针对上述步骤(2)筛选出的基因靶点，通过细胞毒实验mtt法检测紫杉醇给药后的增殖抑制率、细胞克隆能力和细胞凋亡率，满足以下筛选条件中的任意两者或两者以上的即为宫颈癌紫杉醇敏感性相关基因靶点：

增殖抑制率显著增强，细胞克隆能力显著减弱,细胞凋亡率显著升高。在根据本发明的一种实施方式中，上述“显著增强”、“显著减弱”、“显著升高”的判断标准为统计分析中与对照组相比p<0.05。

根据本发明，提供一种kcp基因在制备宫颈癌紫杉醇治疗敏感性检测产品中的应用，其中，所述检测产品为检测试剂或检测试剂盒。宫颈癌紫杉醇治疗敏感性检测试剂包括kcp基因序列完整性检测试剂和/或kcp基因表达产物检测试剂。宫颈癌紫杉醇治疗敏感性检测试剂盒包括上述宫颈癌紫杉醇治疗敏感性检测试剂。上述检测产品通过检测kcp基因的序列完整性或者kcp基因的表达产物来评估受试宫颈癌患者对紫杉醇药物化疗的敏感性，从而据此判断该宫颈癌患者对紫杉醇药物化疗的适用性。

上述kcp基因序列完整性检测试剂包括但不限于检测kcp基因突变位点的引物、探针和其他所需试剂。

根据本发明，提供一种宫颈癌紫杉醇治疗敏感性检测试剂盒，所述试剂盒包括kcp基因序列完整性检测试剂和/或kcp基因表达产物检测试剂。

根据本发明，提供一种组合物，该组合物包括紫杉醇和kcp抑制剂，所述kcp抑制剂包括kcp基因表达抑制剂和/或kcp受体阻断剂。所述kcp抑制剂通过抑制kcp基因的表达和/或阻碍kcp蛋白发挥作用而提高紫杉醇治疗敏感性，从而与紫杉醇发挥协同作用。本发明提供的上述组合物用于宫颈癌治疗，可以单独使用，也可以配合放疗使用。

本发明提供的上述技术方案均基于kcp基因与宫颈癌紫杉醇治疗敏感性之间的关联，kcp基因作为特异性的宫颈癌紫杉醇治疗敏感性标志物，填补了该领域长久以来的技术空白，不仅提供了宫颈癌紫杉醇药物敏感性检测靶点，有助于预先评估宫颈癌患者对于紫杉醇化疗的效果，还提供了配合宫颈癌放疗、化疗及手术治疗的新靶点。本发明提供的宫颈癌紫杉醇治疗敏感性检测试剂盒能够预先评估宫颈癌患者对紫杉醇化疗的受益程度和耐药情况，对改善患者预后及延长患者生命尤为重要。本发明提供的宫颈癌治疗组合物通过kcp抑制剂对紫杉醇敏感性的增强来大大提高紫杉醇化疗效果，有助于宫颈癌的治疗。在治疗之前检测宫颈癌患者是否对紫杉醇药物敏感，将大大有利于后续治疗方案的选择。

附图说明

图1示出实施例1中紫杉醇差异候选基因相对sgrna在紫杉醇、dmso处理后分别在第0天(d0)、第7天(d7)、第14天(d14)的相对数量分布。

图2-1至图2-3示出实施例3中kcp基因对紫杉醇诱导宫颈癌细胞功能研究结果，其中图2-1示出细胞增殖抑制率测试结果，图2-2示出细胞克隆能力测试结果，图2-3示出细胞凋亡率测试结果。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施方式对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下至给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及kcp基因的dna序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及seqidno:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及kcp基因的dna序列，实际也包括相应的rna序列。

实施例1全基因组crispr/cas9敲除技术筛选siha细胞中紫杉醇化疗增敏基因

全基因组crispr/cas9文库慢病毒感染宫颈癌siha细胞，分别与紫杉醇化疗药物(药物组)和dmso溶剂(对照组)共培养7天及14天后，高通量测序分析结果(kcp转录本的rna序列分别为seqidno:2(第一个)、seqidno:3(第二个)和seqidno:4(第三个))，选择倍数变化(foldchange，fc)、贝叶斯因子(bayesfactor，bf)满足以下筛选条件的基因作为候选基因。

筛选条件：

在药物组中fcpaclitaxel≤-2，在对照组中|fcdmso|<2；并且

在药物组中bfpaclitaxel>2，在对照组中bfdmso<0。

满足上述筛选条件的基因说明该基因的敲除导致siha细胞对于紫杉醇药物的敏感性增加，作为紫杉醇差异候选基因。

按上述方法共筛选出差异候选基因475个，包括7^thday101个，14^thday374个。紫杉醇差异候选基因相对sgrna在不同时间点分布见图1。

图1所示的相对信号箱形图表示高通量测序中的sgrna频率分布。y轴表示在不同时间点每个细胞样品的相对log2cpm(log2countspermillion)。灰线表示相对log2cpm的平均值，箱由下至上从第一四分位值延伸至第三四分位值，须表示1.5倍四分位距。

实施例2高内涵筛选(highcontentscreening,hcs)(混合靶点、单靶点)敲除后增加紫杉醇化疗敏感性基因

根据hcsmix的结果，挑选7个阳性基因的42个sgrna靶点(每个基因6个靶点)，抽提质粒，分别包装成慢病毒，感染细胞，进入hcs单靶点筛选实验，4ng/ml紫杉醇作用组与对照组(未加紫杉醇)比较，各组通过celigo细胞计数分析增殖结果如下(见表1)。

表1.高内涵筛选(单靶点)紫杉醇增敏相关基因

注：带有后缀“-4ng”表示加入4ng/ml紫杉醇药物，不带后缀表示为不加紫杉醇的对照组。

本轮高内涵筛选结果显示：nc组(siha)细胞增殖正常，第五天相比第一天的增殖倍数达到7.93倍，加紫杉醇后nc组细胞的增殖受到抑制。在筛选的42个靶点中，选择在4ng/ml紫杉醇作用下增敏倍数大于1.5的sgrna靶点为后续待验证的阳性靶点，其中kcp单靶点(05003-1)增敏倍数最高，进入后续细胞功能实验，其中kcp05003-1靶点sgrna序列为seqidno:5，扩增子序列为seqidno:6。

实施例3kcp基因对紫杉醇诱导宫颈癌细胞功能研究(针对上述kcp单靶点(05003-1))

正常目的细胞，以及加sgrna阴性对照病毒感染和加kcp基因sgrna病毒感染的细胞，进行紫杉醇药物处理细胞(用“+”表示加入紫杉醇药物)。加紫杉醇药物1-5天，mtt检测结果表明：相比sgctrl+/sgctrl组，sgkcp+/sgkcp组细胞对紫杉醇更敏感，增殖抑制明显(p<0.05)(见图2-1)，细胞克隆能力明显减弱(p<0.05)(见图2-2),但细胞凋亡率无明显差异(p>0.05)(见图2-3)。

上述说明示出并描述了本发明的一种实例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附加权利要求的保护范围内。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110>首都医科大学附属北京妇产医院

<120>kcp基因在宫颈癌紫杉醇敏感性检测中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2048

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

gagccgcgacgacagacggcgagccgagcgaggcggagctagcatggccggggtcggggc60

cgctgcgctgtcccttctcctgcacctcggggccctggcgctggccgcgggcgcggaagg120

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<210>2

<211>2048

<212>dna/rna

<213>homosapiens

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<210>3

<211>2048

<212>dna/rna

<213>homosapiens

<400>3