本发明属于医药技术领域，涉及欧鼠李苷(frangulin-a)的提取工艺及其医药用途。
背景技术：
瑶药紫九牛为鼠李科属植物翼核果(ventilagoleiocarpabenth)的根茎，收载于《全国中草药汇编》，《中国瑶药学》等，别名血风根、血风藤、红蛇根、青筋藤、铁牛入石、拉牛入石；瑶医认为紫九牛具有养血祛风、舒筋活络、固肾益精等功效；用于治疗贫血头晕，月经不调，闭经，慢性肝炎，肝硬化等疾病。在临床上，经过民间长期的使用历史，表明翼核果具有较好的临床疗效。
欧鼠李苷是从翼核果药材中分离得到的苷类结构单体成分，其化学结构式如下：
经查阅文献，苷类成分的提取分离纯化可采用多种方法来实现。
刘姝、沈婉丽、连冠等人在《优化石榴皮中安石榴苷的分离与纯化工艺》一文中，公开了一种采用了50％乙醇常温超声波辅助法提取，大孔吸附树脂富集，反相mcigelchp20p色谱柱对安石榴苷进一步分离纯化的方法。该法所涉及的苷类成分的提取分离纯化方法操作可行性高，但该方法纯化后安石榴苷的纯度仅能达到61.2％。
李静、赵勇、孙文基在《rp-hplc制备色谱法分离玄参中的桃叶珊瑚苷和哈帕苷》一文中，公开了一种对鲜玄参根采用了甲醇冷浸提取，再经大孔吸附树脂和硅胶柱层析得哈帕苷与桃叶珊瑚苷的混合物，进行hplc制备色谱分离，最后得到高纯度的哈帕苷(纯度99.1％)与桃叶珊瑚苷(纯度99.6％)。该法所涉及的苷类成分的提取分离纯化方法可获得高纯度的苷类单体化合物，但该法使用的rp-hplc制备色谱法分离纯化成本高，不易于转化为大生产。
技术实现要素：
本发明要解决的其中一个技术问题是：针对上述现有技术存在的不足，提供一种提取纯度高、易于产业化的欧鼠李苷提取方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题：
一种欧鼠李苷的提取方法，包括以下具体步骤：
(1)取翼核果药材粗粉，按照药材粗粉和乙醇溶液质量比1∶6～10加30～95％乙醇溶液加热回流提取1～5次，每次0.5～3h，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浸膏；按照浸膏和水质量比为1∶1～10加水使混悬，再按照水和石油醚体积比为1∶1～10加石油醚萃取3～5次，将石油醚层弃去；再按照水和乙酸乙酯体积比为1∶1～10加乙酸乙酯萃取3～5次，留乙酸乙酯层浸膏；
(2)取乙酸乙酯层浸膏，过正相硅胶层析柱，所述乙酸乙酯层浸膏与硅胶的质量比为1∶20～1∶50，依次利用体积比为100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30的乙酸乙酯-甲醇溶剂梯度洗脱，每个溶剂梯度用量为硅胶柱体积的3～10倍；采用薄层色谱检测，将能够检测到欧鼠李苷frangulin-a的组分进行合并；
(3)将合并所得组分过反相硅胶层析柱，所述合并所得组分与反相硅胶的质量比为1∶20～1∶100，将甲醇和水按照体积比为20∶80～60∶40配制成洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂用量为反相硅胶柱体积的20～40倍；分段收集洗脱液，采用高效液相色谱检测，合并欧鼠李苷frangulin-a纯度≥98％的组分，得到欧鼠李苷frangulin-a；
所述石油醚的沸点为60℃～90℃。
优选地，所述步骤(1)中浸膏的提取步骤具体为：取翼核果药材粗粉，用95％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浸膏。
优选地，所述翼核果药材为鼠李科属植物翼核果的根茎。
本发明要解决另一个技术问题是：提供欧鼠李苷的具体医药用途。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：欧鼠李苷在制备抗肝损伤药物中的用途。
