一种高效的冬虫夏草子囊孢子分离方法与流程

本发明涉及冬虫夏草菌纯培养领域，具体提供一种一种冬虫夏草子囊孢子分离方法，该方法简便、高效、成本低、成功率高，可应用于冬虫夏草子囊孢子的大批量分离，且所获冬虫夏草菌均为单一子囊孢子发育而来的纯种，无需二次纯化。

背景技术：

冬虫夏草（cordycepssinensis）是分布于青藏高原及其周边地区的名贵野生中药材，因其具有极高的药用价值而享誉全世界。其本质是冬虫夏草菌（ophiocordycepssinensis）侵染高寒草甸中的蝙蝠蛾幼虫发育形成的菌虫复合体。冬虫夏草菌具有重要的研究与应用价值。利用冬虫夏草菌发酵菌粉开发的百令胶囊早已成功上市，并应用于各种疾病治疗，显现出了巨大的经济效益与社会效益。

冬虫夏草菌的分离通常有两种方法。一种是通过组织分离获取冬虫夏草菌，该方法较为简单也较为常见，只要表面消毒处理的当，有很高的概率能够获得冬虫夏草菌，应用较为广泛，但是该方法有一个缺点，无法保证获得的冬虫夏草菌是绝对纯种。还有一种获取冬虫夏草的方法是通过子囊孢子分离获得，该方法的缺点是，子囊孢子弹射时期暴露在外界坏境中，子囊孢子脆弱，无法对其进行表面消毒处理，冬虫夏草菌生长速度极慢，很容易被污染，借助相关高级仪器进行显微操作分离虽然能够成功，但非常耗时耗力，不适合大批量的分离操作。但该方法的优点是，一旦成功即可获得单一子囊孢子发育而来的纯种冬虫夏草菌。

因此简单高效实用性强的冬虫夏草子囊孢子分离方法在冬虫夏草菌的分离与应用研究中意义重大。

技术实现要素：

鉴于目前冬虫夏草子囊孢子分离中的弊端，本发明提供一种简单高效的冬虫夏草子囊孢子分离方法，可以大批量地应用于冬虫夏草的子囊孢子分离工作，以获取单一子囊孢子发育而来的纯种冬虫夏草菌。

本发明以新鲜冬虫夏草弹射的子囊孢子为实验材料，进行单一萌发子囊孢子分离，以获取纯种冬虫夏草菌，其特征在于包括步骤：

1）收集子囊孢子：将灭菌玻璃纸袋套于子囊孢子弹射时期的子实体上收集子囊孢子。

2）萌发培养：将子囊孢子用无菌水稀释后，涂布于萌发培养基，进行萌发培养。

3）分离培养：显微镜下观察孢子萌发情况，自制打孔环打孔转移萌发单孢子至分离培养基进行分离培养。

4）筛选目标菌株：观察分离培养基上菌落生长状况，筛选符合典型形态特征的冬虫夏草菌。

本方法是以萌发的子囊孢子为分离对象，整个操作过程中没有对孢子进行直接接触，没有涉及显微操作，只借助了一台普通光学显微镜以及自制的环形取样器。所以本方法具有简便、高效、成功率高、成本低、实用性强的特点，可以应用于大批量的子囊孢子分离工作。

下面为便于理解，结合具体实施例描述本发明。

附图说明

图1为该方法的主要操作过程。

图2为该方法所得的单一子囊孢子发育而来的冬虫夏草菌在分离培养基上的生长状况。

图3为该方法所得纯种冬虫夏草菌tdb5-2-3在营养生长培养基上的形态特征以及菌丝的显微特征。

图4为依据该方法所得的纯种冬虫夏草菌tdb5-2-3的its序列构建的系统发育树，从分子生物学方面确证所得菌株为冬虫夏草菌。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明均可从商业途径获得。

下述实施例中的培养基：

每1l固体萌发培养基由如下物质制成：10g琼脂、和水1000ml。

每1l固体分离培养基由如下物质制成：200g土豆、20g葡萄糖、10g蛋白胨、1g酵母粉、15g琼脂和水。其中用水将培养基定容至1000ml。

每1l固体营养培养基由如下物质制成：200g土豆、200ml生牛奶、20g葡萄糖、5g水解乳蛋白、1g酵母粉、1g磷酸二氢钾、0.2g七水合硫酸镁、1片复合维生素b、琼脂15g和水。其中用水将培养基定容至1000ml。

上述培养基的ph自然即可

上述固体萌发培养基的配制方法如下：称量10g琼脂于三角瓶中，加入蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min后,倒入90mm无菌培养皿中备用。

