一种用于筛查急性高原反应易感者唾液中的microRNA分子标志物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物技术及其应用领域，本发明涉及一种用于筛查急性高原反应易感者唾液中的microrna分子标志物，更涉及其应用和试剂盒。通过唾液中hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p表达水平筛查急性高原反应发病风险，从而用于评定人体对急性高原反应的易感性，减少人因急性高原反应发病风险。
背景技术：
：急性高原反应(acutemountainsickness,ams)，是发生在长期生活于低海拔地区的平原人，在未适应新环境的情况下快速进入高原后1-3天产生，包括头痛、头晕、疲劳、失眠、情绪不安、胃肠胀气、腹泻及呕吐等一系列症状，其中剧烈的头疼是ams的典型症状。地理学上把海拔高于500m，地势相对平坦或者有一定起伏的广阔地区叫高原，医学上将海拔高于2500-3000m的地方叫高原。ams发病率较高，根据上升速度和具体海拔的不同，发病率可高达50％至85％(bartschp.andswensone.r.，clinicalpractice:acutehigh-altitudeillnesses.《thenewenglandjournalofmedicine》,2013,368(24)，2294-302.)。其危害性大，不仅会严重影响急进高原平原人的工作和生活能力，更严重的是，如果ams没有得到有效的控制与治疗，很可能发展成为具有高致死率的高原脑水肿(boosc.j.etal.,highaltitudeandacutemountainsicknessandchangesincirculatingendothelin-1,interleukin-6,andinterleukin-17a.《highaltitudemedicine&biology》,2016,17(1),25-31.)。ams有明显的遗传倾向性及个体易感性，高原低压低氧的环境因素和遗传因素均可以影响ams的发生。多年以来，ams的遗传倾向性及个体易感性一直是国内外学者关注的热点尽管有人已经提出使用低氧相关基因egln1、hif-1an、nos3等snp位点对ams易感人群进行预测，但是目前看来这些标记物在准确性和特异性等方面都不尽如人意(luksa.m.,swensone.r.,bartschp.，acutehigh-altitudesickness.《europeanrespiratoryreview:anofficialjournaloftheeuropeanrespiratorysociety》,2017,26(143))。而我国高原面积辽阔(约占国土面积的1/5)，且海拔较高(青藏高原平均海拔在4000米以上)。近年以来，随着国内外高原旅游业及高原经济建设的蓬勃发展，越来越多的平原人进入高原，而ams的高发不仅给他们的生活和工作造成十分严重的影响，而且亦给高原地区的较脆弱卫生机构造成沉重的负担。所以亟待寻找到在平原对ams的发病易感性进行预测的有效方法。microrna是一类广泛存在于真核生物中，长度为18～24个核苷酸的非编码rna分子。microrna通过转录后水平抑制靶基因的表达，参与调控细胞分化、增殖、凋亡等生命活动，在胚胎发育、机体代谢、疾病发生发展等多种生理和病理过程中发挥重要作用。近年来，研究人员在血液、唾液、尿液等多种体液中检测到microrna，提出循环microrna的概念。并且，microrna的表达水平的高低和其遗传基因的差异性高度相关。值得重视的是，近年来，大量的研究表明，循环microrna对肿瘤、高血压、卒中及一系列疾病的提前诊断和发病预测都有很好的特异性和敏感性。再者唾液等体液标本易于获得，临床可操作性强且创伤性小，而且循环microrna稳定性好，检测便利，因此，循环microrna具有作为ams无创性生物标志物的潜能，适用于ams易感性人群筛查(toffolok.,wangj.etal.,circulatingmicrornasasbiomarkersintraumaticbraininjury.《neuropharmacology》,2018.)。而目前关于循环microrna与ams易感性之间的相关性，鲜见报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于筛查急性高原反应易感者唾液中的microrna分子标志物，通过受检者唾液中hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p表达水平筛查急性高原反应发病风险，从而用于评定人体对急性高原反应的易感性。还提供这种microrna分子标志物的应用和试剂盒。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：1.一种用于筛查急性高原反应易感者唾液中的microrna分子标志物，所述microrna分子标志物为hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p。