一种固定植物杂种优势的方法与流程

本发明属于植物分子生物学和农业生物技术领域，尤其涉及一种诱导无融合生殖从而固定植物杂种优势的方法。

背景技术：

水稻是中国主要的粮食作物之一，其中杂交稻种植面积占水稻总面积的57%以上，平均产量7.2t/hm2，比常规稻单产高出1.4t，每年种植杂交稻所增产的粮食可多养活7000万人口。我国常年制（繁）种面积在18万hm²左右，杂交水稻的育种程序和生产环节较复杂，种子成本高，价格贵是制约杂交水稻发展的内在不利因素。水稻育种从三系、两系到一系，是历史的必然趋势。多年以来，人们就在探索固定杂种优势的途径和方法，提出了许多设想，如无性繁殖、试管繁殖、平衡致死、双二倍体等，最终还是认为利用植物的无融合生殖是一条最佳途径。2018年袁隆平先生把利用无融合生殖固定水稻杂种优势的第5代杂交水稻作为杂交水稻发展的方向。与三系或两系杂交育种系统相比，利用无融合生殖可以固定任何杂合的基因型，提高育种效率；简化杂种种子的生产程序，降低制种成本。

一个完整的植株包含孢子体世代(2n)，它具有特定的生殖结构（花器官），其中的雌蕊、雄蕊经过减数分裂和遗传重组，分别产生大孢子(1n)和小孢子(1n)；大、小孢子经过几次有丝分裂形成雌、雄配子体，雌配子体(胚囊)含有7个细胞(1个卵细胞、2个助细胞、1个具2核的中央细胞、3个反足细胞)并深埋于母体的胚珠组织中，雄配子体(花粉)含有1个营养细胞和2个精子；传粉后，花粉管进入胚囊，发生双受精作用，其中一个精子(雄配子)和卵细胞(雌配子)结合形成合子胚(2n)，另一个精子和中央细胞结合形成胚乳(3n)，由此完成一个生活周期，并开始新一轮孢子体世代。无融合生殖是植物在由配子体产生孢子体的过程中不经过精卵细胞融合而产生胚和种子的生殖方式。包括单倍体无融合生殖和二倍体无融合生殖两种基本类型。二倍体无融合生殖由于能产生与母体植株基因型完全相同的后代，能固定任何优良的基因型，所以，特别受育种家们的重视，我们通常所指的无融合生殖育种也主要是专指这一类型，它包括：不定胚(adventiveembryony)生殖，无孢子生殖(apospory)和二倍体孢子生殖(diplospory)。

我国水稻无融合生殖研究从1979年开始，在“七五”期间，我国水稻无融合生殖研究的热点就是筛选和鉴定水稻多胚苗材料，进而确定其胚胎学特性及育种价值。然而，通过对多胚苗水稻的胚胎发育进行深入研究后发现，部分多胚苗水稻具有单倍体无融合生殖特性，其多胚来源于卵细胞的受精作用和助细胞无配子生殖。要利用现有的多胚苗水稻来固定水稻的杂种优势难度相当大，甚至是不可能的。尽管有人报道在水稻中已经发现了具有不定胚生殖特性的材料，甚至已经成功地培育出无融合生殖水稻，但这类消息似乎还缺乏使人信服的胚胎学证据。我国水稻无融合生殖研究中的另一项重要内容就是利用现代生物技术，将具有无融合生殖特性的远缘物种的遗传物质导入水稻中，进而筛选水稻无融合生殖种质的探索性试验。通过穗茎注射法将大黍(panicammaximum)总dna导入籼型水稻之后获得了一些变异个体。利用粳稻广亲和品系02428与无融合生殖大黍品系ok85进行不对称体细胞杂交后成功地获得了再生植株，再生植株在花器形态、结构和生殖特性上发生了明显的变异，出现了多花药、多胚珠和多胚囊结构等特异的生殖现象。然而，通过分子育种技术和原生质体融合技术仍然没创造出具育种价值的水稻无融合生殖种质。

