本发明属于家禽分子标记选择育种方法，特别是番鸭的产蛋性状相关联基因smad3分子标记筛选方法及应用。
背景技术：
番鸭作为国内优良的肉用鸭种之一，因其具有体型大，易饲养，瘦肉率高，有特殊野禽风味，产肥肝性能好，以及耐粗饲，抗病力强，饲料转换效率高和等优点，深受广大养户和消费者的青睐，具有广阔的市场饲养前景，但相较于家鸭，母番鸭育成时间长（24~26周），导致饲养成本增加，年产蛋量较少（80~120枚），且母番鸭有很强的就巢性，而就巢性强会使其卵巢退化而导致停产，造成番鸭的繁殖性能较低。因此，番鸭的繁殖性能一直是制约其规模化、集约化生产与发展的关键因素之一。而产蛋性状作为复杂的数量性状，不仅受微效多基因调控，而且与多种环境因素的有关。而常规的育种手段很难对产蛋性能做出精确选育，而分子育种标记可精确快速的辅助选种选育。研究表明，smad3基因与禽类的繁殖性能具有一定的相关性。
单核苷酸多态性（snp）指同一位点的不同等位基因之间仅存在个别核苷酸的差异，该分子标记能从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，目前是最准确、最有效的分子标记技术。因此，运用snp分子标记技术来找寻与番鸭繁殖性状相关候选基因相关分子标记，为番鸭繁殖性状的选种选育提供分子依据，具有重要的现实意义。因此，找到smad3基因的某个snp突变位点的某种基因型后，若分析其与番鸭产蛋性状具有相关性，则该位点作为一种分子标记并应用于番鸭繁殖性能选育的分子标记辅助选择（mas）是一项潜在且可行的选种、育种途径。近年来，关于snp分子标记并应用于家禽选种、育种的研究报道屡见不鲜，但关于番鸭产蛋性状的分子标记挖掘与应用报道较少，而smad3基因的分子标记的挖掘并应用于番鸭产蛋性状还是一个新的领域。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种番鸭繁殖性能关联基因smad3分子标记的筛选方法及其应用，以获得一种新的番鸭选种、育种途径。
本发明通过以下方法实现：
本发明的一种番鸭产蛋性能关联基因smad3分子标记筛选方法，包括如下步骤：
（1）dna提取：采用酚氯法提取产蛋期母番鸭基因组dna，然后测定基因组dna纯度的od值和浓度；
（2）引物设计：运用ncbi在线软件以及primer5.0进行smad3基因扩增引物设计，引物序列送相关生物公司合成；
（3）pcr扩增：采用15μl扩增体系，设置温度梯度pcr摸索扩增条件，确定最佳扩增条件后进行pcr扩增，扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测；
（4）目的片段回收纯化、送相关生物公司测序；
（5）通过测序结果进行snp突变位点筛查，筛选出来的snps直接测序分型，并与产蛋性能进行关联分析，最终确定与番鸭的产蛋性状相关联的snp；
在分子标记辅助育种过程中，通过上述方法检测到的与产蛋性状关联基因smad3的突变基因型即可作为分子标记。
其中，步骤（1）中测定od值和浓度时要求od260/od280比值介于1.8~2.0之间，od值高于或低于该范围的dna均存在污染，需重新提取。
步骤（3）中pcr反应扩增体系15μl包括：2×taqpcrmastermix试剂（北京天根）6.5μl，上游引物、下游引物各1μl，模板dna1μl，ddh2o5.5μl。
步骤（3）中pcr扩增程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55.7~64.3℃退火30秒；72℃延伸35-60秒；33~35个循环数；72℃终延伸5分钟，4℃反应终止；1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。
本发明的有益效果：同其他家禽一样，番鸭的产蛋性状除了受环境因子（季节、光照、营养、温度等）的影响，自身遗传因素对产蛋性状高低起着决定性的作用，而snp分子标记技术能准确、有效、迅速的提高番鸭的产蛋性状，因此，有必要对与番鸭繁殖性能关联基因smad3的相关基因型进行选择，选择p值小于0.01的优势基因型母番鸭群体进行留种，其群体平均产蛋量提高且均衡，反之则出现群体产蛋量低且不均衡的概率就大，种群即不符合选种、留种要求。应用上述方法寻找与番鸭产蛋性状相关联的分子标记（基因型）并应用与番鸭繁殖性能分子标记辅助选择（mas），可以从基因水平上准确而有效的提高番鸭的繁殖能力。本发明可以为snp分子标记方法应用于番鸭繁殖性状的选种、育种提供分子参考依据。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步的详细应用说明，实施案例中有样本关数量、百分比、数量比例等，若无特殊说明，均指质量单位。
实施例：
番鸭产蛋性能关联基因smad3分子标记及应用，包含以下步骤：
1.基因组dna提取
采用酚氯法对需检测的产蛋期番鸭的90份血样进行基因组dna提取，提取的dna采用2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并利用紫外分光光度计测量其od值和样品浓度，置于-20℃冰箱保存。将90份基因组dna的浓度稀释为一致（约为100ng/μl），各吸取5μl均匀混合构建番鸭品种混合基因组dna池。
2.扩增引物设计
参照ncbi数据库中genbank所公布的绿头鸭smad3基因序列（登录号：nw_004679151），利用dnastar软件对序列进行分析，利用primer5.0引物设计软件以及ncbi在线引物设计对npy、smad3基因进行扩增引物设计。引物送上海生工生物技术有限公司合成。引物序列与预扩增产物详见下表1：
3.pcr扩增
利用梯度pcr扩增仪设置温度梯度扩增试验，获得smad3基因pcr扩增引物的的最适tm值。pcr扩增体系为15μl:2×taqpcrmastermix6.5µl，forwardprimer1µl、reverseprimer1µl，模板dna1µl，ddh2o5.5µl；反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；退火（详见上表1）30s；72℃延伸35-60s；33-35个循环；72℃终延伸5min；4℃反应终止。pcr产物采用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测合格后，送相关生物技术有限公司测序。
4.基因snp位点筛查
运用dnastar软件的seqman以及bioedit软件对smad3基因外显子区多态位点测序结果进行筛查。获得smad3基因外显子snp突变位点。
5.snp位点直接测序分型
snp位点直接测序分型是最有效、准确、省时的方法，筛查获得的snp位点通过直接测序进行分型，以获得突变位点存在的相应基因型。
5.snp位点与番鸭产蛋性能的关联分析
运用dnastar软件的seqman以及bioedit软件对smad3基因的测序结果进行比对，对多态位点各基因型进行统计分析。应用最小二乘分析法分析与番鸭产蛋性能的关联，根据关联分析结果，找出与番鸭产蛋性能显著关联的优势基因型。
本发明的应用：
在分子标记应用于番鸭选种、育种过程中，用上述方法检测到的与番鸭产蛋性能关联基因smad3的突变基因型即作为分子标记，其判断标准为：基因型与番鸭产蛋性能之间存在极显著的相关性（p<0.01）。
显然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
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<110>贵州大学
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