上述固体分离培养基的配制方法如下：将切成见方1cm去皮土豆块煮沸30min,用纱布过滤，在滤液中逐一加入其他固体试剂溶解，用蒸馏水将培养基定容至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min后倒入35mm无菌培养皿备用。

上述固体营养培养基的配制方法如下：将切成见方1cm去皮土豆块煮沸30min,用纱布过滤，在滤液中逐一加入其他固体试剂溶解，将生牛奶煮沸10min用纱布过滤后加入培养基中，用蒸馏水将培养基定容至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min后倒入70mm无菌培养皿备用。

下述实施例中所用到的主要相关仪器和试剂有：超净工作台、普通光学显微镜、恒温生化培养箱、核酸电泳系统、血球计数板、自制环形取样器、omega真菌基因组抽提试剂盒等。

实施例1、冬虫夏草子囊孢子的萌发培养。

本发明所用的冬虫夏草为甘肃天祝地区子囊孢子弹射时期的新鲜冬虫夏草。其主要步骤为：1、将灭菌玻璃纸袋罩于子囊孢子弹射时期的冬虫夏草子实体上收集子囊孢子（图1a）。2、将收集到的子囊孢子先用少量无菌水稀释，血球计数板计算子囊孢子密度后，将子囊孢子悬液精确稀释至45个/ml。3、移液枪定量吸取1ml子囊孢子稀释液于90mm萌发培养基平板，中涂布棒涂布均匀后转入15℃恒温培养箱中进行萌发培养，期间不断用显微镜观察子囊孢子萌发情况。

实施例2、冬虫夏草子囊孢子的分离培养

萌发培养3-5天后，子囊孢子便开始萌发，可以进入分离培养的环节。其主要步骤为1、将90mm萌发培养基平板转入超净工作台中，并用普通光学显微镜观察子囊孢子萌发情况。2、找到单个子囊孢子后，用高倍镜反复确认，以确保视野中的子囊孢子为萌发单孢子（图1d）。3、关闭超净工作台的日光灯以及所有周围环境光源，以营造一个暗环境。4、用自制的环形取样器（图1b）对准暗环境下显微镜光路在萌发培养基表面所形成的明亮圆形光斑（图1c）打孔取样。4、将含有萌发单孢子的取样块一皿一个的形式接种至35mm分离培养基平板中，统一用封口膜封口后转入15℃恒温培养箱进行避光分离培养，并定期观察分离培养状况。

实施例3、冬虫夏草菌的营养生长培养

分离培养约30天时，培养皿中单个萌发子囊孢子发育而来的冬虫夏草菌开始产生肉眼可见生长迹象（图2a），60天时菌落形态明显（图2b），菌落直径约有1cm左右，90天时菌落直径进一步增大，色素明显（图2c）,此时便已成功获得了单一子囊孢子发育而来的冬虫夏草菌，如需进一步研究与鉴定可先进行营养生长这一环节，其主要步骤为：1、将通过分离培养所得到的冬虫夏草军，用5mm打孔器打孔取样，并接种于70mm营养培养基平板上。2、封口膜封口后，统一转入18摄氏度恒温培养箱进行避光营养生长培养，并定期观察冬虫夏草菌营养生长状况，如有必要，拍照记录。

实施例4、所得冬虫夏草菌的生物学特性

选取营养生长培养基上的一株编号为tdb5-2-3的单一子囊孢子发育而来的冬虫夏草菌株进行生物学特征研究，以确保所获菌株为冬虫夏草的正确无性型。

1、形态学特性：该冬虫夏草菌株在营养生长培养基上菌落质地坚韧，初期气生菌丝不发达或无气生菌丝，培养60天时菌落直径可达3cm左右，整个菌落会从中间部位隆起并蔓延至边缘部分，形成很多褶皱沟壑，隆起高度约1cm菌落颜色整体呈现灰白色，有少量褐色色素分泌至培养基中（图3a）；菌落培养90天以上时，气生菌丝开始增多并附生于整个菌落表面（图3b）；显微镜下观察菌丝无色透明，有间隔，菌丝较长有分支，部分菌丝末端会变窄变细并长出肾形分生孢子，分生孢子无隔，分生孢子整体较少（图3c）。

2、分子生物学特性：用omega试剂盒中第三种方法对冬虫夏草菌株tdb5-2-3的总dna进行提取，以its4/its5通用引物扩增核糖体内转录间隔区（its）序列并测序，测序结果提交至ncbi进行序列比对，获取种属信息，将测序结果提交至genebank获取登录号为：mk564659，选取其中几个相似度高的序列（>99%）构建系统发育树分析如图4所示，its鉴定结果显示单一子囊孢子发育而来的冬虫夏草菌株为冬虫夏草菌（ophiocordycepssinensis）。