近年来植物生物技术飞速发展，通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中取得了很好的应用前景。近期通过分子生物学以及基因工程的手段在无融合生殖研究领域取得了重要进展。2018年底，美国加州大学戴维斯分校venkatesansundaresan教授团队发表的水稻无融合生殖体系；通过编辑pair1、rec8、osd1(mime)三个基因，结合卵细胞中异位表达bbm1(synthetic-apomictic)，实现了水稻的无融合生殖。2019年初，王克剑团队发表的利用基因编辑技术建立的水稻无融合生殖体系，在春优84中敲除mime和mtl四个内源基因，获得了可以发生无融合生殖的fix(fixationofhybrids)材料。通过无融合生殖途径实现“一系法”水稻育种目标的技术思路再次引起了许多学者的广泛关注。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明目的是提供一种诱导无融合生殖从而固定植物杂种优势的方法。另一方面，本发明还提供了使卵细胞致死、胚自主发生和筛选标记表达的核酸以及基因工程中间体，包括表达盒、重组载体、重组菌，判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了使卵细胞致死，胚自主发生的方法，具体如下：

一种固定植物杂种优势的方法，其包括如下步骤：

a、构建卵细胞或胚特异表达启动子驱动的致死基因表达盒e1；

b、构建珠被等体细胞特异表达启动子驱动的胚发生基因表达盒e2；

c、构建花粉特异表达启动子驱动的花粉失活基因表达盒e3；

d、构建筛选标记基因表达盒e4。

e、将4个连锁表达盒转入受体材料，杂合转基因植物在自交结实过程中珠被体细胞形成胚，未携带转基因的精子与中央细胞结合形成胚乳，进而发育成种子；未携带转基因的卵细胞和精子正常受精而结实；携带转基因的卵细胞败育，不能参与受精。后代种子中，具有标记的种子即为克隆种子，通过筛选标记将克隆种子和正常自交种子进行分选。

优选的，所述卵细胞或胚特异表达启动子包括但不限于atdd45、os03g0296600pro、eca1-like1pro、dcl2、at1g74480.1、zmealpromoter，所述致死基因包括但不限于barnase。

所述atdd45启动子和os03g0296600启动子序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述barnase基因序列如seqidno.3所示。含有a所述表达盒e1的卵细胞致死。

优选的，所述珠被体细胞特异表达启动子包括但不限于os02g51090pro、at-svl3pro，所述胚发生基因包括但不限于bbm1、wus、lec、clavata、myb115。

所述os02g51090启动子和at-svl3pro启动子序列如seqidno.4和seqidno.5所示，所述bbm1、wus基因序列如seqidno.6和seqidno.7所示。含有b所述表达盒e2的转基因植株珠被体细胞可形成胚。

优选的，所述花粉特异表达启动子包括但不限于pg47，所述花粉失活基因包括但不限于zm-aa1。所述pg47启动子序列如seqidno.8所示，所述序列如seqidno.9所示。含有c所述表达盒e3的花粉失活。

优选的，所述筛选标记基因表达盒e4的启动子包括但不限于胚特异表达启动子和组成型启动子。所述胚特异表达启动子osesp1序列如seqidno.10所示；所述筛选标记基因包括但不限于红色荧光基因rp，所述序列如seqidno.11所示。含有筛选标记基因表达盒e4的种子可见筛选标记。

本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒包含可操作连接到目的异源多核苷酸的上述的多核苷酸。

本发明还提供了核酸，在本文中，核酸可以是dna，也可以是rna，优选是dna。

本发明还提供了一种载体，所述载体包含上述的表达盒。

本发明还提供了一种载体，包含barnase基因表达盒，bbm1胚发生基因表达盒，zm-aa1花粉失活基因表达盒，rp筛选标记基因表达盒；所述barnase基因表达盒中barnase基因的序列如seqidno.3所示，所述bbm1胚发生基因表达盒中bbm1的序列如seqidno.6所示，所述zm-aa1花粉失活基因表达盒中zm-aa1序列如seqidno.9所示，所述rp筛选标记基因表达盒中rp的序列如seqidno.11所示。

