本发明属于水产养殖鱼类辅助育种
技术领域：
，涉及snp分子标记技术，具体涉及一种与牙鲆体色异常关联的snp分子标记及其应用。
背景技术：
：牙鲆等比目鱼作为优质的经济海水鱼已在我国北方大量规模化养殖。但经常在比目鱼类人工孵化群体中可以发现个体体色异常的现象，比例也比较高，这已经成为我国乃至世界人工养殖牙鲆面临的一个重大问题，也是亟待解决的问题。比目鱼体色异常可划分为白化(albinism)和黑化(hypermelanism)两种主要类型，它们分别指的是有眼侧出现白斑即色素细胞或色素减少；黑化指的是无眼侧出现黑斑即色素细胞增加。因白化或黑化区域的不同，使比目鱼类体色异常的类型呈现多样化。其中，比目鱼类的白化又可分为真白化(albino)和假白化(pseudo-albino)。真白化是因为酪氨酸酶基因发生突变所导致的黑色素不能合成所造成的，真白化个体的体表全白，眼睛也因为缺少黑色素颗粒而显红色；假白化是有眼侧色素细胞发育和分化受到影响的结果，假白化个体身体或多或少保留部分体色。近年来有关体色异常的研究很多，比如牙鲆的养殖环境，如光照强度、水流速度，水深、水温、养殖密度等，还有营养因素对牙鲆体色异常的影响，这些研究对于改善牙鲆体色异常现象有一定的效果，但很少有研究是从遗传角度出发解决体色异常问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种与牙鲆体色异常关联的snp分子标记，snp即单核苷酸多态性，与生物的很多性状如生长速度、抗病性和抗逆性联系密切，从遗传因素出发，通过与牙鲆体色相关的snp位点对繁育牙鲆进行育前分子筛查，从种质上降低牙鲆后代体色异常的发生率，解决现有技术中牙鲆体色异常的问题。本发明的上述目的通过以下技术方案实现：本发明的与牙鲆体色异常关联的snp分子标记，具体如下：adc-2677-c/a，位于基因adenylatecyclasetype6-like如seqidno：1所示碱基序列的2677bp位置，碱基a突变成c，苏氨酸变成组氨酸，正常牙鲆基因型为68.75％aa、31.25％ac、0％cc，黑化牙鲆基因型为0％aa、37.5％ac、62.5％cc，白化牙鲆基因型为14.29％aa、64.29％ac、21.42％cc。上述与牙鲆体色异常关联的snp分子标记的筛选方法，包括以下步骤：(1)分别选择正常牙鲆的正常皮肤、无眼侧体色异常的牙鲆无眼侧正常的白皮肤以及无眼侧体色异常的无眼侧黑皮肤进行基因双向测序，再对测序数据进行snp分析，初步检测出snp位点，分析得到在差异表达基因中显著性富集的通路；(2)在步骤(1)中与体色相关的通路中进行snp分析，筛选出位于编码区非同义突变的snp位点；(3)对牙鲆在步骤(2)得到的snp位点进行分型；(4)筛选与牙鲆体色异常关联的snp位点。进一步，步骤(1)中，所述差异表达基因中显著性富集的通路的分析方法包括基因注释、差异基因表达分析、差异基因go富集分析和差异基因kegg富集分析。进一步，步骤(3)中，所述snp位点分型采用的引物如seqidno：2和seqidno：3所示。进一步，上述与牙鲆体色异常关联的snp分子标记的筛选方法，具体为：(ⅰ)采集正常牙鲆的正常皮肤、无眼侧体色异常的牙鲆无眼侧正常的白皮肤以及无眼侧体色异常的无眼侧黑皮肤，提取rna，并质检，提取的样本rna进行转录组双向测序，利用生物信息学手段对测序数据进行snp分析；(ⅱ)在6个与体色相关的通路中(arachidonicacidmetabolism、thyroidhormonesynthesis、phototransduction、melanogenesi、retinolmetabolism、pparsignalingpathway)进行snp分析，6个通路中存在snp位点的基因有59个，通过ncbi网站上的blast软件筛选出位于编码区非同义突变的snp位点，最后得到12个基因中的22个位于编码区的snp位点，对这22个snp位点进行snp分型，方法为：分别采集同一生长环境下的正常牙鲆16尾、黑化牙鲆样本16尾、白化牙鲆样本16尾，提取dna，针对每一个snp位点设计引物如seqidno：2和seqidno：3所示，以提取的dna为模板进行pcr，运用直接测序法对snp位点进行分型，测序峰图中对应位置仅有c峰，则该个体基因型为cc，若为c和a双峰，则该个体基因型为c/a，若仅有a峰，则该个体基因型为aa；(ⅲ)对采集的16个正常牙鲆样本、16个黑化牙鲆样本、16个白化牙鲆样本的各个snp位点的基因型进行统计，用spss18.0软件对正常牙鲆样本和白化牙鲆样本，正常牙鲆样本和黑化牙鲆样本的基因型统计结果进行单因素方差分析(p<0.05：显著性差异；p<0.01：极显著差异)，保留具有显著性差异的snp位点，获得一个snp位点在正常牙鲆和黑化牙鲆样本中的基因型分布具有极显著差异，即位于基因adenylatecyclasetype6-like如seqidno：1序列的2677bp位置adc-2677-c/a。