进一步，所述hsa-mir-134-3p的序列如seqidno：1所示，所述hsa-mir-15b-5p的序列如seqidno：2所示。进一步，所述的核酸分子在唾液中的表达与对照唾液中的表达相比被下调。进一步，所述唾液为唾液上清。进一步，所述唾液上清为将唾液在3000×g，4℃下离心15-20分钟后，用无rna酶和无细菌的吸头取上清置于无rna酶和无细菌的ep管中；再12000×g，4℃下次离心10-20分钟，于无菌无酶的ep管中-80℃保存备用。2.提供一种microrna分子标志物在制备筛查急性高原反应易感者的试剂或试剂盒中应用，所述microrna分子标志物为hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p。3.提供一种筛查急性高原反应易感者的试剂盒，所述试剂盒能检测hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5两种microrna，所述试剂盒包含能够分别与hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p反转录产物特异性结合并进行pcr扩增的引物。进一步，hsa-mir-134-3p正向引物序列为seqidno.5，hsa-mir-134-3p反向引物序列为seqidno.7。进一步，hsa-mir-15b-5p正向引物序列为seqidno.6，hsa-mir-15b-5p反向引物序列为seqidno.8。进一步，所述试剂盒还包括mirnart反应体系，所述mirnart反应体系按每10ul计，包括：逆转录引物1ul，5xreversetranscriptionbuffer2ul，rtasemix2ul，rnase-freeh2o3ul，其余2ul为测试rna。进一步，hsa-mir-134-3p逆转录引物如seqidno.3所示。进一步，hsa-mir-15b-5p逆转录引物如seqidno.4所示。进一步，所述测试rna来源于唾液。进一步，所述测试rna来源于唾液上清。进一步，所述试剂盒rt反应温度参数：42℃60min，70℃10min。进一步，所述试剂盒还包括mirnaqpcr反应体系，所述mirnaqpcr反应体系按每20ul计包括：sybrgreenmix10ul，mirnaforwardprimer0.8ul，mirnareverseprimer0.8ul，ddh2o6.4ul，其余为rt反应产物2ul。进一步，所述试剂盒mirnaqpcr反应条件为预变性95℃10min，变性95℃2s，退火60℃20s，延伸70℃10s。本发明的有益效果在于：本发明通过平原世居者平原血浆中循环microrna的芯片谱筛查，待人群进入高原后，根据ams国际通用诊断标准路易斯湖评分诊断系统区分ams和健康人群，结合其高原缺氧暴露后的ams发病情况，进一步发现唾液中循环hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p中的一种或两种在ams易感者和健康人之间存在着显著差异。再通过sybr(即sybrgreen染料，缩写sybr)实时荧光定量pcr(聚合酶链反应)的方法检测了另一独立人群的平原唾液中循环各microrna表达水平，证实了平原唾液循环hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p表达水平和ams的易感性之间存在着相关性。本发明所提出的microrna标志物通过唾液即可检测得到，样本得取方便，减少受测者被扎针抽血的痛苦和风险，总而言之唾液标本采集具有无创、安全、便捷等优势。本发明所验证的唾液标本例数量大，可靠性强，能充分证明本发明所指出的microrna对于ams的预防和治疗有可靠的效果。本发明将在ams的易感者唾液内异常表达低水平明显且较恒定的mirna确定为初步研究对象，找出了唾液标本中与ams的易感者密切相关mirna，筛选出的mirna对ams有很好的筛查效能，能够在平原筛查到达高原后高原反应的发病风险，指导ams的预防和治疗，减轻减少高原反应对人的健康和生命威胁。为microrna作为潜在的急性高原反应诊断生物标志物现有的实验室证据进行了新的有效可靠的补充，并且为从新的体液检测提供可靠依据。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为ams易感者和健康对照的唾液上清中hsa-mir-134-3p表达水平比较；图2为ams易感者唾液上清中hsa-mir-134-3p的工作特征曲线；图3为ams易感者和健康对照的唾液上清中hsa-mir-15b-5p表达水平比较；图4为ams易感者唾液上清中hsa-mir-15b-5p的工作特征曲线；图5为ams易感者唾液上清中hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p联合的工作特征曲线；图6为ams易感者和健康对照的全唾液中hsa-mir-134-3p表达水平比较；图7为ams易感者全唾液hsa-mir-134-3p的工作特征曲线；图8为ams易感者和健康对照的全唾液中hsa-mir-15b-5p表达水平比较；图9为ams易感者全唾液中hsa-mir-15b-5p的工作特征曲线。