另一方面，本发明核酸可被构建成表达盒插入转化进细胞中的任何载体中。扩增上述核酸片段的全长或任意片段的引物对也是本发明保护的范围。含有上述核酸片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明的保护范围。优选的细胞是植物细胞，优选是水稻细胞，更优选是杂交水稻细胞，所述植物细胞中包含的上述核酸可以是通过转基因技术（如本发明具体实施方式所述的技术）导入植物细胞的，包括导入到植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中，也可以是通过其它技术使得本发明所述核酸存在于植物细胞中的。

本发明还提供了一种植物，所述植物细胞包含上述的表达盒。

另一方面，本发明提供了植物，其包含上述核酸。由于引入了上述的核酸，本发明提供的植物能在珠被等体细胞形成无性胚。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物就能合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的单个植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品种、植株、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植物后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代。

本发明的一个实施例还提供了一种植物，所述植物包含四种核苷酸，其序列分别如seqidno.3，seqidno.6，seqidno.9，seqidno.11所示。

优选的，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物或双子叶植物为水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒。在本发明的具体实施方式中，更为优选的植物是水稻，进一步优选是杂交水稻。

另一方面，本发明提供了前述各表达盒在无融合生殖体系中的应用。卵细胞或胚特异表达启动子驱动的致死基因表达盒e1，可以使含转基因成分的卵细胞致死；珠被等体细胞特异表达启动子驱动的胚胎发生基因表达盒e2，可以使珠被等体细胞形成无性胚；花粉特异表达启动子驱动的花粉失活基因表达盒e3，可以使含转基因成分的花粉失活；筛选标记基因表达盒e4，可以使含转基因成分的种子带有筛选标记，用于分选。克隆种子可用于杂种优势的固定。

另一方面，本发明提供了鉴定本发明所述繁殖体的方法，即测定所述植物是否含有上述的4个连锁表达盒。通过该方法，可以判断植物是否属于本发明的植物。测定的步骤可以通过常规的核酸检测和测序，示例性的方法包括核酸测序、聚合酶链式反应（pcr）检测、筛选标记观察、荧光定量分选、探针杂交检测、序列测定和流式细胞分析等。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明取得的有益效果在于诱导无融合生殖从而进行植物杂种优势的固定，解决杂交种子的繁殖难题。这种固定杂交植物杂种优势的方法可以减除杂交种子的复杂制种程序，减轻劳动强度，降低杂交种子的生产成本，整体提高杂交种业的效益。卵细胞特异表达启动子驱动的致死基因表达盒可使含有外源基因的卵细胞致死，未含外源基因的卵细胞可正常受精；珠被等体细胞特异表达启动子驱动的胚发生基因表达盒可使转基因植株的珠被体细胞形成胚；花粉特异表达启动子驱动的花粉失活基因表达盒可使含有外源基因的花粉失活，未含有外源基因的花粉可参与正常受精；筛选标记基因表达盒可以用于克隆种子和正常授粉受精种子的分选。本发明将这4个紧密连锁的基因表达盒转入杂交植物，能使杂交植物产生含转基因成分的克隆种子和不含转基因成分的合子胚种子。因为克隆种子含有筛选标记，因而可以通过光电分选将含转基因成分的克隆种子和不含转基因成分的合子胚种子进行分离，克隆种子可用于繁殖，合子胚种子可用于商用。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1是本发明的实施例1中的无融合生殖载体p22aw结构示意图；

图2是本发明的实施例1中的无融合生殖载体p23ob结构示意图；

图3是本发明的无融合生殖体系技术路线图。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

携带卵细胞致死基因、胚胎发生基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因4个连锁基因表达盒的水稻表达载体构建：

1.特异启动子和目标基因的选择：

通过查阅文献和网页搜索，确定2个卵细胞特异表达启动子atdd45pro和os03g0296600pro；确定淀粉芽孢杆菌的核糖核酸水解酶基因barnase为致死基因；确定2个珠被等体细胞特异表达启动子os02g51090pro和at-svl3pro；确定2个胚胎发生基因wus和bbm1；确定1个胚胎特异表达启动子osesp1；确定红色荧光基因rp为筛选标记基因。

