一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法与流程

本发明属于基因组测序技术领域，更具体地，涉及一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法。

背景技术：

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。第二代测序技术平台的应用，包括罗氏公司454测序平台、abi公司的solid测序平台，以及illumina公司的solexa测序平台，他们对宏基因组的研究起到了重大影响。其中illumina公司的solexa和hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器。随着二代测序的应用越来越广泛，测序文库定量的问题随之突显：如果对于文库的定量不够准确，最终测序完毕产出的数据量也会相应的偏差。具体而言，如果核酸样本含量较低，一次测序文库所产出的数据量不够，无疑是对测序耗材以及时间人力的浪费；如果核酸样本含量过高，甚至导致产出过多导致质量很差以至于无法进行生物信息学分析，即爆机导致实验失败。

因此对于基因二代测序而言，用于基因组二代测序的核酸样品含量测定问题非常关键，决定了。目前采用的扩增产物的核酸含量测定方法是荧光定量法，目前的荧光定量法的结果准确性受到许多不可控的因素的影响，包括环境温度、人工移液精确度误差、模板浓度过低、随着pcr循环次数增多，会进入平台期，反应进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制条件一致等等。因此目前的荧光定量法的准确度无法满足二代测序扩增产物核酸含量测定的要求，经常造成数据产出量不足或者数据报废的问题。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其目的在于通过使用较为准确的标准曲线替代当次实验可能效果不好的标准曲线，由此解决现有的用于基因二代测序的核酸样品含量测定方法定量结果不准确的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，包括以下步骤：

(1)对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品，进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；

(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；

(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度。

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线体现初始浓度的对数和循环次数之间的线性关系；

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99；所述各标准曲线的制作标准一致。

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线按照如下方法制作：

(2-1)对于包括有效浓度范围内给定的浓度呈梯度的2个或2个以上的标准品，按照预设条件进行荧光定量链式聚合反应，获得给定荧光强度下各给定浓度标准品的循环次数；

(2-2)通过最小二乘法对步骤(2-1)中获得的循环次数及给定的对数值拟合标准曲线，并计算所述标准曲线的线性相关系数；

(2-3)当所述标准曲线现性相关系数大于或等于0.99时，且斜率处于-3.1至-3.6之间时，优选地，且当步骤(2-1)的标准品中包括相同浓度的标准品时，其循环次数差异不超过0.2时，将步骤(2-2)获得的标准曲线纳入标准曲线系列；否则弃用所述标准曲线。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其当步骤(1)采用5个或5个以上阶梯浓度给定浓度标准品时，可就所述多个阶梯浓度的标准品制作标准曲线，若所述标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99，则将所述标准曲线纳入所述标准曲线系列，并作为适用的标准曲线。

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述适用的标准曲线，同时满足以下条件：

条件1：在标准曲线所在的坐标平面内，体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及其循环次数的点与所述标准曲线之间的距离小于或等于体现步骤(1)中标准品给定浓度及其循环次数的点与所述标准曲线系列中其他任意标准曲线之间的距离；

条件2：用于制作所述标准曲线的体现标准品浓度对数值与循环次数的点中至少存在一个点，其与所述标准曲线之间的距离大于或等于体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及循环次数的点与所述标准曲线之间的距离。

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其当步骤(2)没有同时满足条件1和条件2的标准曲线时，则从步骤(1)开始重复；

当步骤(2)获得唯一同时满足条件1和条件2的标准曲线时，选择所述标准曲线作为适用的标准曲线；

当步骤(2)获得多条同时满足条件1和条件2的标准曲线时，选择其中一条作为适用的标准曲线。

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其重复步骤(1)时，采用多个给定浓度的标准品；优选地，重复步骤(1)中采用多个例如5个及以上给定浓度呈梯度的标准品。

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其当步骤(2)获得多条同时满足条件1和条件2的标准曲线时，选择与其相应的体现标准品浓度对数值与循环次数的点距离最近的标准曲线作为适用的标准曲线。

优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(1)在对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品进行荧光定量聚合酶链式反应时，同时同批次对至少一个定量参考品进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下定量参考品的循环次数；

还包括以下步骤：

(4)根据步骤(1)中获得的定量参考品的循环次数和步骤(2)中选择的标准曲线，标定定量参考品的浓度，根据定量参考品的浓度校正待测核酸样品的相对浓度。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明通过选择实验条件与当次实验较为一致的比较准确的标准曲线，能显著降低定量误差，提高定量准确性。同时优选方案能显著减少标准品用量，节省耗材，降低定量成本。

附图说明

图1是实施例1标准品和备选的标准曲线；

图2是实施例2中标准品和备选的标准曲线；

图3是实施例3中标准品和备选的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，包括以下步骤：

(1)对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品，按照标准曲线系列中标准曲线制作时的条件进行荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；

优选地，在对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品进行荧光定量聚合酶链式反应时，同时同批次对至少一个定量参考品进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下定量参考品的循环次数。