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。首先通过对20例ams患者和15例健康对照的血浆microrna表达谱进行对比分析，后对75例ams患者和49例健康对照的唾液各microrna表达水平进行检测再比较，研究各microrna与ams的相关性，寻找出了敏感可信的ams易感生物遗传标记。步骤是使用50ml离心管采集上述人员拟从平原快速进入高原人群的唾液5ml，3000×g，4摄氏度下离心15-20分钟之后，用无rna酶和无细菌的吸头取上清置于无rna酶和无细菌的ep管中。之后，再12000×g，4摄氏度下再次离心10-20分钟，用无菌无酶的吸头取上清，置于无菌无酶的ep管中-80℃保存备用。通过microrna表达谱芯片(mircurytmlnaarray(v.18.0))对血浆中microrna表达水平进行检测，待人群进入高原后，根据ams国际通用诊断标准路易斯湖评分诊断系统区分ams和健康人群(maggiorinim.etal.,assessmentofacutemountainsicknessbydifferentscoreprotocolsintheswissalps.aviatspaceenvironmed，1998,69(12),1186-92.)，比较ams和健康人群microrna表达谱，筛选ams易感性相关大量的microrna，发现唾液上清中包含hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p在内的一些microrna在ams易感者和健康人群中表达存在显著差异。使用qpcr技术在另一独立人群中对包含hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p在内的一些microrna在ams易感者(75例)和健康对照组(49例)中的表达分布进行检测。整个过程中唾液样本rna提取采用德国凯杰技术有限公司的microrna柱式抽提试剂盒(mirneasyserum/plasmakit，货号：217184)提取，然后采用实时荧光定量pcr(bulge-looptmmirnaqrt-pcrstarterkit，货号：r10039.2)的方法进行对各microrna和外参cel-mir-39进行扩增；再分别计算每例标本的各microrna对外参cel-mir-39的归一化表达水平，结果经过spss19.0进行检验，以p＜0.05为显著性检验标准，发现ams易感者组(75例)和健康人群(49例)的唾液hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p的表达水平存在着显著差异。本发明所要解决的技术问题是，找到一种或几种平原唾液microrna标志物可以筛选出ams易感者和健康人。通过检测人平原唾液中的相关microrna标志物的含量，通过表达量高低来区分ams易感者和健康人，进而筛查进入高原后ams的发病风险，避免疾病的发生而导致更多风险。本发明解决上述问题的技术方案是：检测平原人唾液中hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p一种或两种的含量，以区分ams易感者和健康人。本发明还包括，唾液microrna(hsa-mir-134-3p和hsa-mir-15b-5p一种或两种)在制备筛查ams发病风险的试剂盒中的应用。实施例1唾液标本microrna的表达与ams发病风险的相关性研究一、材料与标本收集描述ams易感者唾液标本收集自急进高原人群中的ams患者进入高原前，合计75例。正常人群的唾液标本收集自急进高原人群中的正常健康人群进入高原前，合计49例。ams的诊断是通过国际通用诊断标准-路易斯湖评分来确认的。所有人群在取唾液之前没有服用任何预防性药物。每个样本用无菌无酶的50ml离心管合计收集10ml唾液。患者临床病例特征如表1所示。本研究已通过陆军军医大学(第三军医大学)医学伦理委员会的审核批准，所有标本的采集均获得患者的知情同意。表1唾液标本的临床资料二、样品处理和rna提取在唾液采集前2h，禁食、禁水、禁漱口。采用50ml离心管，收集唾液5ml，在3000×g，4摄氏度下离心15分钟之后，用无rna酶和无细菌的吸头取上清置于无rna酶和无细菌的ep管中。之后，再12000×g，4摄氏度下再次离心10分钟，用无菌无酶的吸头取上清，置于无菌无酶的ep管中-80℃保存备用，为唾液上清。全唾液即为未经过任何离心处理的唾液。所有样本中的rna通过德国凯杰技术有限公司的microrna柱式抽提试剂盒(mirneasyserum/plasmakit，货号：217184)按照说明书操作步骤进行提取和纯化。1.