2.无融合生殖载体p22aw的构建：

将pcambia1300改造成双t-dna载体,在sacⅱ位点插入左右边界序列和多克隆位点10mcs2（其核苷酸序列见seqidno.12）,在10mcs插入rnase抑制基因barstar表达盒，rnase抑制基因barstar（其核甘酸序列见seqidno.13）携带卵细胞特异表达启动子atdd45和nos终止子（其核甘酸序列见seqidno.14）。在表达载体pcambia1300另一t-dna区域插入4个表达盒：卵细胞致死的rnase基因barnase表达盒、胚胎发生基因wus基因表达盒、花粉致死的淀粉酶基因zm-aa1表达盒、荧光筛选标记基因rp表达盒。rnase基因barnase携带卵细胞特异表达启动子atdd45和nos终止子；胚发生基因wus携带珠被特异表达启动子os02g51090pro和nos终止子；淀粉酶基因zm-aa1基因携带花粉发育后期特异表达启动子pg47、玉米的转运肽zm-bt1(其核苷酸序列见seqidno.15)和终止子in2-1（其核苷酸序列见seqidno.16）；载体plj02上的rp编码序列携带胚胎特异表达启动子osesp1和nos终止子。完整的载体构建图谱见附图1。

3.无融合生殖载体p23ob的构建：

将pcambia1300改造成双t-dna载体,在sacⅱ位点插入左右边界序列和多克隆位点10mcs2，在10mcs插入rnase抑制基因barstar表达盒，rnase抑制基因barstar携带卵细胞特异表达启动子os03g0296600和nos终止子。在表达载体pcambia1300另一t-dna区域插入4个表达盒：卵细胞致死的rnase基因barnase表达盒、胚胎发生基因bbm1基因表达盒、花粉致死的淀粉酶基因zm-aa1表达盒、荧光筛选标记基因rp表达盒。rnase基因barnase携带卵细胞特异表达启动子os03g0296600pro和nos终止子；胚发生基因bbm1携带珠被特异表达启动子at-svl3pro和nos终止子；淀粉酶基因zm-aa1基因携带花粉发育后期特异表达启动子pg47、玉米的转运肽zm-bt1和终止子in2-1；载体plj02上的rp编码序列携带胚胎特异表达启动子osesp1和nos终止子。完整的载体构建图谱见附图2。

4.重组质粒转化：

（1）取一管200μl大肠杆菌感受态细胞dh5a与5μl连接产物混合，冰浴30min；

（2）迅速置于42℃恒温水浴锅中，热激90s，冰浴2min；

（3）加入500μllb液体培养基，混匀；

（4）37℃、200rpm，培养45min，使细胞恢复正常生长状态；

（5）将菌液均匀涂布于lb固体培养基平板上；

（6）30min后，置37℃恒温培养箱，过夜培养。

（7）挑取正确的单克隆接菌，抽提质粒，酶切验证。

5.重组菌的获得：

将构建正确的植物表达载体使用电激法转化农杆菌eha105。导入方法采用电激转化方法，主要参考bio-rad公司的电击仪使用说明书进行，具体步骤如下：

将储存于-80℃的eha105感受态细胞取出放在冰上冻融，1mm电击杯放在冰上预冷，把冻存的soc放置在37℃解冻。将干净的ep离心管插在冰上预冷，一般ep离心管的数目比要转化的样品多两个，一个用来做阴性对照（没有加入dna）、另一个做阳性对照（加入1μl的10ng/μlpuc19）。分别吸取1μl要转化的dna样品放入预冷的ep离心管中，然后将融化的eha105感受态细胞20μl轻轻取出放入预冷的离心管底部，轻轻的将两者混匀，尽量不要产生气泡，离心管底部不要用手接触，避免温度变化对感受态转化效率造成影响，操作过程尽量的快。设置转化参数，电阻200ω，电容25μf，电压1800v，电激杯规格1mm，biorad电激仪一般有推荐使用的参数。轻轻吸取感受态和dna混合物，放入电激杯中，轻敲使混合物均匀的分布于杯底。盖上盖子放入电激槽中，关上安全盖，按下电激红色按钮，待电激完成后，将在37℃预热好的soc放入电激杯中，将混合物旋起，用吸头将混合物转入摇菌管中，于28℃恒温摇床，180rpm,2h。取50μl菌液涂布在含卡那霉素（50μg/ml）和利福平（25μg/ml）的lb固体培养基上，28℃暗培养2d，挑取农杆菌转化子单菌落，接种到添加了相同抗生素的lb液体培养基中，28℃条件下，振荡培养2d。取适量菌液加入等体积的50%浓度的无菌甘油混合，于-80℃条件下保存、备用。

