一种生长相关的分子标记在凡纳滨对虾遗传育种中的应用的制作方法

本发明属于水产动物育种领域，具体涉及凡纳滨对虾lvmmd2基因上一个与体重相关的分子标记及其在体重性状育种中的应用。

背景技术：

凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)，又称南美白对虾(whitepacificshrimp)，是世界最重要的水产养殖品种之一，占据了世界对虾总产量的76％，其养殖区域遍布世界各地。凡纳滨对虾同样也是我国对虾养殖的主导品种，该品种1988年从美国引进我国，自1999年开始在我国大规模养殖，至2013年年产量可达140万吨左右，占我国对虾养殖总产量的80％以上。

随着养殖规模的不断扩大，养殖产业对凡纳滨对虾优良种质的需求日益迫切。在进行对虾优良种质培育时，生长性状既是重要的衡量指标，同时也是最直接的育种目标。然而长期以来，对虾的遗传改良主要依赖于人工选择和基于数量遗传学的传统选育方法，传统遗传选育也存在选育周期长和选择准确性低等问题，难以满足加快遗传改良进展的现实要求。相较于传统遗传选育，分子标记辅助选育具有选育间隔短、准确性和可靠性高等特点，可以明显加快重要经济性状的遗传选育进展。的。

分子标记辅助选育是将分子标记应用于动植物相关性状遗传改良过程中进行辅助选择的一种技术手段，其实质是利用与目的基因紧密连锁的分子标记对个体进行目标区域及全基因组筛选，获得期望的个体，从而提高选育效率和准确率。前期，在对虾中，研究人员通过qtl定位方法定位到了一些与生长相关的qtl位点，如在凡纳滨对虾qtl定位中，也发现了生长相关的qtl位点(andriantahinaf,liux,huangh.geneticmapconstructionandquantitativetraitlocus(qtl)detectionofgrowth-relatedtraitsinlitopenaeusvannameiforselectivebreedingapplications.plosone,2013,8:e75206)，但是受制于较低的标记密度，并没有定位到与生长直接相关的基因或标记。本发明旨在提供一种与生长性状显著相关的标记，该标记可以用作凡纳滨对虾生长性状的辅助选育。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与凡纳滨对虾生长相关的分子标记，并应用于对虾生长快品种的分子标记辅助选育。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种位于凡纳滨对虾lvmmd2基因上的与生长相关的分子标记及其在生长性状遗传育种中的应用，其特征在于，(1)提取对虾留种亲本的dna；(2)使用如下引物lvmmdf：acaatcgcttcaaccaacctg和lvmmdr：tcctgggcgtgatcttcttt扩增亲本材料dna；(3)

使用lvmmdf引物对扩增的片段进行测序，获得seqidlvmmd2所示的序列，并分析其132bp位置的snp位点(lvmmd2-132-c/t)的基因型,若测序峰图中lvmmd2-132-c/t位点仅有c峰，则该个体基因型为cc，若为c和t双峰，则该个体基因型为ct，若仅有t峰，则该个体基因型为tt。(4)根据分型结果设计交配策略，制备具有生长优势的tt基因型个体，辅助生长性状的遗传选育。进一步地，与对虾生长相关的分子标记的应用，tt基因型个体生长速度最快，其次是ct型，而tt型个体的生长速度最慢。

在对虾繁育过程中，通过snp分型方法将该标记分型后，选择tt型个体进行繁育能够辅助生长，从而提高对虾产量。

本发明的优点如下：本方法提供的生长相关的分子标记能够从分子水平上对生长快个体进行选择，不受外界环境及个体大小的限制，且能够在早期进行选择，提高选择的效率和准确率，并能降低养殖成本，缩短养殖周期。

附图说明

图1lvmmd2-132-c/t位点三种基因型在混养群体中平均体重分布图。

具体实施方式

实施例1：lvmmd2-132-c/t标记的获得

(1)凡纳滨对虾生长性状的全基因组关联分析(gwas)：

用于gwas分析的材料为一个由13个全同胞家系组成的混合群体。2015年7月，在海南广泰海洋育种公司(文昌，海南)通过定向交尾方式总计构建13个全同胞家系。每个家系孵化出幼体后分别转移至5m²的水池进行单独培育。期间，为减少养殖环境对不同家系的影响，尽量采用标准化的养殖方式对各家系进行培育，使盐度、温度、幼体密度、饵料和充气等条件尽量保持一致。2015年9月，从13个家系中各随机挑取50尾对虾混合后转移至10m²的水池在同一环境下进行培养，组成混合群体。2015年11月中旬，随机抽取200尾虾，使用电子天平测量其体重，并进行性别的判定。