与现有技术相比较，本发明建立起的苷类结构成分欧鼠李苷(frangulin-a)提取分离纯化的方法具有以下优点：
1.所用的提取溶剂安全，无毒。
2.易于产业化，具有较好的市场应用价值。
3.所得到的产品纯度高，有利于产品质量控制及进一步的开发利用。
此外，本发明通过对大鼠肝细胞酒精性氧化损伤进行了保护作用实验，证明了欧鼠李苷有良好的抗氧化和保肝作用，为翼核果药材的深度开发提供了实验依据。
具体实施方式
下面将使用本领域技术人员向本领域其它的技术人员传达他们工作的实质所通常使用的术语来描述本方案的发明理念。然而，这些发明理念可体现为许多不同的形式，因而不应视为限于本方案中所述的实施例。提供这些实施例是为了使本方案内容更详尽和完整，并且向本领域的技术人员完整传达其包括的范围。所提供的实施例不相互排斥。来自一个实施例的参数可假设成在另一实施例中存在或使用。在不脱离本方案实施例范围的情况下，可以用多种多样的备选和/或等同实现方式替代所示出和描述的特定实施例。本发明旨在覆盖本方案论述的实施例的任何修改或变型。对于本领域的技术人员而言明显可以仅使用所描述的方案中的一些方面来实践备选实施例。本方案出于说明的目的，在实施例中描述了特定的参数设置，然而，本领域的技术人员在本方案披露的步骤基础上，变更这些具体的参数也可以实践备选的实施例。在其它情况下，可能省略或简化了众所周知的特征，以便不使说明性的实施例难于理解。
欧鼠李苷提取实施例1-3所采用的材料：
(1)紫九牛药材购自于广西金秀瑶族自治县，经广西中医药研究院鉴定为鼠李科属植物翼核果(ventilagoleiocarpabenth)的根茎后使用。
(2)石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯。
欧鼠李苷提取实施例1
取翼核果药材粗粉1.0kg，用8倍量(w/w)50％乙醇加热回流提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浸膏；浸膏加6倍量(w/w)水使混悬，先用6倍量(v/v)石油醚(60℃～90℃)萃取5次，石油醚(60～90℃)层弃去，再用6倍量(v/v)乙酸乙酯萃取5次。
取乙酸乙酯部位浸膏，过正相硅胶层析柱(w浸膏∶w硅胶＝1∶50)，依次用乙酸乙酯-甲醇(100∶0→95∶5→90∶10→80∶20→70∶30)梯度洗脱(每个溶剂梯度用量为硅胶柱体积的4倍)，采用薄层色谱检测，合并可检测到欧鼠李苷(frangulin-a)的组分。
将合并组分过反相硅胶层析柱，(w样品∶w反相硅胶＝1∶50)，用40％甲醇/水为洗脱剂洗脱(洗脱剂用量为反相硅胶柱体积的30倍)，分段收集洗脱液，采用高效液相色谱检测，合并欧鼠李苷(frangulin-a)纯度≥98％的组分，得到欧鼠李苷(frangulin-a)0.18g。
欧鼠李苷提取实施例2
取翼核果药材粗粉5.0kg，用6倍量(w/w)70％乙醇加热回流提取4次，每次1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浸膏；浸膏加4倍量(w/w)水使混悬，先用4倍量(v/v)石油醚(60℃～90℃)萃取5次，石油醚(60～90℃)层弃去，再用4倍量(v/v)乙酸乙酯萃取5次。
取乙酸乙酯部位浸膏，过正相硅胶层析柱(w浸膏∶w硅胶＝1∶40)，依次用乙酸乙酯-甲醇(100∶0→95∶5→90∶10→80∶20→70∶30)梯度洗脱(每个溶剂梯度用量为硅胶柱体积的6倍)，采用薄层色谱检测，合并可检测到欧鼠李苷(frangulin-a)的组分。
将合并组分过反相硅胶层析柱，(w样品∶w反相硅胶＝1∶50)，用50％甲醇/水为洗脱剂洗脱(洗脱剂用量为反相硅胶柱体积的25倍)，分段收集洗脱液，采用高效液相色谱检测，合并欧鼠李苷(frangulin-a)纯度≥98％的组分，得到欧鼠李苷(frangulin-a)0.52g。