所述定量参考品其浓度根据二代测序下机实验确认为合适，认定其相对浓度为1。

(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；

所述标准曲线体现初始浓度的对数和循环次数之间的线性关系；

所述标准曲线系列中，各标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99，用于制作所述标准曲线的相同浓度的标准品对应循环次数差异小于或等于0.2，斜率处于-3.1至-3.6之间；所述各标准曲线的制作标准一致。所述标准曲线系列按照以下方法制作：

(2-1)对于包括有效浓度范围内给定的浓度呈梯度的2个或2个以上的标准品，按照预设条件进行荧光定量链式聚合反应，获得给定荧光强度下各给定浓度标准品的循环次数；

(2-2)通过最小二乘法对步骤(2-1)中获得的循环次数及给定的对数值拟合标准曲线，并计算所述标准曲线的线性相关系数；

(2-3)当所述标准曲线现性相关系数大于或等于0.99时，且斜率处于-3.1至-3.6之间时，优选地，且当步骤(2-1)的标准品中包括相同浓度的标准品时，其循环次数差异不超过0.2时，将步骤(2-2)获得的标准曲线纳入标准曲线系列；否则弃用所述标准曲线。

当采用5个或5个以上阶梯浓度给定浓度标准品时，可就所述多个阶梯浓度的标准品制作标准曲线，若所述标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99，则将所述标准曲线纳入所述标准曲线系列，并作为适用的标准曲线。否则，根据所述步骤(1)中获得的标准品给定浓度对数值及其循环次数选择适用的标准曲线，具体如下：

对于步骤(1)中获得的任一标准品给定浓度对数值及其循环次数，当所述标准曲线同时满足以下条件时，选择所述标准曲线作为适用的标准曲线：

条件1：在标准曲线所在的坐标平面内，体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及其循环次数的点与所述标准曲线之间的距离小于或等于体现步骤(1)中标准品给定浓度及其循环次数的点与所述标准曲线系列中其他任意标准曲线之间的距离；

条件2：用于制作所述标准曲线的体现标准品浓度对数值与循环次数的点中至少存在一个点，其与所述标准曲线之间的距离大于或等于体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及循环次数的点与所述标准曲线之间的距离。

由上可看出，对于任一标准品如果存在同时满足以上条件的标准曲线，则存在唯一标准曲线同时满足以上条件，对于多个标准品可能同时存在多条与标准品对应的标准曲线同时满足以上条件；因此：

若不能同时满足以上条件，则步骤(1)中标准品测试误差过大或没有合适的标准曲线，则应从步骤(1)开始重复；优选地，重复步骤(1)中采用多个给定浓度的标准品；更优选地，重复步骤(1)中采用多个例如5个及以上给定浓度呈梯度的标准品。

若仅存在一条标准曲线同时满足以上条件，则选择所述标准曲线作为适用的标准曲线。

若存在多条同时满足以上条件的标准品及其对应的标准曲线，则选择其一作为适用的标准曲线；优选地，选择与其相应的体现标准品浓度对数值与循环次数的点距离最近的标准曲线作为适用的标准曲线。

(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度。

优选还包括以下步骤：

(4)根据步骤(1)中获得的定量参考品的循环次数和步骤(2)中选择的标准曲线，标定定量参考品的浓度，根据定量参考品的浓度校正待测核酸样品的相对浓度。

所述待测核算样品的相对浓度，是指待测核酸样品的浓度相对于定量参考品的浓度的倍数。由于定量参考品浓度的得到下机实验效果的直接确认，因此只要将待测核酸样品的相对浓度调整到1则能保证下机实验的效果。

目前二代测序过程经常因为样品定量不准导致浪费或者爆机，而定量不准的原因非常复杂，包括：人工移液精确度误差；模板浓度过低；随着pcr循环次数增多，会进入平台期，不同的pcr反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制等等。而标准曲线的误差会将其他定量因素带来的误差放大，导致目前样品定量的问题。因此发明人通过选择实验条件与当次实验较为一致的比较准确的标准曲线，能显著降低定量误差，提高定量准确性。同时优选方案能显著减少标准品用量，节省耗材，降低定量成本。

以下为实施例：

本实施例针对illumina二代测序仪采用罗氏480ii实时荧光定量仪，目前illumina官方推荐文库定量试剂盒(kk4824)，与它匹配度最高的当然就是罗氏的几款qpcr仪，其中罗氏480ii实时荧光定量仪是目前使用量最多，相对更契合用于illumina二代测序仪测序文库的一款qpcr仪。本发明创新就是针对由于定量不稳定导致测序成本增加的现象，提出了应用于基因组二代测序文库使用罗氏480ii实时荧光定量仪准确定量的解决方案。

本实施例采用的标准曲线按照如下方法制作：

(2-1)在“quantificationsampletype”一栏内对标准品进行明确地编辑，选“standard”类型，然后在“concentration”一栏中对各标准品分别设定其相应的浓度，以及在“absquant/units”填写框中填写相应的浓度单位，如copies、pg等；实验运行完毕后，点击界面左侧的分析按钮分析数据,选择absquant/2ndderivativemax(二阶最大求导法)计算标准品的循环次数，即cp值。

