一种用于头状葡萄球菌检测的试剂盒的制作方法

本发明属于致病菌检测领域，涉及一种用于头状葡萄球菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向头状葡萄球菌rpob基因的向导rna、rpa扩增引物对、水化twistampbasickit反应干燥球、lbcas12a蛋白、单链dna探针(ssdna)、ribonucleaseinhibitor和缓冲液。利用此试剂盒可以进行头状葡萄球菌快速检测。

背景技术：

头状葡萄球菌是人体感染的革兰阳性菌中常见菌群，给患者及社会带来巨大负担。传统的检测方法是进行细菌培养或pcr联合测序，但细菌培养需要5-7天的时间，而pcr常由于缺乏特异性引物，无法将头状葡萄球菌与其他葡萄球菌区分，故而需要联合一代测序才能鉴定，成本高，需要数天时间才能出结果。在这期间临床医师由于没有获得检测结果，只能凭经验用药，常常导致疾病治疗的延误。因而，如何快速检测头状葡萄球菌显得尤为重要。近期，张峰等人发现，lbcas12a蛋白可用于致病菌的检测，只需要1小时左右即可完成检测，省时省力，灵敏度高。具体的原理为，该系统包含lbcas12a蛋白、致病菌dna、向导rna、两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链dna(ssdna)。其中，致病菌dna序列需要包含tttn的pam结构，同时该序列需要具备特异性，即区别于别的致病菌。而向导rna序列为致病菌特异性靶向序列中tttn后的一段序列，长度为20-24个碱基。在向导rna引导下，lbcas12a蛋白可结合到致病菌特异性dna序列上，随后，lbcas12a蛋白可表现出dnase活性，从而切割两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链dna，使得荧光基团和淬灭基团分离，出现荧光，从而指示致病菌的存在。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于头状葡萄球菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向头状葡萄球菌rpob基因的向导rna、rpa扩增引物对、水化twistampbasickit反应干燥球、lbcas12a蛋白、单链dna探针(ssdna)、ribonucleaseinhibitor和缓冲液。其中特异性靶向头状葡萄球菌rpob基因的向导rna，其核苷酸序列如seqno.1所示，能特异性靶向头状葡萄球菌，而不能靶向金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌，可用于头状葡萄球菌的检测。rpa扩增引物对rpa-f和rpa-r，序列如seqno.2和seqno.3所示。单链dna探针的序列如seqno.6所示。

本发明的另一个目的是提供基于上述试剂盒进行头状葡萄球菌快速检测的方法，通过以下步骤实现：

具体步骤为：取1ml样品，95-98摄氏度加热5min，取1μl作为检测样品，加入14.75μl水化twistampbasickit反应干燥球(twistdx公司)，0.9μl10mmrpa-f(序列为seqno.2)和rpa-r(序列为seqno.3)，0.375μlribonucleaseinhibitor(takara公司)，3.5μlbuffer2.1(neb公司)，1000nm向导rna(序列为seqno.1)，250nmcas12a(neb公司)，200nm单链dna探针(上海生工，序列为seqno.6)，加水补至25μl。37摄氏度反应25-45min，通过荧光显微镜下直接观察检测体系荧光变化，进行头状葡萄球菌检测；发黄绿色荧光说明有头状葡萄球菌污染，不发光说明没有头状葡萄球菌污染。本方法可以将头状葡萄球菌与其他葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌区分开来。

其中：

所述单链dna探针ssdna序列(seqno.6)为：5’6-fam-ttatt-3’bhq1，由上海生工合成。

使用本发明所述检测试剂盒进行头状葡萄球菌感染检测的优势在于：

(1)与传统细菌培养或pcr联合一代测序法比较，传统方法需要数天时间，本方法只需要1小时即可完成检测。同时，本方法采用rpa法扩增，只要恒温水浴锅即可完成反应，不需要pcr仪，对设备要求低。

(2)使用本发明所述检测试剂盒进行检测时，只有头状葡萄球菌呈阳性反应，而其他种类的葡萄球菌，包括常见的金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌均呈阴性反应。故而，本发明所述检测试剂盒具有高特异性。

附图说明

图1为头状葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌rpob基因序列比对图。

图2为样品荧光显微镜下检测结果，从1号-6号管样品加入的是各葡萄球菌菌株，分别为头状葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌。其中1号管有黄绿色荧光，呈阳性反应。2-6号管无黄绿色荧光，呈阴性反应。

