探针组合及其含有探针组合的试剂盒在检测TTN单基因突变情况的应用的制作方法

本发明属于基因检测
技术领域：
，具体涉及探针组合及其含有探针组合的试剂盒在检测ttn单基因突变情况的应用。
背景技术：
：以pd-1抗体为代表的免疫治疗方案是最近几年发展起来的一种肿瘤创新性疗法，这种治疗方案是通过解除肿瘤细胞和免疫细胞的特异性结合从而重新激活人体自身免疫能力达到自体杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤微环境会诱导浸润的t细胞高表达pd-1分子，肿瘤细胞会高表达pd-1的配体pd-l1和pd-l2，产生特异性结合，导致肿瘤微环境中pd-1通路持续激活，t细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞，pd-1抗体能够阻断这一通路，也就是解除了肿瘤细胞和t细胞的特异性结合，激发和恢复了t细胞的部分功能，杀伤肿瘤细胞。目前也已经陆陆续续有一些pd-1抗体获得fda和cfda的审批上市。虽然pd-1抗体的问世给过往一些没有特定药物治疗的癌症带来了希望，但是从现有的治疗效果来看，pd-1抗体用在中国患者身上的完全缓解率（crr）不到20%并且常常出现一些严重的不良反应，因此通过获得生物标记物（biomarker）对肿瘤患者做分层治疗就变得非常必要，现有公认的生物标记物包括pd-l1表达水平和肿瘤突变负荷（tmb），同时通过第二代测序技术检测肿瘤突变负荷是比较行之有效的分子检测方案，其对于pd-1抗体治疗效果的预测准确率可以达到60%以上。检测肿瘤突变负荷的方法一般是通过二代测序的方法检测基因的突变，通过过滤、筛选和计算得到最终的肿瘤突变负荷（tmb）数值。人类有2万多个基因，31.6亿个碱基对，要研究哪些基因哪些位点与人类肿瘤有密切相关性，是一件很复杂，任务庞大的事情，国内基因检测公司针对不同的肿瘤与检测目的，有不同的基因panel的选取，如果基因panel选取不当，基因位点或者区域选取不当，就会错失重要位点的信息。现有的方案中主要包括：1、捕获全部基因的cds区域并且测序（即全外显子组测序wes）；2、捕获至少200个以上基因并且测序（即特定基因捕获测序）；市面上常见的计算tmb的panel产品包括罗氏公司收购的foundationmedicine公司的foundationonecdx产品，总共捕获并快速鉴定324个基因中的变异；纪念斯隆凯特琳癌症中心（简称msk）的mskimpact产品，可快速鉴定341个基因中的变异以及基因组其他分子变化情况。上述这些测定肿瘤突变负荷的方案和panel产品，无论是全外显子组测序（wes）方案还是特定基因捕获测序如foundationonecdx产品以及mskimpact产品等大panel产品都需要捕获测定很多的基因，检测位点全面，涵盖较多的靶向化疗药物，但从检测结果上来看，有一部分基因在医学上的作用尚未明确，和实际用药检测并不相关，很大一部分推荐的药物较难获取，而且测序需要的dna起始量也比较高，需要的时间周期也比较长，往往会造成检测成本的浪费。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种探针组合，及含有该探针组合的试剂盒用于检测ttn单基因的突变情况，通过dna测序方法和生物信息学分析方法测定分析试剂中ttn单基因的突变有无以及突变数目，根据ttn单基因的突变判断肿瘤患者是否适用于pd-1抗体治疗，将能够检测ttn单基因突变情况的试剂盒用于检测肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效，能够同时解决市场上基因检测中小基因组合检测不准确和大基因组合检测成本浪费，时间周期长的缺点。为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：一种检测ttn单基因突变情况的探针组合，所述探针的序列如seqidno.1~seqidno.1349所示。进一步的，检测ttn单基因突变情况的探针组合在制备用于检测肿瘤患者是否适用于pd-1抗体治疗的试剂盒中的用途。一种检测ttn单基因突变情况的试剂盒，包含检测ttn单基因突变情况的探针组合，所述探针的序列如seqidno.1~seqidno.1349所示。进一步的，所述试剂盒用于肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效预测评估。进一步的，所述肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效预测评估包括：（1）分别提取肿瘤样本和对照样本的dna分别于检测ttn单基因突变情况的试剂盒中，利用包含编号为seqidno.1~seqidno.1349所示探针序列捕获肿瘤样本和对照样本中的ttn单基因的cds区域，进行对照实验；（2）通过dna测序方法分别测定实验组试剂盒和对照组试剂盒中ttn单基因的突变情况和数目，通过生物信息学分析方法分析ttn单基因突变情况，ttn单基因发生突变，表明肿瘤患者适用于pd-1抗体治疗的概率高，ttn单基因未发生突变，表明患者不适用于pd-1抗体治疗的概率高；ttn单基因突变数目越多，则表明患者对于pd-1抗体治疗的响应可能性就越高。进一步的，通过检测ttn单基因的突变频率和突变覆盖深度判断ttn单基因发生是否发生突变；突变频率大于0.05，突变覆盖深度大于4，表明ttn单基因发生突变。进一步的，所述试剂盒用于非小细胞肺癌、食管癌、胃癌或黑色素瘤的pd-1抗体治疗疗效预测评估。本发明具有如下有益效果：本发明中通过设计探针组合，并利用该探针组合制得检测ttn单基因的突变情况的试剂盒以及检测肿瘤患者是否适用于pd-1抗体治疗的试剂盒，利用ttn单基因的突变情况对肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效进行预测评估，通过dna测序方法和生物信息学分析方法测定分析ttn单基因的突变有无以及突变数目来判定肿瘤患者是否适用于pd-1抗体治疗；由于本发明设计的探针组合仅针对于ttn单基因，成本较低，是市面上现有基因检测公司构建多基因组合检测方案成本的十分之一以下，具有非常高的临床应用价值；其次，该探针组合只需要捕获富集ttn单基因，需要的肿瘤样本dna和对照样本dna起始量比较低，在本发明中dna起始量只需要50ng以下就可以实现测序判定，而常规的wes测序中dna起始量需要500ng以上；最后，由于本发明中只需要通过ttn单基因进行检测，因此在illumina公司的小型测序仪上即可完成，时间周期短，需要的生物信息学分析方法比较简单，将测序分析时间缩短至30分钟以内，而常规的wes测序或者多基因组合测序需要至少6个小时以上才能完成。附图说明附图1为本发明ttn单基因突变数目和wes数据样本中肿瘤突变负荷对照关系图；附图2为本发明ttn单基因突变数目在pd-1抗体响应人群中和不响应人群中的差别关系图；附图3为本发明中肿瘤患者ttn单基因突变数目分类及每一类别的客观缓解率。具体实施方式下面结合具体实施例来对本发明进行详细的说明。本发明中所采用的pd-1抗体包括纳武利尤单抗（nivolumab，商品名opdivo）和派姆单抗（pembrolizumab，商品名keytruda）。一种检测ttn单基因突变情况的探针组合，所述探针的序列如seqidno.1~seqidno.1349所示，序列的长度为120bp，具体序列如下表1所示。进一步的，检测ttn单基因突变情况的探针组合在制备用于检测肿瘤患者是否适用于pd-1抗体治疗的试剂盒中的用途。一种检测ttn单基因突变情况的试剂盒，包含检测ttn单基因突变情况的探针组合，所述探针的序列如seqidno.1~seqidno.1349所示。进一步的，所述试剂盒用于肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效预测评估。