唾液microrna的浓度较低，25-40ng/ul左右；2.a260/280都在1.4-1.6；3.cdna合成采用microrna荧光定量pcr逆转录试剂盒(bulge-looptmmirnaqrt-pcrstarterkit，货号：r10039.2)：10ul逆转录反应体系：rna原液2ul，逆转录引物1ul(5um)，5xreversetranscriptionbuffer2ul，rtasemix2ul，nase-freeh2o3ul；逆转录引物序列如表1所示；4.rt反应温度参数：42℃60min，70℃10min。表1逆转录引物序列三、实时荧光定量pcr(sybr染料法)运用中国广州锐博生物科技有限公司的microrna实时荧光定量pcr试剂盒(bulge-looptmmirnaqrt-pcrstarterkit，货号：r10039.2)分别对hsa-mir-1183、hsa-mir-3654、hsa-mir-134-3p、hsa-mir-15b-5p、hsa-mir-23b-5p(目标microrna)和外参cel-mir-39进行扩增；分别得到ct值(cyclethreshold)，通过公式：表达量＝2ct(cel-mir-39)-ct(目标microrna)，在分别计算每例标本的microrna的表达水平，具体操作过程见其试剂盒说明书。每个样本重复三次实验。hsa-mir-134-3p、hsa-mir-15b-5p基本信息如表2所示。1.扩增反应体系：(20ul体系)：rt反应产物2ul，sybrgreenmix10ul，mirnaforwardprimer(5um)0.8ul，mirnareverseprimer(5um)0.8ul，ddh2o6.4ul；引物序列如表3所示。2.反应条件：预变性95℃10min，变性95℃2s，退火60℃20s，延伸70℃10s；3.待检测mirna及外参cel-mir-39的realtimepcr扩增曲线均呈“s”型；4.pcr产物熔解曲线均为单峰，说明扩增的目的基因特异性好且结果可靠。表2microrna基本信息idsequenceaccessionnumberseqidnohsa-mir-134-3pccugugggccaccuagucaccaamimat0026481seqidno.1hsa-mir-15b-5puagcagcacaucaugguuuacamimat0000417seqidno.2表3引物序列四、统计分析方法运用统计学软件spss19.0进行统计。正态性检验采用shapiro-wilk法，显著性差异用mann-whitney检验(mann-whitneytest)，工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，简称roc曲线)及线下面积(areaunderthecurve，auc)用于评价各microrna(hsa-mir-134-3p、hsa-mir-15b-5p)的筛查效能。当p＜0.05时认为有统计学差异。其中auc反映了预测效能(auc＝0.5,没有预测效能；0.5＜auc＜0.7很小的预测价值；0.7＜auc＜0.9相当准确的预测价值；0.9＜auc＜1，很准确的预测价值)。五、结果分析1.图1为ams易感者和健康对照的唾液上清中hsa-mir-134-3p表达水平比较；如图1所示，ams易感者与健康对照间，唾液上清中hsa-mir-134-3p的表达量相比，p＜0.001，有极显著统计学差异。其中ams是ams易感者、healthy为健康对照。当p＜0.05，即有显著统计学差异，p＜0.01，即有极显著统计学差异，p＜0.001，即有极显著统计学差异。2.图2为ams易感者唾液上清中hsa-mir-134-3p的工作特征曲线。如图2所示，唾液上清中hsa-mir-134-3p对ams易感者与健康对照间的筛查效能通过roc曲线可以知道，唾液中hsa-mir-134-3p对ams易感者与健康对照间的筛查效能是很好的，其中auc为0.767(95％ci,0.683-0.838)。该图中的很好的显示了ams易感者的roc曲线、曲线下面积(areaunderthecurve，auc)、灵敏性(sensitivity)、特异性(specificity)，其中auc反映了筛查效能。一般认为试验的auc最大，则其诊断价值越佳。充分说明血浆中hsa-mir-1183单独作为筛查ams易感者的生物标志物均有一定的准确性和可行性。表4为健康人和ams易感者唾液和唾液上清中各microrna(hsa-mir-134-3p、hsa-mir-15b-5p)工作特征曲线数据。表5为唾液和唾液上清中各microrna表达水平与ams疾病临床严重程度相关性。表4工作特征曲线数据表5唾液microrna表达水平与ams疾病临床严重程度相关性(n＝124).其中lls：路易斯湖评分；s-mir-134-3p：唾液上清中mir-134-3p(mir-134-3pinsalivasupernatant)；s-mir-15b-5p：唾液上清中mir-15b-5p(mir-15b-5pinsalivasupernatant)；w-mir-134-3p：全唾液中mir-134-3p(mir-134-3pinsalivasupernatant)；w-mir-15b-5p：全唾液中mir-15b-5p(mir-15b-5pinsalivasupernatant)，附图同说明书中标识一致。