欧鼠李苷提取实施例3
取翼核果药材粗粉10.0kg，用10倍量(w/w)95％乙醇加热回流提取4次，每次2.0h，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浸膏；浸膏加3倍量(w/w)水使混悬，先用3倍量(v/v)石油醚(60℃～90℃)萃取4次，石油醚(60～90℃)层弃去，再用3倍量(v/v)乙酸乙酯萃取4次。
取乙酸乙酯部位浸膏，过正相硅胶层析柱(w浸膏∶w硅胶＝1∶30)，依次用乙酸乙酯-甲醇(100∶0→95∶5→90∶10→80∶20→70∶30)梯度洗脱(每个溶剂梯度用量为硅胶柱体积的8倍)，采用薄层色谱检测，合并可检测到欧鼠李苷(frangulin-a)的组分。
将合并组分过反相硅胶层析柱，(w样品∶w反相硅胶＝1∶40)，用甲醇-水(60∶40)为洗脱剂洗脱(洗脱剂用量为反相硅胶柱体积的25倍)，分段收集洗脱液，采用高效液相色谱检测，合并欧鼠李苷(frangulin-a)纯度≥98％的组分，得到欧鼠李苷(frangulin-a)1.2g。
欧鼠李苷应用实施例(欧鼠李苷对大鼠肝细胞酒精性氧化损伤的保护作用)
1.材料与仪器
(1)欧鼠李苷为欧鼠李苷提取实施例3所得。
(2)无水乙醇等均为分析纯。
(3)cck8，ast，alt，ldh，6sh检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
(4)联苯双酯滴丸(万邦德制药)。
(5)clone9大鼠肝细胞由广西中医药研究院药理所提供。
(6)旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、shz-d(iii)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)、zf-2型三用紫外仪(上海安亭电子仪器厂)。
2.实验方法
(1)乙醇及欧鼠李苷的剂量筛选
(a)乙醇剂量的筛选
于96孔板贴壁培养24h的肝细胞中，分别加入0、50、100、200、400、600及800mmol·l-1的无水乙醇，每个孔设置6个平行复孔，于37℃、5％co2培养6h，吸取上清液，用无血清培养基cck8原液稀释10倍，每孔加60μl，继续培养1h后，酶标仪450nm下测定吸光度。
(b)欧鼠李苷剂量的筛选
于96孔板贴壁培养24h的肝细胞中，分别加入0、25、50、100mg·l-1的欧鼠李苷，每个孔设置6个平行复孔，于37℃、5％co2培养6h，吸取上清液，用无血清培养基cck8原液稀释10倍，每孔加60μl，继续培养1h后，酶标仪450nm下测定吸光度。
(2)肝损伤模型的建立
于6孔板或96孔板中贴壁培养24h的大鼠肝细胞中，加入终浓度分别为50mg·l-1的欧鼠李苷，5％co2孵育6h后，加入终浓度为400mmol·l-1的无水乙醇，与欧鼠李苷共同作用12h后，同时设置正常对照组，酒精模型组和阳性对照(联苯双酯滴丸)组。作用完成后，对细胞和上清液进行相应处理，6孔板设置3个复孔，96孔板设置6个复孔。
(3)对细胞活力的影响
采用cck8法检测各组肝细胞活力。采用酶法检测上清液中谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)和乳酸脱氢酶(ldh)水平。
(4)对氧化损伤的影响
采用酶标法测定还原性谷胱甘肽(gsh)水平。
3.结果与讨论
结果显示，欧鼠李苷干预组alt和ast水平较酒精模型组下降了37.39％和25.41％，ldh的释放较模型组下降了39.00％，与酒精模型组相比gsh水平升高了48.74％，经统计学处理，差异均具有显著性(p(0.05)，见表1。
表1欧鼠李苷对大鼠肝细胞酒精损伤ast、alt、ldh漏出及gsh水平的影响
#p＜0.05与正常组比较；*p＜0.05与模型组比较。