(2-2)使用有效范围内的cp(作为纵坐标)和下表对应log[pm](作为横坐标)采用最小二乘法绘制标准曲线。

(2-1)选择标准曲线纳入标准曲线系列，选择要求：

1、标准品复孔之间cp差异不应该超过0.2。

2、绘制的标准曲线相关系数r²应不低于0.99。斜率应位于-3.1～-3.6(表示扩增效率位于90％～110％之间)。

3、相邻浓度标准品之间cp差异应该位于3.1-3.6之间。

实施例1

一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，包括以下步骤：对一个浓度20pm标准品以及3个待测核酸样品，进行荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；结果如下表：

(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；

所述标准曲线体现初始浓度的对数和循环次数之间的线性关系；体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及其循环次数的点如图1中显示的点p，根据条件1，选择距离点p最近的标准曲线为a，然而用于制作标准曲线a的所有点a1至a6，其与标准曲线a的距离皆小于点p与标准曲线的距离，因此根据条件2没有合适的标准曲线，故重复步骤(1)，及步骤(1’)

(1’)对6个浓度20pm、2pm、0.2pm、0.02pm、0.002pm、0.0002pm标准品以及3个待测核酸样品(采用步骤(1)的结果)、一个定量参考品(平衡文库)，进行荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；结果如下表：

(2’)就该6个标准品制作标准曲线，步骤如下：

(2-1)在“quantificationsampletype”一栏内对标准品进行明确地编辑，选“standard”类型，然后在“concentration”一栏中对各标准品分别设定其相应的浓度，以及在“absquant/units”填写框中填写相应的浓度单位，如copies、pg等；实验运行完毕后，点击界面左侧的分析按钮分析数据,选择absquant/2ndderivativemax(二阶最大求导法)计算标准品的循环次数，即cp值。

(2-2)使用有效范围内的cp(作为纵坐标)和下表对应log[pm](作为横坐标)采用最小二乘法绘制标准曲线。

所述标准曲线，线性相关系数r²＝0.999、efficiency:99％、slope:-3.3497、intercept:12.847、function：y＝-3.3497x+13.234，将所述标准曲线纳入标准曲线系列，并作为适用的标准曲线。

(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度如下表：

上机测试结果如下：

按照第二次结果将待测品稀释至4nm上机，最终下机数据十分理想，预计400m，实际产出402m。从表格看，第二次结果是第一次结果浓度的3倍左右，如果按照第一次结果来上机，肯定就会导致爆机。

另外由于定量参考品下机数据相当理想，可以把它当做定量参考品，参与每次定量，他的浓度为23±1pm。

实施例2

一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，包括以下步骤：

(1)对4个浓度20pm、2pm、0.2pm、0.02pm标准品以及3待测核酸样品，进行荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；结果如下：

(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；

所述标准曲线体现初始浓度的对数和循环次数之间的线性关系；

体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及其循环次数的点如图2中显示的点p1、p2、p3；

根据条件1，选择距离点p1最近的标准曲线为b，然而用于制作标准曲线b的所有点b1至b5，其与标准曲线b的距离皆小于点p1与标准曲线的距离，因此根据条件2没有合适的标准曲线；根据条件1，选择距离点p2最近的标准曲线为c，用于制作标准曲线c的所有点c1至c5中c5与标准曲线b的距离大于点p2与标准曲线的距离，因此满足条件2，标准曲线c作为备选的适用标准曲线；根据条件1，选择距离点p3最近的标准曲线为d，用于制作标准曲线d的所有点d1至d5中d3、d5与标准曲线b的距离皆大于点p2与标准曲线的距离，因此满足条件2，标准曲线d作为备选的适用标准曲线。

对于标准曲线c和标准曲线d，由于p2到c的距离大于p3到d的距离，因此选择标准曲线d作为适用的标准曲线。

(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度如下表：

根据标曲d的线性关系式y＝-3.2803x+13.072计算得到待测品浓度

按照计算结果将待测品稀释至4nm上机，最终下机数据十分理想(如图)，预计5.2g，实际产出5.3g。

实施例3

一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，包括以下步骤：

(1)对一个浓度20pm标准品、7个待测核酸样品、以及一个定量参考品，进行荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；结果如下：

(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；

所述标准曲线体现初始浓度的对数和循环次数之间的线性关系；

体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及其循环次数的点如图3中显示的点p4；

根据条件1，选择距离点p4最近的标准曲线为e，用于制作标准曲线e的所有点e1至e5中e3与标准曲线e的距离大于点p4与标准曲线的距离，因此满足条件2，标准曲线e作为的适用标准曲线；

(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度如下表：

(4)根据步骤(1)中获得的定量参考品的循环次数和步骤(2)中选择的标准曲线，标定定量参考品(平衡文库)的浓度为26.71pm，多次上机得知标定定量参考品(平衡文库)的浓度应该为23pm左右，因此需要给待测核算样品进行浓度矫正。

计算待测核酸样品的相对浓度如下表：

使用计算的相对浓度进行稀释上机，下机结果十分理想，预计5.05g数据量，5.1g下机数据量刚刚好。

从数据来看，实际读出来的浓度是计算相对浓度的大约1.2倍，按照经验，假如不使用矫正的相对浓度上机，最终数据量相应的会少20％。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。