由表2可知唾液上清microrna与ams严重程度(路易斯湖评分，lls)相关度更高，故更适用于唾液检测。这和全唾液中可能含有食物残渣、口腔脱落细胞、唾液蛋白等，故会对唾液中microrna的表达量存在干扰，从所有数据综合得出唾液上清中microrna更能反映人体情况，更适用于做唾液microrna检测标本，结果更准确。3.图3为ams易感者和健康对照的唾液上清中hsa-mir-15b-5p表达水平比较；如图3所示，ams易感者与健康对照间，血浆hsa-mir-15b-5p的表达量相比，p＜0.001，有极显著统计学差异。4.图4为ams易感者唾液上清中hsa-mir-15b-5p的工作特征曲线。如图4所示，血浆hsa-mir-15b-5p对ams易感者与健康对照间的筛查效能通过roc曲线可以知道，hsa-mir-3654对ams易感者与健康对照间的筛查效能是很好的，其中auc为0.703(95％ci,0.614-0.782)。5.图5为唾液上清中hsa-mir-134-3p、hsa-mir-15b-5p联合工作特征曲线。两个microrna分子单独对ams易感者与健康对照间的筛查效能是较好的，auc分别为：0.767(95％ci,0.683-0.838)、0.703(95％ci,0.614-0.782)。由图5的两个microrna联合对ams易感者与健康对照间的筛查效能roc曲线可以知道，联合运用两个唾液中microrna对ams易感者与健康对照间的筛查效能是更好的，优于其单独运用，auc为0.811(95％ci,0.731-0.876)。6.图6为ams易感者和健康对照的全唾液中hsa-mir-134-3p表达水平比较；如图6所示，ams易感者与健康对照间，全唾液中hsa-mir-134-3p的表达量相比，p＜0.001，有极显著统计学差异。7.图7为ams易感者全唾液中hsa-mir-134-3p的工作特征曲线。如图7所示，全唾液中hsa-mir-134-3p对ams易感者与健康对照间的筛查效能通过roc曲线可以知道，唾液中hsa-mir-134-3p对ams易感者与健康对照间的筛查效能是很好的，其中auc为0.747(95％ci,0.662-0.821)。8.图8为ams易感者和健康对照的全唾液中hsa-mir-15b-5p表达水平比较；如图8所示，ams易感者与健康对照间，全唾液中mir-15b-5p的表达量相比，p＝0.042，具有显著统计学差异。9.图9为ams易感者全唾液中hsa-mir-15b-5p的工作特征曲线。如图9所示，全唾液中hsa-mir-134-3p对ams易感者与健康对照间的筛查效能通过roc曲线可以知道，唾液中hsa-mir-134-3p对ams易感者与健康对照间的筛查效能是很好的，其中auc为0.601(95％ci,0.51-0.688)。发明人首先通过对20例ams患者和15例健康对照的唾液中microrna表达谱进行对比分析，筛选与ams易感性相关microrna，进一步通过大量创造性劳动对75例ams易感者血浆标本和49例正常人群的唾液标本中的各microrna表达量进行分析，发现唾液中，尤其是唾液上清中hsa-mir-134-3p、hsa-mir-15b-5p对ams易感者与健康对照间有很好的筛查效能，而联合测定hsa-mir-134-3p、hsa-mir-15b-5p两个microrna更加准确筛查ams的发病风险。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国人民解放军陆军军医大学<120>一种用于筛查急性高原反应易感者唾液中的microrna分子标志物及其应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ccugugggccaccuagucaccaa23<210>2<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2uagcagcacaucaugguuuaca22<210>3<211>55<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacttggtga55<210>4<211>55<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgactgtaaac55<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cctgtgggccacctagtc18<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tagcagcacatcatggt17<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cagtgcgtgtcgtggagt18<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cagtgcgtgtcgtggagt18当前第1页12