使用植物基因组提取试剂盒(天根，北京)提取所有材料的dna，之后采用2b-rad的方法对所有个体分别进行全基因组snp分型(wangs,meyere,mckayjk,matzmv,2b-rad:asimpleandflexiblemethodforgenome-widegenotyping,naturemethods,2012,9,808–810)，利用获得的snp分型数据，使用genabel软件进行对虾体重的gwas分析，定位生长相关snp标记(aulchenkoy.s.,ripkes.,isaacsa.,vanduijnc.m.genabel:anrpackageforgenome-wideassociationanalysis.bioinformatics.23:1294-6(2007).)。

(2)lvmmd2作为生长相关候选基因的关联分析

通过gwas分析获得一批与体重显著相关(p<0.01)的标记。通过对这些标记进行基因注释，发现位于其中一个snp位于monocytetomacrophagedifferentiationfactor2(lvmmd2)基因的内含子区域。以该基因(lvmmd2)作为生长相关候选基因，在该基因编码区进行snp详查，并对编码区的非同义突变snp进行候选位点的关联分析。分析结果显示seqidlvmmd2序列的132bp位置的snp位点与对虾体重呈极显著相关(p＝2.42×10^-8)，该位点对体重表型变异的解释率可达10.5％，该标记的tt基因型为优势基因型。

序列表中seqidlvmmd2

acaatcgcttcaaccaacctgcactgggagcatacccatcctacaagctagagcactcaggcaaagatgcatcacatgtctcaggtgccctgccttcaactccccccactatccccacagctgagggggtg[c/t]tctcagatgctgaaggaagaatcaggtaggtgaggacagcatagtaatggataaaggctgccaggaccacaaagagatgccatatggcatgtgccagaggaatgcggccatccagcttaaagaagatcacgcccagga

实施例2：lvmmd2-132-c/t标记在育种中的应用。

(1)候选父母本lvmmd2-132-c/t位点的分型

2016年6月，以海南广泰海洋育种公司(文昌，海南)的60尾亲虾作为候选父母本，取每尾对虾的一对游泳足提取dna后，利用如下引物对扩增每个个体的目标区域序列：

lvmmdf：acaatcgcttcaaccaacctg

lvmmdr：tcctgggcgtgatcttcttt

pcr扩增产物使用abi3730xl测序仪进行一代测序，测序引物为lvmmdf引物，根据测序峰图对lvmmd2-132-c/t进行分型，如果该位置仅有1个c碱基峰，则分型结果为cc型，若仅有一个t碱基峰，则分型结果为tt型，如果该位置既有c碱基峰又有t碱基峰，则分型结果为ct型。

(2)家系材料制备

根据上述分型结果，分别选取cc型个体和tt型个体作为亲本制备cc和tt型纯合型家系。此外，以cc型和tt型个体作为父母本进行定向交配制备ct型家系。每个家系孵化出幼体后分别转移至5m²的水池进行单独培育，待家系材料生长至1cm时，每个家系随机挑取50尾凡纳滨对虾进行放入10m²水池混养。养殖4个月后从混养群体中随机挑选200个体进行体重测定。

(3)lvmmd2-132-c/t标记辅助选择

对上述个体在lvmmd2-132-c/t位点进行基因分型。在上述材料中，检测到为cc型、ct型和tt型三种基因型个体，其对应的平均体重分别为8.77±3.22g、9.52±3.21g和12.48±2.37g(图1)。因此通过对lvmmd2-132-c/t标记中的tt基因型进行选择，可以提高育种群体的生长速度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种生长相关的分子标记在凡纳滨对虾遗传育种中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>270

<212>dna/rna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

acaatcgcttcaaccaacctgcactgggagcatacccatcctacaagctagagcactcag60

gcaaagatgcatcacatgtctcaggtgccctgccttcaactccccccactatccccacag120

ctgagggggtgytctcagatgctgaaggaagaatcaggtaggtgaggacagcatagtaat180

ggataaaggctgccaggaccacaaagagatgccatatggcatgtgccagaggaatgcggc240

catccagcttaaagaagatcacgcccagga270