上述与牙鲆体色异常关联的snp分子标记在降低牙鲆体色异常率的育种方面的应用。进一步，上述snp分子标记用于降低牙鲆体色异常率育种的具体步骤为：对选做亲本的牙鲆剪取部分鳍条，提取组织dna，以提取的dna为模板进行pcr扩增，pcr产物测序，筛选出snp位点adc-2677-c/a为aa纯合的牙鲆为父本和母本进行人工育种，建立snp位点adc-2677-c/a为aa纯合的牙鲆家系，则其后代为体色异常率较低的苗种。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：相较于现有改善牙鲆体色异常技术，本发明从基因角度出发，筛选到与体色异常相关的snp位点，并把此位点运用在牙鲆育种工作中，有望从遗传角度根本性的解决牙鲆体色异常问题。具体实施方式以下结合具体实施方式对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。与牙鲆体色异常关联的snp分子标记的筛选方法，具体为：(1)采集正常牙鲆的正常皮肤、无眼侧体色异常的牙鲆无眼侧正常的白皮肤以及无眼侧体色异常的无眼侧黑皮肤，提取rna，并质检。(2)提取的样本rna进行转录组双向测序，利用生物信息学手段对测序数据进行snp分析。(3)在6个与体色相关的通路中(arachidonicacidmetabolism、thyroidhormonesynthesis、phototransduction、melanogenesi、retinolmetabolism、pparsignalingpathway)进行snp分析，6个通路中存在snp位点的基因有59个，通过ncbi网站上的blast软件筛选出位于编码区非同义突变的snp位点，最后得到12个基因中的22个位于编码区的snp位点，对这22个snp位点进行分型。(4)snp分型：分别采集同一生长环境下的正常牙鲆16尾、黑化牙鲆样本16尾、白化牙鲆样本16尾，提取dna，针对每一个snp位点设计引物如seqidno：2和seqidno：3所示，以提取的dna为模板进行pcr，运用直接测序法对snp位点进行分型。(5)分型规则：测序峰图中对应位置仅有c峰，则该个体基因型为cc，若为c和a双峰，则该个体基因型为c/a，若仅有a峰，则该个体基因型为aa。(6)对采集的16个正常牙鲆样本、16个黑化牙鲆样本、16个白化牙鲆样本的各个snp位点的基因型进行统计，用spss18.0软件对正常牙鲆样本和白化牙鲆样本，正常牙鲆样本和黑化牙鲆样本的基因型统计结果进行单因素方差分析(p<0.05：显著性差异；p<0.01：极显著差异)，保留具有显著性差异的snp位点，最终获得一个snp位点在正常牙鲆和黑化牙鲆样本中的基因型分布具有极显著差异(结果详见表1、表2)，即位于基因adenylatecyclasetype6-like如seqidno：1序列的2677bp位置adc-2677-c/a。表1：adc-2677-c/a位点不同类型样本间的基因型分布统计结果表2：样本间对比的显著性x2分布正常牙鲆黑化牙鲆正常牙鲆-21.09**白化牙鲆10.29**6.26*注：x20.05＝5.991、x20.01＝9.21正常牙鲆和黑化牙鲆位点adc-2677-c/a分型的显著性检验结果x2＝21.09>9.21，p<0.01，表明在此位点上正常牙鲆样本和黑化牙鲆样本间基因型分布具有极显著性差异，此snp位点与牙鲆黑化相关。正常牙鲆和白化牙鲆位点adc-2677-c/a分型的显著性检验结果x2＝10.29>9.21>5.991，p<0.01，表明在此位点上正常牙鲆样本和白化牙鲆样本间基因型分布具有极显著差异，此snp位点与牙鲆白化相关。snp位点adc-2677-c/a与牙鲆白化黑化都有相关性。实施例1本实施例旨在验证所筛选到的snp位点在正常牙鲆和体色异常牙鲆中是否有普遍性特征。具体实施方法为：不同类型牙鲆样本的采集：50尾正常牙鲆样本、50尾黑化牙鲆样本、50尾白化牙鲆样本，抽提样本dna，使用权利要求4提供的引物以提取的样本dna为模板进行pcr扩增，产物测序，对测序结果进行分析，统计样本adc-2677-c/a位点的基因型，用spss18.0软件对正常牙鲆样本和白化牙鲆样本，正常牙鲆样本和黑化牙鲆样本的基因型统计结果进行单因素方差分析(p<0.05：显著性差异；p<0.01：极显著差异)，统计结果详见表3和表4。