实施例2

转基因植株的获得：

挑选卵细胞致死表达载体和胚胎发生表达载体农杆菌单菌落接种于含50mg/lkanamycin的lb培养基上26℃暗培养2天后，用nb-as液体培养基洗下农杆菌菌体，28℃180rpm液体振荡培养90-120分钟。调整菌落浓度至od600为0.8-1.0，即可用于转化。

分别转化杂交稻，杂交水稻种子消毒，挑选子粒饱满的种子，用75%的酒精浸泡30s，倒掉酒精，无菌水冲洗一遍，用hgcl2消毒8min，无菌水清洗2遍，每次浸泡1min，用无菌水浸泡1h。消毒后的种子接种到诱导培养基上，光照下生长7d。

将无菌愈伤集中在一起。放入农杆菌悬浮液中，浸泡5-10min，取出，用滤纸晾干。接种到共培养培养基，共培养2天，将共培养的愈伤，清洗6遍，并用滤纸晾干后接种到具有潮霉素抗性的筛选培养基上45d。

将抗性愈伤转移到分化培养基上，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待小植株长至7-10cm左右时进行室内炼苗，3-4d后将其移栽到土壤中生长。通过观察荧光和pcr检测筛选出阳性植株。

实施例3

转基因植株的分子检测：

dna抽提：取1.0g叶片，液氮研磨至粉末状，转入2mlep管中，加入700μl预热的ctab溶液。于65℃水浴30-60min，期间轻轻混匀，冷却后加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），混匀，12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，加入500μl异丙醇，-20℃静置30-60min。4℃，12000rpm，10min收集沉淀，弃上清。70%乙醇清洗沉淀2次，吹干酒精残留，50-100μlddh2o溶解沉淀，备用。

pcr分析：以barnase基因作为模板设计引物，扩增产物片段为308bp。

正向引物f：

5'atggcacaggttatcaacacgtttg3'，

反向引物：

r:5'tggtccgttgttttgtaaatcagcc3'。

pcr反应体系：dna30-90ng,10×buffer2.0μl,1mmdntp1.8μl,25mmmgcl21.5μl,10umprimer两种各0.5μl,tag酶1.5u，加ddh2o至20μl反应体积。pcr循环条件94℃，3min；94℃，1min，64℃，1.5min，72℃1.5min，40个循环；72℃，延伸5min。用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，照相记录电泳结果。

荧光定量分析：使用植物总rna提取试剂盒（天根dp432）对t0代转基因杂交稻和野生型杂交稻对照进行rna抽提，方法参考试剂盒说明书。以总rna为模板逆转录合成相应的cdna。以actin为内参基因，野生型植株为对照，用rt-pcr的方法对barnase基因进行定量pcr检测。

southern印迹分析：取水稻总dna进行ecorⅰ酶切、电泳、转移至硝酸纤维素膜hybond-n。利用随机引物标记试剂盒（promega公司）和[α-32p]datp（北京亚辉公司），随机引物法制备α-32p标记的barnase基因片段，作为分子探针，按照sambrook等分子克隆方法进行转化植株的southern杂交分析。

实施例4

转基因植株的农艺性状考察：

对经过分子鉴定的转基因植株考察花粉育性和结实情况。取开花时的花药，经常规的i2-ki染色后，观察不育花粉和可育花粉比率。与野生型对照比较，观察转基因植株的株高、分蘖数、剑叶长、结实率、千粒重等农艺性。

实施例5

杂交水稻的无融合生殖繁殖：

将携带无融合生殖载体的杂交水稻自交。收获含转基因成分的克隆种子和不含转基因成的正常授粉受精种子，通过光电分选，分拣出带红色荧光的种子，即克隆种子，用于杂交种子的繁殖；不带红色荧光的非转基因杂交种子用于商用。所述无融合生殖体系如图3所示。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

sequencelisting

<110>湖南杂交水稻研究中心

<120>一种固定植物杂种优势的方法

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