图3为使用pcr法扩增不同种属葡萄球菌，得到大小相似的条带，无法区分出头状葡萄球菌。

图4为使用基于本发明所述向导rna的检测法与传统pcr联合测序法，实验耗时比较图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：葡萄球菌rpob基因序列比对

如图1所示，在头状葡萄球菌rpob基因序列中，本发明所述向导rna序列(选中部分)的5’端为tttn的pam结构。该向导rna序列在金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌中没有完全一致的序列，均有数个碱基的差异。且在金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌中的同源序列5’端均无tttn的pam结构，故而，使用本向导rna，cas12a蛋白无法靶向至金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌，因而，在检测时，只有头状葡萄球菌可呈现阳性反应，其余葡萄球菌呈阴性反应。如图1所示，该序列(图中方框选中部分)的5’端是头状葡萄球菌rpob基因上tttn结构的pam序列，同时，该序列不存在于葡萄球菌属中常见的金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌中。并且，在上述其他葡萄球菌中，该序列的同源序列的5’端均不包含tttn的pam结构，因而，该序列可特异性靶向头状葡萄球菌，而不能靶向金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌，可用于头状葡萄球菌的特异性检测。

实施例2：本发明所述向导rna特异性判定，步骤如下：

(1)准备头状葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌标准菌株；

(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；

(3)准备反应体系，反应体系为25μl，包括1μl检测样品，14.75μl水化twistampbasickit反应干燥球(twistdx公司)，0.9μl10mmrpa-f(序列为seqno.2)和rpa-r(序列为seqno.3)，0.375μlribonucleaseinhibitor(takara公司)，3.5μlbuffer2.1(neb公司)，1000nm向导rna(序列为seqno.1)，250nmcas12a(neb公司)，200nm单链dna探针(上海生工)，加水补至25μl；

(4)37摄氏度恒温反应30min；

(5)反应结束后，将pcr管置于荧光显微镜下直接观察，有荧光证明样品中存在头状葡萄球菌，没有荧光则表示无头状葡萄球菌污染。

检测结果如图2所示，样本1为头状葡萄球菌，观察到荧光，呈阳性反应。其余样本非头状葡萄球菌，无荧光，呈阴性反应。

实施例3:基于本发明所述向导rna的检测法与传统pcr法特异性及实验耗时比较

1.基于本发明所述向导rna的检测法，步骤如下：

(1)准备头状葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌标准菌株；

(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；

(3)准备反应体系，反应体系为25μl，包括1μl检测样品，14.75μl水化twistampbasickit反应干燥球(twistdx公司)，0.9μl10mmrpa-f(序列为seqno.2)和rpa-r(序列为seqno.3)，0.375μlribonucleaseinhibitor(takara公司)，3.5μlbuffer2.1(neb公司)，1000nm向导rna(序列为seqno.1)，250nmcas12a(neb公司)，200nm单链dna探针(上海生工)，加水补至25μl；

(4)37摄氏度恒温反应30min；

(5)反应结束后，将pcr管置于荧光显微镜下直接观察，有荧光证明样品中存在头状葡萄球菌，没有荧光则表示无头状葡萄球菌污染；

(6)检测结果如图2所示，样本1为头状葡萄球菌，观察到荧光，呈阳性反应。其余样本非头状葡萄球菌，无荧光，呈阴性反应。

2.传统pcr法实验步骤如下：

(1)设计引物，pcr引物序列为rpa引物5’端起始的20个碱基，使获得的pcr产物与rpa产物序列相同，引物对序列见seqno.4和seqno.5；

(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；

(3)配置反应体系，包含12.5μldna聚合酶预混液(上海生工)，1μl正向引物，1μl反向引物，1μl待测样品，9.5μl水；

(4)pcr反应；

(5)琼脂糖凝胶电泳；

(6)实验结果如图3所示，所有的样本均扩增出188bp大小片段，无法区别头状葡萄球菌与其他种类葡萄球菌。

如上所述，pcr法无法区分葡萄球菌种类，故需要进行测序比对，实验成本高，用时长，可能延误病情。

如图4所示，使用基于本发明所述检测试剂盒的检测方法特异性高，耗时短，仅为1小时左右，而使用pcr法，由于不同种葡萄球菌序列高度同源，在一段序列中差异常常仅为数个碱基，设计的引物常常所有菌株都能扩增，所得产物大小接近，无法通过琼脂糖凝胶区分，故而需要进行测序，实验耗时在2天左右。本发明所述方法耗时显著低于pcr组。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种用于头状葡萄球菌检测的试剂盒

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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<211>24

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