表3：camp-976-g/a位点不同类型样本间的基因型分布统计结果表4：样本间对比的显著性x2分布正常牙鲆黑化牙鲆正常牙鲆-53.61**白化牙鲆23.93**5.04注：x20.05＝5.991、x20.01＝9.21正常牙鲆和黑化牙鲆位点adc-2677-c/a分型的显著性检验结果x2＝53.61>9.21，p<0.01，表明在此位点上正常牙鲆样本和黑化牙鲆样本间基因型分布具有极显著性差异，此snp位点与牙鲆黑化相关；正常牙鲆和白化牙鲆位点adc-2677-c/a分型的显著性检验结果x2＝23.93>9.21>5.991，p<0.01，表明在此位点上正常牙鲆样本和白化牙鲆样本间基因型分布具有极显著差异，此snp位点与牙鲆白化相关。说明筛选到的snp位点与牙鲆黑化白化现象都相关，且结论稳定，是牙鲆体色异常关联的snp分子标记。实施例2本实施例将筛选到的snp位点运用到育种工作中，以改善牙鲆体色异常现象。体色正常牙鲆snp位点adc-2677-c/a的优势基因型为aa纯合型、黑化牙鲆此位点的优势基因型为cc纯合型、白化牙鲆此位点的优势基因型为ac杂合型，选育体色正常牙鲆的育种方法是筛选snp位点adc-2677-c/a为aa纯合的牙鲆为父本和母本进行人工育种。(1)选择体色正常，生长状况好的牙鲆作为亲本。(2)对选做亲本的牙鲆剪取部分鳍条，提取组织dna，以提取的dna为模板进行pcr扩增，筛选出snp位点adc-2677-c/a为aa纯合的牙鲆用作繁育亲本。(3)以上步筛选的牙鲆为父本和母本进行人工育种，建立snp位点adc-2677-c/a为aa纯合的牙鲆家系，则后代具有较低的体色异常发生率。(4)建立的snp位点adc-2677-c/a为aa纯合的牙鲆家系a和普通牙鲆家系b在同一环境中进行人工繁殖、孵化、苗种培育，饲养条件、光照、水温、水深、密度等都保持一致。培育到120天，然后随机从家系a和家系b群体中选出100尾牙鲆，统计每条鱼的体色是否正常，统计结果见表5。表5：两个家系牙鲆体色统计正常牙鲆(％)黑化牙鲆(％)白化牙鲆(％)家系a62353家系b335611在家系a中体色正常的牙鲆比例为62％，黑化牙鲆比例为35％，白化牙鲆比例为3％，在家系b中体色正常的牙鲆比例为33％，黑化牙鲆比例为56％，白化牙鲆比例为11％，家系a与家系b相比，正常牙鲆比例增加了29％，黑化牙鲆比例减少了21％，白化牙鲆比例减少9％。表明把筛选到的snp位点adc-2677-c/a运用到牙鲆育种中，可以有效减少牙鲆养殖过程中的体色异常现象。序列表<110>上海海洋大学<120>一种与牙鲆体色异常关联的snp分子标记及其应用<141>2019-04-26<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>4473<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>1gagcaggaggaagaggaggagggggtcttaaaaaaaaaacaaaactggggctccactgca60gtgttacagttactcctgtaacgaggatatctaatgaagaacaggtggtctttagaggcg120ctaggcggagtctagggctgacacgctgaaccaagggtggctcaaatgcagacacacctc180tgatgcctctggccagtttgagctctatggtgtgtgctcgctgggataaactagtggcct240ggccaaagagcaaagtgttgctacacacagtaaagcccacacaggatgtcgtgggccaga300ggcctctttgtaggcagagtggacgatcggaagacagcatggggagagcgcaacggcaaa360aagaggaaggacagctcatccctgtgcaacccgcgctacatgagctgcttgagggaccct420gaggacctggagccctctaatgtggcccctcagcattaccactgtgcagcgggcaccagc480gggggcaactttggcttgcgctgtggctggcaggaggaccactatgggaaaaggatgggt540ggtggtggggatctgggtctaaaggcggtgaaccttggcttcgaagatggcgacctgaag600ggaaggaaagaggaggaatcaggggaattagctgtgggcagctgcaacacgatgactgct660gcagactgctggatgcggtttgtgtgggttttccaatccaagaagtttcagtccaccaag720ctggagcgcctgtaccagcgctacttcttcaggctcaaccagagctccctgaccatgctg780atgggggtgctggtggtggtgtgtggggtcatgcttgccttccactgcatccacacgacc840cctgatgatgcctatgtctcagtactctgtgtggctatggcgctcttcttggccatgatg900gtggtgtgcaaccgcaatggcttccatcaggactacatgtggattgtgagctatctggtg960atcggggtgctgattgtggtgcaggtttttggggtgctgaagatgtatccccgcagtgcc1020tctgagggcatctggtggacagtcttcttcatctacattatctacacactgctgccggtc1080agaatgagagccgctgtggtcagtggagcagtgctgtccaccatacatgtaatcaccgcc1140tggcagctcaaccaagaggacaagtacattttcaaacaggtcagtgccaatgtgctgatc1200ttcctgtgcaccaacatgattgggatctgtacccactaccccgcggaggtctcccagaga1260caagccttccaggagacgagaggatacatccaggctagactgcacctgcagagggaaaac1320cagcagcaggagcgcctactgctgtcagtactgccaaggcacgttgccatggagatgaag1380gctgatatcaatgccaagaaggaagatatgatgttccacaagatctacattcaaaaacat1440gacaatgttagcatactgtttgcagacatcgagggcttcaccagcctggcatctcagtgc1500acggcccaggagctggtcatgacgctgaacgagctgttcgcccgcttcgacaagctggcc1560tcggagaaccactgcctgcgcattaaaatcctcggggactgttactactgtgtgtcaggg1620ctgcctgagcccagggctgaccacgcccactgctgtgtggagatgggagtagacatgatc1680gaagccatctcgctggtgagagaggtgacaggcgttaatgtgaacatgcgggtgggcatc1740cacagcggtcgcgttcactgcggggtgctgggcctgcgcaagtggcaatttgatgtctgg1800tccaacgacgtgacgctcgctaaccaaatggaagctggaggcaaggctgggcgtatccac1860atcacaaaagccacactgcagtatctgaacggggactacgaagtggagccgggatttgga1920gaagagaggaatacttacctgaaggagaacgacattgaaaccttcttggtgctgggctgc1980agccaaaagaggaaagaggagaaagccatgatggccaagatgcagagaacacgtgcaaat2040tctgctgagggactgatgccacgctgggtgcctgacagatccttctccagacccaaggag2100cccaaagccttcaggcagatgggcatcgacgaagcatccagcaaagacaaccgctgcact2160caggaggccctgaaccccgaggatgaggtggatgagtttcttggacgggccatcgacgcg2220cgcagcattgaccagctgcggaaagatcacgtcaagaagtttctgctcacttttcagaca2280gctgacctcgagaaaaagtactccaaaaaggttgatgatcgttttggaggatacgtggcc2340tgcacactccttgttttctgctgcatctgtttcattcagatcatcattttcccgaggaca2400acacttatgctaggtctttacatcagcatcttcatcatccttaacaacatcctcttcatc2460tgtgccatctactcctgcatcaaactcttcccagttgccttgcagactgtaaccaagaaa2520atagtccagtcacgtgcaaacagcacactggttggcgtcttcaccatcctcctcctcttc2580atctcctcttttgctaatatgtttacctgcagcacagagaaactggaggactgcgtggcc2640gacgagctgaacacatcagtgactctctgcctgctgcacaacctgaccaagacagccgag2700gatggtttgactctgtgctccagccaggccatgccctgccatttccccgagtacttcagc2760tacagcgtgttgctgaccctgctggcctgctctgtgttcctccacatcagcagcataggg2820aagctggctctgatgctgctcatccagctcactttcctcctgctggtagagtggcctcag2880gtggccctgtttgacaacgcagacctgctggtcattgccaacaacctgaaattatcaaat2940aatgattcccaacaacagcctagtttcaatgaaactgcagaacagtgcctggagagtgtg3000accaaggtatccctaaaggtcatgacccctgtaatcctgacagtttttgttctggctctc3060tacttgcacggccagcaggtggagtccactgctcgcctggacttcctctggaagctgcag3120gccacagaagagaaggaggagatggaggagctgcaagcatacaaccggcgcctgctgcac3180aacatcctacccaaggacgtggctgcccactttcttgcgagggagcgtaggaatgacgag3240ttgtactaccagtcatgtgaatgcgtcgctgtcatgtttgcctccattagcaacttctct3300gagttttacgtggagctggaggcaaacaacgagggagtggaatgtctcaggctgctcaac3360gagatcatcgctgattttgatgagatcatcagtgaggagagattccgtcagctggagaaa3420atcaaaaccatcggctccacctacatggcagcctccggcctcaaccattccacttatgat3480aaagaaggccgctcacacattctagctttggctgactacgccatgaggcttagagaacag3540atgaaatacatcaacgagcactccttcaacaacttccagatgaagataggactgaacatg3600gggcctgtggtggcaggggtgattggagccaggaaaccccagtatgatatatgggggaac3660acagtcaacgtggctagccgcatggacagcacaggagtaccagactacatccaggtgacc3720acagacttgtaccacgtgctggtcaacaacggataccagctggactgccgaggtgtcgtc3780aaggtgaaggggaagggggagatgaccacctacttcctcaccagcggtcccccgggcagt3840taatgacagagcggggctgcccacagagtgactcccattgcactgacataacagagagca3900gcagagagacttgagagttcagcccggcgacgagcaacggagcgtggtgcgaacgcgcca3960gggacgggagatggccggcagagacgagccaggcccttctcgcctattgtcacatcataa4020gatgcacacacgtaggacgttgttcacgtttgaaggcccccccaccccaccccaagctgc4080ttgagagataacgaagcccagttgccttaggacggaggtggctatgcttgtgttgatgag4140caatagtatgagtatctcatctggagtcaatatttattttcatgaggatggatttttttg4200tgataaccttgtacaaaaatgaaaatatttacatacaaaaaaagctatgtcacttaacag4260aaaatatgcaaggacaatatgaaggatgaaaatgaccaaagaacaaatgtttgatatgaa4320acacacacacaaattattctgttcagaaaatacagtaatttattcaactgcagacagcaa4380gggccacggtaacgtcactgtctttgatggggacaaacttttctttttttagctgcggat4440tttttcatggggataacacacacacacacacac4473<210>2<211>21<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>2cctgcagcacagagaaactgg21<210>3<211>21<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>3acttcagctacagcgtgttgc21当前第1页12