进一步的，所述肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效预测评估包括：（1）分别提取肿瘤样本和对照样本的dna，利用包含编号为seqidno.1~seqidno.1349所示探针序列形成的试剂盒捕获肿瘤样本和对照样本中的ttn单基因的全部cds区域，进行标准的dna建库和测序实验，第二代测序实验采用illumina公司的nextseq500测序仪进行测序；（2）通过dna测序方法分别测定实验组试剂盒和对照组试剂盒中ttn单基因的突变情况和数目，通过生物信息学分析方法分析ttn单基因突变情况，ttn单基因发生突变，表明患者肿瘤适用于pd-1抗体治疗的概率高，ttn单基因未发生突变，表明患者不适用于pd-1抗体治疗的概率高；ttn单基因突变数目越多，则表明患者对于pd-1抗体治疗的响应可能性就越高。其中，dna测序方法包括dna建库和上机测序；所述dna测序方法选择二代测序也称为高通量测序技术，通过捕捉新合成的末端的标记来确定dna的序列，关于二代测序仪可选择使用illumina小型测序仪，二代测序方法采用边合成边测序的方法，基于专有的可逆终止化学反应原理，测序时将基因组dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即flowcell），这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在flowcell上形成了数以亿计cluster，每个cluster是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的sbs（边合成边测序技术）对待测的模板dna进行测序。进一步的，通过检测ttn单基因的突变频率和突变覆盖深度判断ttn单基因发生是否发生突变；肿瘤样本中的突变频率大于0.05，突变覆盖深度大于4，而相应的对照样本中突变频率小于0.01，突变覆盖深度小于4，则表明ttn单基因发生突变。进一步的，所述试剂盒用于非小细胞肺癌、食管癌、胃癌或黑色素瘤的pd-1抗体治疗疗效预测评估。为了说明利用本发明含有如表1所示的seqidno.1~seqidno.1349序列的探针的试剂盒在检测ttn单基因突变情况以及肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效预测评估中应用的可行性，使用本发明检测230例肿瘤患者的ttn突变的同时，也检测了同样的230例肿瘤患者的全外显子组（wes）数据，从wes的数据可以计算肿瘤突变负荷（tmb）。其中，具有ttn单基因突变样本的肿瘤突变负荷（tmb）中位值为8.15显著高于不具有ttn单基因突变的样本的肿瘤突变负荷（tmb）中位值1.76（如附图1所示），说明通过本发明测序得到的肿瘤突变负荷和利用全外显子组测序（wes）得到的肿瘤突变负荷具有高度的一致性。由于肿瘤患者的肿瘤突变负荷和pd-1抗体免疫治疗的响应程度是正相关关系，即肿瘤突变负荷越高，患者对pd-1抗体的响应程度越高，pd-1抗体的治疗效果越好，肿瘤突变负荷越低，患者对pd-1抗体的响应程度越低，pd-1抗体的治疗效果越差，因此，从图1中可以看出，检测的230例肿瘤样本的测序结果中可以得出肿瘤患者ttn单基因未发生突变（ttn野生型），其肿瘤突变负荷低，患者对pd-1抗体的治疗效果越差；肿瘤患者ttn单基因发生突变（ttn突变型），其肿瘤突变负荷高，患者对pd-1抗体的治疗效果越好。参见附图2和表2，为了说明利用本发明含有如表1所示的seqidno.1~seqidno.1349序列的探针的试剂盒在检测ttn单基因突变情况对于肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效预测评估中应用的准确性，使用本发明的试剂盒和检测方法检测了94例使用pd-1抗体治疗的非小细胞肺癌、黑色素瘤、胃癌和食管癌肿瘤患者的样本，其中对于pd-1抗体治疗响应的患者样本有20例，对于pd-1抗体治疗不响应的患者样本有74例（如表2），从表2中记录的ttn单基因突变数目计算可得对于pd-1抗体治疗不响应的患者样本的ttn单基因突变数目的平均值为0.47，中位值为0，对于pd-1抗体治疗响应的患者样本的ttn单基因突变数目的平均值为2.5，中位值为3，对于pd-1抗体治疗响应的患者样本的ttn单基因突变数目的平均值和中位值明显高于对于pd-1抗体治疗不响应的患者样本的ttn单基因突变数目的平均值和中位值（p<0.01），综上所述，根据附图2和表2可以说明利用本发明测定的肿瘤患者样本的ttn单基因突变情况（平均值和中位值）可以判断非小细胞肺癌、黑色素瘤、胃癌和食管癌肿瘤患者对于pd-1抗体的响应情况和是否适用pd-1抗体治疗。参见附图3和表2，同时为了说明本发明中含有如表1所述的seqidno.1~seqidno.1349序列的探针的试剂盒在检测ttn单基因突变数目对于肿瘤患者pd-1抗体治疗疗效预测评估中应用的准确性，将表2中94例肿瘤患者样本按照的ttn单基因的突变数目进行分类：①ttn单基因没有突变；②ttn单基因突变数目等于1；③ttn单基因突变数目大于等于2；④ttn单基因突变数目大于等于3，同时分析每一类别的客观缓解率（orr）（结果如附图3所示），从附图3中可以看出ttn突变的数目越多，客观缓解率越高，再次表明通过本发明测定的ttn单基因的突变数目就可以推断所述适应症肿瘤患者对pd-1抗体治疗的响应情况和有效情况，肿瘤患者肿瘤组织中ttn单基因突变数目越多，客观缓解率越高，患者对于pd-1抗体治疗的有效率就越高，肿瘤患者肿瘤组织中ttn单基因突变数目越少，客观缓解率越低，患者对于pd-1抗体治疗的有效率就越低。表1为探针的序列表编号seqidno.1tcttaaatggatcgaatatgtatattcacagtggcagagtcagatccaaattcattccctaaactcagggtataaagtccaccatcttgtttctgtacgtseqidno.2ccatgatgatcagggttgtcaggtcatctgtgttttcaatgtggaacctcccctgttcttgactgtggatttttcttccaccacaggaccatgttacttcseqidno.3tggggtaggctcacccgtgaaagcacaggctactgttagaactttgccttcatcaatgctgatatcagatggaagagcttcaattttaggcggaattcctseqidno.4tcttatgcctgctttaagcattttactagttgagctttccagttgtgtcatattagatattcccataaagctgctggaactcatttctacaaaggactctseqidno.5tgcatggaggacatgctttgggcagacatgcttgcaaatttcatctcagtcatgctgctagcactgctgctgctgaaactgctgaaggaggcctcctgctseqidno.6tggaggcagacatttggactgactgagacgagaagcttccttgcaagcttgtgtcaccacttgttctcaatactacctctctggaaggttcttcaactagseqidno.7aagaagggtgaggagatacttacgaaggaccattaaggaagctgtagctgaacactggccacggaaatttttggccttaattgtgtactttccactgtcgseqidno.8ctgactgatgcatttcggatttcaagggagtatacatttctggagcggcttatgctgacatttgaagaaatagaaatctaagacaaaggaaaaagaaaagseqidno.9ttactggcaggttgtttttaaaccattcgatttcaggggatggctcgccactgatttcacaagtaaagagaacattttgtccttcattaatattttgagaseqidno.10tctaggctgtgagatgaaggctggagcatctgagagttctttgctcagtgtcaaatcatactgacacttgacgattccttccttggttttgcttatgcagseqidno.11gtgaggattccttcatctctgtgactggcttgcttgatggttagggtctgatcgctgcctgagacaccatatcggtactcctcagagttggtaagctctaseqidno.12cgccattcagtacccatttcacatcagtggcaccagcaatgttggcttttaaaaccagtctttgaccttcgtttatgctcatctgagtagaaaatgctttseqidno.13aatctcagcatgagttctgacttcttctgatgcctgtgatgttttagtgatttcctcatggacaatggatttttccagggaggttgctgctgatttcttgseqidno.14acttcttcagaaatcagaacctttgaagcttcctctttgagggctaacttttcttgagattttgcctctgacatcttaatttcttcagaccttagggcttseqidno.15tttgggaaatttcctcttggacaacagctttcttctgaggtgtaatttcagaagtcttttgtgtagagactttctgtgcctcagtatcttttatagctaaseqidno.16taaaaacaaaagccaacctaccttttattgttaatttgcagctagaggacacagatccagctgaattttttactgtacaagtataaagtccactgtcagaseqidno.17agtatcagtcttatgaatttctaagaagaaccctcccttgtcttcagagagtttatatttacctccttgtgtaatggcctgtagaatgcaaatgatttgtseqidno.18catcttttgtccagatggcagttggccggggttctccagtagccttaactgcaaatttagcaacactgtctgaagaaacagttgtatcctgcaacccagtseqidno.19aacaattactggttttgaggaaattggttcaggagcttttggttcagtttttctggttactgttgactcagtggttttctgatctgatttcttagtttctseqidno.20gatatttttgataccttctcatggatactcttaaaggcttgccccataaattgtaagttggttttagacgttccaccttcaccagaaatctcacaaacatseqidno.21attctccttgatcagattcagtgaggttattgattttgagctcataggtaccatctgctgaataatgaaactggaaatgcccattttccttcagtttcttseqidno.22gccatctttataccaggtgacctcttttgcccttaatacactgctttcaaccacacaggtcagttttgcaatctctttagaagcttctgctttcaggaacseqidno.23tgagtaatctttggtggggcagagactgggaggtgctgaactttctctgttggtgttggttttgtctctgtgggtgatacggctttcgggtgagaaggttseqidno.24ctggagatttcactcgttttggagacttaactgcttctggggatttcacccgaggctctggggatttgactcttggtggtgatgtcacagccttttcagtseqidno.25taccctggccttttgaatagtcagagtgaactctgcttcttgtttcccttcactgttttctaccaccacgctgtaattgccctcatcggaagcctggactseqidno.26gaagagatctcaaaggttgatttgtactttgtggtggtcacttggtggcgggcagaagtacttagcacttgtcctttacgcagccaggtcacagttggtaseqidno.27ccggctcaccatcggtgtcacaagaaaaccttgcagactcgccctcgtagacggtcatggaccgtggctttgttagaattcttgctgccaaagtcgtcttseqidno.28gatctttctggttgtggatttttcttccagtgacttttcttctaatgcagcacttttcatttctgcagatgcagagtgttcatatgaggagagactttccseqidno.29cttgtctccgtcatctgtgatttcacttccctgacagaagacgaagcttccatctcagatgttttcttaaatgatgaaacagcatacgcctctgttcttgseqidno.30tcagctcagggaaaacagatctggggacctcttcatctctgcgttgggaagcataggtggtataatcccctcctgtcacgtccaacgttgcatagtcagaseqidno.31agcttcgcccttgtagttggtgcacacagcacggtaggttccactgtcatcagtatgacagtccagaatttccagggtgaggactccactcgtgttggtgseqidno.32taatgaatcttactgctttcttggagttccacaccattgtggtaccatttaacctcggcagttggcttagactgaacatttaaaataaaacgtgtattttseqidno.33ggccacatggtaccctgtgcgagcgcattctcagtgtgattcgaggggcatggtccagtgtgaaaggctgctgactcaaaacttcatacttcctttctgaseqidno.34tgtcttctgagtttttaaagcagctttcatggactcatacctggaaaagatatcaaatcttgcagacctctcaaatctcgagagtgatctctcactagacseqidno.35acagggctgggggatcgtgggcgagttctctctggagtaggtgaccttctttctgtgtcatcttcgtattcctcagccggttgtggacgtgaccggatcaseqidno.36gctcagacactggcctcattaactcaatataagttggagacagggagcgccgtcgtctcagtagtctagacgcagatgaggatgattctctttgagcatgseqidno.37ttttgagatttcgtattcttcctcaatttctgttatttctgtcacttctctttgtcgccttgatttctttctagacttttcctcctttgacatgaagtcaseqidno.38agttcgcttttgtattctgagagatgctgggtggtcgtaactgggcgaagcaactcttcatcctccctctcagccatgattctttgccgttgctttggctseqidno.39gtctgtacgcagcctgggcatgccgttccctcagttctgcataacttgtactagcttcagccttcgttgggatgtgataggttgaatacctgaagtctttseqidno.40tcttgtttcctccaccttgacatgagcttgtggtgaagagtaacgtaggctagaaagctcaaagtgtggagggcttcgacttgggggtgaagctgaaaaaseqidno.41cctaactcaagctcttcttcaagacgcagcctctcttcctctgttcttttcattgctaagtagtcatcaatggggaggagtaattcttcatcagagatgtseqidno.42ccccaagagaacgtcttctaggtcggtagtaaaagtcataatcaggagaaggtgtacgccggcgggctggtctcactatctcaagatcatcttgggacagseqidno.43tttaggaatacgccatttaggtctgtattgatctgtaatgcgtggaagaggcatcacatagaactgttcccatcttgaaaggcggatgcgcttgggtcgtseqidno.44ttctgtacaactctgtcaagtttcccaggcatttcatactgatcacgtatctttttataccacttcatgtcagacatgggcacgaactgcttgatgcgttseqidno.45ggtcttcttctatggtagtctgcttatacttgcgtggctctggtacatcataaggcatccggagttttctctcctccttcttttcttctatctcaagtctseqidno.46gaattccccttttacagtcttggtgcttacagccggtttataaaggacagcagcttctctcagagcctctttagctacctgtgtcagtggtacactttcaseqidno.47gttccagaaagaatttcagccattctgagggttttgtcaatttgtttttgtacgtgtcgctcatgctcctccttactcttgaattcctgtttcttgtaccseqidno.48tcaggcgttccacttgtaggtgagcctggcagctggtggacccagctgtgttagtggctgtgactctataataacccgtgtcttcaggcaaagtgtccctseqidno.49gatgtgcagagcataataatccaagccttcatggataatttcaatgttaggcccgagggacagtggctgaccatctttctcccattttaatgttggtgggseqidno.50gggatgccagacactctgatctcaaagcagacactttggccttcttggcattctgcatttgccagtaaccttttgaacatgggtcttaaggtactatctgseqidno.51ttggaggtgggtgtagggttactgtcagctttgctttacagctgtcttcaccatatttgttccttgccacaacagtatattcagcgtcatcatctgtagtseqidno.52gacactgttgattgttaattggtaaagacccttgtctgactcaaatgtgtacttcttgtcattgtcacctggtttgattttctgacctgatttataccatseqidno.53gttacatgaggctctgggtggacagttatagttactccaaaccggacattttcacctacataagctgtcttattatagagaggcagggtaaattctggtgseqidno.54gcctttccaggagtctcattgtgtctgttctgcgcttaattttcttcatggttctacggcagtaatagtcatagacttctctcacacctttaacaaatagseqidno.55ctctgcataagaactgtcttcaccatagtcattgactactttgcatctgtaggtaccatcatctaatttggtaatgtctttgacatagaggatggccactseqidno.56ccatcttcgtaggtgatttcgtatttctcactgttctccagctgtcggacgccaaagtaccaagtcacttgggtagactgatcataattttcaattttgcseqidno.57atacatatttgacatgtcctccttcttcaccaactgcatgcattatctgcccagaaactgggccaatttcaatggatgccactttaactttagcaacactseqidno.58cactcccttctgagatcgaattgcaccaccacaggagatccgggctgctgacacaaccatgttgaggtctttcttgatcagggtgtggtaataacgccggseqidno.59tgttttaatgttctgataactttagtactgactctttctatcttctgcttcaaccatgggtgctggagagcctccgatgctgtcatgcgagatttcctctseqidno.60ctttcactaacaaccggtcaacaaaatccatggcttcaatgctaatctctttgaatgcttcctcatcgaaagtatattcagcattcatgatattctcaatseqidno.61gatctgttggttagtttcagccaggaatgggttgataccactcaatagcacatataccagtgttccaagtgaccacatgtctgtggctgtgctgacaacaseqidno.62tcatgctggtggacttcaggtgcatagtattctggggcagtgaatagaagcctgaagttgtcccctggtttcagctgacgggcttgaccaaattctatgaseqidno.63ttttaatggtagagcttcttctggtttggtaaatgatattttctggtctaatgtcaaagtgtccaatattatgactgtgtaaaaactgaagtgcttcacaseqidno.64gacctggtgaacataacttacaatttctctttcattaagttcaaaagcacttgtgttaatgcgctcaaatatgtcaagtcctgatataaactcaaagatcseqidno.65ataactaattcttccatgctttcaaatgattcatggaggtgtaagatgtttctatgcctagcaatattcagaatggaaatttccttctttaccaaaacctseqidno.66gatcagtccctttgactttaacaaatttggccatgtatgtcttctttgaggatgtttcaacacaacgatggacaattccaaactcaccacgcccaagatcseqidno.67ttcagcaatcatatatttctcatagagttccttggttgaagagtgagatgctttagtcatggagacttccctggtttcatctacctcttcatcatagttcseqidno.68atagctctggtcttatcttctttggttatggttggttctgaaggctctgaaggcttgctcagaccaaatttattttcagctattacccggaactggtaacseqidno.69ttgtttttccaaataagttgatcacggtataacgtgtttctcgggcctgtcctacacggagccatctttctgcagtagttgcacatttttcaacaatgtaseqidno.70gttggtgattttgctgccaccatcagaggctggctcagtccatgttaagttgacagaatctcgtgagacatcactaactttgactcctctgggtgggtcaseqidno.71ggaacatcagccacatccagttcaactgtcttctgatcaattccaaatctgtttttagcacagaccacatagaaaccagcatcttttctctctaccccatseqidno.72tggggaaaacaagtgatgtgaaggatcttgtgacaataacttggtagtggccattattgtcaatgagatcttgtcctttctgccaggtgatcacaggatcseqidno.73tggtttgccactgaaaggaatcttgatgctgaccacttcacctcggagagcatgaactgctcccatgccttcaagagttttaggtaagtgtatcttagctseqidno.74taccttccacttccaaggaggcagtgccagacacagatcccccttggttggtagctctgacttggtaaactgtggcatcatcatctgtgacacttgcaatseqidno.75gatgagctggtggtagccacccttaaattcttgaatcctatattttaatccatctgcaatgatttctttgccttgtctgtaccatttgacgataggttttseqidno.76ggatgaccagtcactttgcagaccaaggtagcattgctctgatatctgacatttagatttctcagttcctctttaaagtgtggtgcctgaattgggacatseqidno.77cagatttgggagtgatgggttctgatatttcactccattcactttccccacctagattttcacatttcacacgaaactcgtattcaagaccttcaataagseqidno.78gtttttcactgaaaagacagtttctcgaatttcttctgttgtcacagaaatccatttattctgcttcttctcacgcttctcaaggtagtaatttctaatcseqidno.79tttgcacctccatcactggcaggtggcttccaggccacaacacaagaatcttttgtgacagcagtaatagttggtttgccaggagcacctggcttttctaseqidno.80atggactcttaatgatcacaactgaggacacttctagagggtcactgatgccgaaagtgttctgagctgaaacccggaagtaatagccagcattttctgtseqidno.81gaggttcacaattctacaggttgtcactgagatggctgaagacaccaattgccattcagccccctccttggcctcacatttttccaccacatagttggtgseqidno.82atccaggagcctccgtcatctgcgggtggtttccagctgatcactgcggagttcttcaatagagcttcgatcacaattggtcctgtaggtttgtctggttseqidno.83aaaataaaataccttgtatttccacatcaaggatggcatcaactgttccaaaaacattgctgagctggactttgtatttcccagcatgagtcttacgttgseqidno.84gacattcttcatgacaagatgagtatagtgctcagtgttttcaatagtaatgttttctgagttttgcaaaagtttctgaccatggaaccaagtcatggcaseqidno.85ggtactggacgaccaatgtacataacatgaagccgaagtgtggaacccacagctccataatatttctctttcagtgggtaaccaggatggaactgcggtgseqidno.86ttgcttgcaggagaagcttactactggtttctacttctccaacctcattggtggctatgcaggtataaacaccttcatcttcctgttcctctgtcattacseqidno.87tgtaagagtgtgtgtgcgtccatctgaagacattttgtatttccggctttgtatgagctctttaccaaatctgtaccatttaatgtcaggaagaggccttseqidno.88ccaacaatctggcatgagagttgagcagcttcacccaattttgtggtaacatccttcatttctttgcgtattcctggggcctctccagctgaacaatatgseqidno.89atgtgagtttagtctttatagacatagcagttctgcgaggtctgctcagcccagtctcattctcagcaaaaaccctgaattcatactcagtagcttccagseqidno.90caaacctcctattgtgaattgcttgtccttaatacgttccttattgctcttcttccaggcactgtctccagactgtctatattcaacccagtatccaagaseqidno.91atttctttaccaccatcacattcaggtttctcccactgtagagtgacactatctttggatattgaaagaatctcaagttctcctggttggcttggtttatseqidno.92atggatctttgcaaacaactggttcagaagcagggctggtctcactcaggccaacatcattctgtgcgatgatgcggaactgatactcagcatcgggaacseqidno.93aagccctgtgacagtgtacattgtggtggtgatctgagtcttgttgtgtctgacccacttgtcagtggatgtctctttgcgttcgatgtagtagcctgtgseqidno.94actctagaaccaccatcatctttgggccgggaccaggacaagctaacagaactcttggttacatcgagtacttctggaggattgcttggaggttctggagseqidno.95cacttactcaatggtgtttttggtgtgactggttcctcagatttcaagggtttgcttatgccaaactggttttctgctgaaacacggaaatggtattctaseqidno.96cattctctttgaggccttttaccaccagagatgtacctcggactctggaatcaatggtataccaggcggctttaggcacttctcgtctctcgaggatgtaseqidno.97gcctaagatgtcagcaccaccatcatcagcaggaggtctccagctgaccctcacagagcggacttggatgtcatcatattccagtggcccttctggactgseqidno.98ttgggacttcctatcaccctgaccttgatgtagacagccttcttgccacatttattttccagaaccaggtcataagtgccagaatcacccctgtctgcttseqidno.99ctttgatcacaagctcagtgtgtgtttcagatgttgcaatcatggcacgcttactaatatcctggccttccttggtccatttacatattgggaatggtttseqidno.100tcctttgattggtatggtaagtctgatgacgccaccttgccttacaaagataccttcttggtatctttcatcaagttcataatcaggatattctggaaaaseqidno.101aagcatttcagtgactttgactgttcctggtacctcagcaggctcaccaggtccaccagcattacaagctaggacgcggaacctgtattctgcaccctgaseqidno.102ggtaggtgtgttagagtatactctcgaatcttggttggagtggtgttacacttggtccattcatgttgatctactttttgcatttcaatcaagtagcctgseqidno.103tgactttagatcctccttcatcttctggaacactccaggccagggagactgatgtccttgttgtatcagtaactcttgggttttgtggctttcctggaggseqidno.104aattggatccatggcaacgatgggtttggaaggacgacttggtttcccagaccctcttgcattaatggctgtgacacggtgttcatattctaagccttcaseqidno.105gtaaggccagtggagcggtaccgtgtcattgtcacaggtactttatttacacggacccatcgatctgctctcacttctttgcgctccacaatatatccagseqidno.106tcacttgggagccaccgtcatcctctggtgggtaccaagtaagtgtcatgccatcacgggaaacatcaaatatctgtaatgtttctgggggtccaggaatseqidno.107ggatgctgctgcgacactctatgacctcagactgcaagtaagagccaatcccgaagcggtttgttgcagccacacggaacacatactcatttccttcggtseqidno.108gagtctggtaaacttaaacgtggacctagtcactgattcagaaacgggcagccatcctggacgatgagcgtcacgttgttctaccacataaccactcagtseqidno.109ggagcaccaccgtccaattcaggtggttcccaggaaatggtaattgatgtagcatcaatttcatcaatcttaataggtcctgttggtggaccaggcttgtseqidno.110ccttaccaagaatgataactttaatggtttctgaagtagttccggtaacattcttcaattcaagtgtgtattctccagtatctctgatagtggtttcacgseqidno.111gatggttaatttagctactttagtgtgagtttcaactgtgacacgctctgattctctcagtttagaaccagcaaagaaccaggaagcagcaggaggtggaseqidno.112cggccagcaataggtatcaccagctctactggtctgccagctgggacatggatggtcttctgaggcattgtagaaagatcgattgttggcaacactatggseqidno.113tacctctgaggtcttgtacagtcacggctgtgacagtctctcttggttctgacacacctttctcattttgtgcccttattctaaataagtattgttcaccseqidno.114ttcatttaaggaagtaacagtgtgctctaggactgtgggttttaaggtgacaaccttcatccatctctctgtgccagctttgcaggcctcgagaacatatseqidno.115ccagtgagtcggctaccaccatcgtagagtggtttttcccaggcaagggtaacagtggatttggtgacatcgaccacttctagctttgcaggcaccaaagseqidno.116gcacttctgagaccagtactgcatcagatgtttcacaaggttctccaatgccataaatattttctggcagcactctgaaatagtacatggttccttctacseqidno.117aagtccagaaattctgtaaagtgtcttgctgcatttggtagttactgttttgaatgctctcatagcagcttcacgcttctcaacgatgtaattgttgactseqidno.118ggagctccaccatcaatcgtgggaatttcccaagttatagtcacagaatctcttgatacttccttaactttcactgaaggacagggaccaggagtatctgseqidno.119aatgcttaccatagactttaacaaggactgttgctgatttcttgccagattggttttcagcttcaattgtgtattttccagcatcgtaccgattaactttseqidno.120gtccactattagcaatgagtagctctcagtggtgtcaataattgcccggcttgcaaggtcaatgccctgcttgctccacgttatgacaggaggtggtcttseqidno.121ccagatacagacaccatcaagcgcaaggaggccccagccctgatggtcacagtcttctttagatcatctgcaagctcaagatctggtatttctggaaagtseqidno.122ttctttccacgggctcaatttcagcaattgattcgctgtattcgctcatacccttcacgttcacggcagcaactctgaaggaatatttctggcccattttseqidno.123aaggtctggcacagtgaattcagtatttcttattgtggcattggtatgcactcggtaccactgatcagtgtccttctcttgcatttccagaacatatcctseqidno.124acaatgtcagtaccaccatcgtacatgggtttggtccatgccaaactaatgctgtgtttggtggtatccacaactcttggagcagaaggtggtccaggggseqidno.125atggttctctgcatgagatgaagttggaagcttcgctgggctcactgttaccagctgcattcactgcggtcacccggaactggtaatcacaaccctccatseqidno.126caggctggtcaccttcagcctggtatcatacaccacatagtctttgttgacacgtgtccagcgcaggctcttcttctcacgtttgtctactaggtagttgseqidno.127ctgatttcattgccaccatcagattcaggttttgtccactgaatgatgatatgctctttgccagtcccaacttcttcaggtatgccgggtggtgatggaaseqidno.128ctgaatgagtttctggctacaattggctctgattcaacaggcacaccagggccatatttgtttactgccctcactcggaatatgtactcattgttcttgaseqidno.129tgagcctggtaacgacataggatagggttgggcattcgccttcaacaatcacccagttgagcctgctagtctcgcgtctttccacgatgtagtgagtgatseqidno.130ttctgctcctccgtcttcctgcggaaggctccaggctaaagtgcacttctcctgtgttactctgctgacggtgagctttccacatgggccaggggaatctseqidno.131cttaccaagcactttgaccatgacagacacggccttggtcccgctggcatttttcactgttaaagtgtattttccactgtcacttctgtcacagaacttgseqidno.132atcacagcagttgctcgtttgccagtatactgcaaagagactttttcacagagatctagctccttgtctcctttggtccagataattttgggttcaggttseqidno.133tgccaccaactgcagcatccagaacaagatcagaacctgctctgatggtaaccagatcaccgtgtaatcgggcatccagttcggctttgggtggagctgtseqidno.134attcatctcggcaagtgacagggcctgtagattcagaccctttgctaattacgcctgctgcattcttggctaacacacggaactcataagtgtctccttcseqid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gcagtcacttgtgtctgataaagcatttcttgctgggacttcatcagtaactcataatseqidno.1304atgcacatagaaactggagttgcacttaccttcttcaagcaaggaagcagatgcagaagtttctccatgcttattgcgaacaacaatagtgtattctccaseqidno.1305gcatcatcagcaaaagtcatagaaatcaccagcttgcattcaccggtttgtttgttgtaactcactttgtatctttatgtaaatgtacaaaatttaaaaaseqidno.1306agtggttagaggaacaccagattttttccagtatacatggggctttgggttgccgccaacttggcatccaaacaccacgctcccaccttccaccagtttcseqidno.1307tggaccactggttttgtaataaagtaaggcgcggcaggttctccaggccctgcttgttcctctgtgaggctagtatcagtcataaccacatctcttgactseqidno.1308tgccaatactggtggggctgaaagtcaaaatggtactagaacagctactaattagcaaaatattttaccgtttctcttctgtagtaaatttctcagtcacseqidno.1309ggctgtggtttccttttcaaattcttctgacactaaaagaagacaaaagtttctcattgagatgagatgtttagtgacccctgcttagcactgacagttaseqidno.1310tgtgggagggtggccactaaccctgcacagccagatagcaggatgtgctgacggttccagcctcatttacagcactgcaagtaaatcgcccgctgtcttcseqidno.1311cgcaaatgcttcgcgaatcataagacgagcaattccactctggaaggttatctggaagtcaatggaactttcgatttggtagtcttccctgtaccatgtcseqidno.1312actgtcggggatgggtatccagagatgtggcactccaaggtgacagattcaccttctatgacagtcacattttttaagccctgaagagaggagaaaaaatseqidno.1313caaacgtgtattaaaatgatttgaggagatatgaatagggtccagcattatcaacttctttactcaccgagaccaaagttggtggagtaacaggaatttcseqidno.1314aacaggtgctggtactcttgctgtttctgttacctagatttttacaaattatattacaaaatgctcatgaaattaagggaaatctcataaactcttagctseqidno.1315gtgaccaaccttggcttcgcgtccgtgcagtacttcaaagcgctcttcacggacggtggtgccagtgatgctcacccctacttcctttttcacctcaacgseqidno.1316ccagcttcactcttgtaagtatctggtgtgtcagcgaaggggaactgtggcaagggtgtgggctctgcccttactctagtctcactgggcttcacagtagseqidno.1317gagccttcaccgatttggtgatcttctgagcagaagatgtggctgacaactctttttgtaatgtggcaatagcactaccggctattgatgcctacatggaseqidno.1318cctttaaacatttctgtatcatgctctgtaacttcttacctcatatccatgttctgtcttaggaacagaaatttttgaaacagtaaagtgagggctagctseqidno.1319gtgcgggggcgtttatccacatggactaatctttccgttgttagatctgtagttttcttgatctgcattgaaatgaaactcagtgataccattgatcaccseqidno.1320cacctgtgatgatatgtgcattcccttttgatcagtagttttgatatgagtctcagaaggagcctggattactctaggcttgactgctttagggacaacgseqidno.1321tggggttctgaggctggacgttggggaggctcagctacctttgcggcggaaatgcgttccttatatccgtactccaaagtggtctgctgagcataggattseqidno.1322cttcaagatgcccaggctctctgggctctctgactcgggcctggtctactgcagcaacaactgttgctacagcttcagccttttttccaacgtccacctgseqidno.1323gggatttcacacttggaacaacaatagtcacctttccatgggtaacttggatttgttcttgtctagtagccatagtttctctagttctcagtattgtttcseqidno.1324ttgttctttggctttagcagtagcaactgctattgtagacaaggcagttttctcggcttcctttctcatctgattattacagtaaaatcaagatttaagtseqidno.1325aacttttcacagctcaaatatctgtattcaccttctcctgagttatttgcacttgttctcttttggtagtaatgccttctctacctcttgatactaaatcseqidno.1326ttgttctttgactttgggtgtggcaactatgactttaggtacaactgttttcctagtttccttcattatctgatcatacaaaagaaagtaagaaaatagtseqidno.1327agtgactttcacattggcaggaagtcatcaccttttcataacttaggtgcatttgatcttgttgtgtggtagtttcttcttgagctcccgggactgtttcseqidno.1328tagttttgtggactttgcagtggcaactaccaccatggatgcagcagttatctcagtttcctgtcttatctgatgtttagagtaaaataaagatttgagtseqidno.1329tcaacaaactacaaaatatttagaaaatcagacttactgcttcttgagttacttgtttctgtttcttagtaatttcttcagaaattctagtttcttgttcseqidno.1330tttggctttagctgcggaaattactacctttggtacaaatgttttttcagtttcttttcttatctgcaaagaatgatttaagaaaaaactttatttcctgseqidno.1331agtgaatttaaaatacaaacccattttcacctgctcatgagttacgtgcatctgctcttgctttgtggtaattacttctttggttcttgattttaattctseqidno.1332tgttccttggctttatcggcggccactactaccttagttacagcagtcttctccgcttcctttcttacctgcttttcatagagaaaggaagaaaacacctseqidno.1333ccccatggcagcctcgcacgtacctgttcttgagcaggttggatgtgcacagcagtcgtggttgtcctctgagcagtctgctctacagcgctgatcactgseqidno.1334gttctctcactctggccatatcaacggcagcaacaacagtcgcaacagctgcacttttgtcagcatcttgtttcacctagattagaaatgaccaagtagaseqidno.1335ggcaacagcctctgctgcgtagctagcactggccgacacactggcggcagcacccgcagcaccactgatggtcacttgctcctggacaccgtatctccctseqidno.1336tcccatctctcttctgtcctgatctgagtagaggttgtcagcgttgtctctctcatctcagcctcagatgaggaggccacgtagccctcttgcttccaagseqidno.1337ggggaggcacttcaggacctgtggccacggtggatgcctgagtcttacgcatgagcaatggagacctaacagacctgatgggggatgtggagattcttgcseqidno.1338aatctgctctctctatggcagctttacctgaccggagatggggtcggtgcccgcacgtgtctgaccggggaaggggagtgtcttatgggcgatggggactseqidno.1339gctgccgagccagctgtgctttggcagcaatagacggtggtgttggggatcttgactttggcttcggaggaatcctgggaggtgttttatgtggcagctgseqidno.1340ttgcccagcggcaccatctatgaccatctcaactgttgcaattgatctggcatcaaagtgggcttcaatcttctgtaaaagattaaaacaaagcccacgtseqidno.1341aatagctggggacgcaacagcctgaaaggcttgaaaaccaacagtatagaaaaataccttttcaattcgggtttgtcttgattctgagatctgagcagtcseqidno.1342gaaacaattgtctttgtctttttagcaggtacttcttcttcacctgtgggaagggaaagatgaatgtttgggagggggcacaatgacccattttaaaagaseqidno.1343acgtaccttgaaccagtaattcagcagtcgaagtagctcttccaacgctattggtggcatttactgaataggtccctgagtcctcagggtatgcttctgcseqidno.1344aatcagtaagctgtagaggtcgccttcttgtgaaatttggaaatcaagggagctctggatttcggctccatcccggtagaacttcaccacaggtgtagggseqidno.1345attccagtcactctcacttggagtctcacttggcttccttgtctcacggtcatgctctgcagtcgttgaacgaagttgggtggtgctgtctcagctgcggseqidno.1346ttcacgagaagctcagcagtactagtcgcttgtccagatccattggtggctttcagggaatatcgtccactgttggctttagtcacggcggggatcgtcaseqidno.1347gtttagcgcggccatcgctaaaggagatctgcacgccgggcagagtggaagtggaaatcacctggccatccctaaaccagctcacctcaggaactggaaaseqidno.1348ttactggagaggaggcaaaggaaaaaaaaacaaaagtgtgaatgtgtgagcttaccactaatgtgagcctcaaaggttgcggtactaccctccagtaccaseqidno.1349caacgctttgtaacggctgcgtaaacgtcggtgcttgagttgtcatctttctaggcactctgaaaaagaagagaaaataaattagggtgtcccagctaag表2为94例肿瘤患者样本对pd-1抗体响应的情况分析表samplettnmutno.responses10pd-1抗体不响应s20pd-1抗体不响应s30pd-1抗体不响应s44pd-1抗体响应s51pd-1抗体响应s60pd-1抗体不响应s70pd-1抗体不响应s80pd-1抗体不响应s93pd-1抗体响应s100pd-1抗体不响应s112pd-1抗体不响应s120pd-1抗体不响应s130pd-1抗体不响应s140pd-1抗体不响应s153pd-1抗体不响应s160pd-1抗体不响应s170pd-1抗体不响应s184pd-1抗体不响应s190pd-1抗体不响应s203pd-1抗体响应s211pd-1抗体不响应s220pd-1抗体不响应s230pd-1抗体不响应s240pd-1抗体不响应s252pd-1抗体不响应s264pd-1抗体响应s272pd-1抗体不响应s281pd-1抗体不响应s290pd-1抗体不响应s301pd-1抗体不响应s311pd-1抗体不响应s322pd-1抗体不响应s333pd-1抗体不响应s340pd-1抗体不响应s350pd-1抗体不响应s360pd-1抗体不响应s371pd-1抗体不响应s380pd-1抗体不响应s390pd-1抗体响应s403pd-1抗体响应s410pd-1抗体不响应s421pd-1抗体不响应s430pd-1抗体不响应s440pd-1抗体不响应s450pd-1抗体不响应s460pd-1抗体不响应s473pd-1抗体响应s481pd-1抗体响应s490pd-1抗体不响应s500pd-1抗体不响应s511pd-1抗体不响应s520pd-1抗体不响应s530pd-1抗体不响应s540pd-1抗体不响应s550pd-1抗体不响应s560pd-1抗体不响应s573pd-1抗体响应s580pd-1抗体不响应s592pd-1抗体不响应s600pd-1抗体不响应s611pd-1抗体不响应s622pd-1抗体不响应s630pd-1抗体不响应s640pd-1抗体不响应s652pd-1抗体不响应s661pd-1抗体不响应s676pd-1抗体响应s680pd-1抗体不响应s691pd-1抗体不响应s700pd-1抗体不响应s710pd-1抗体不响应s723pd-1抗体响应s734pd-1抗体响应s740pd-1抗体不响应s750pd-1抗体响应s760pd-1抗体不响应s770pd-1抗体不响应s780pd-1抗体不响应s792pd-1抗体响应s800pd-1抗体不响应s810pd-1抗体不响应s821pd-1抗体响应s830pd-1抗体不响应s841pd-1抗体不响应s850pd-1抗体不响应s861pd-1抗体响应s870pd-1抗体不响应s880pd-1抗体不响应s892pd-1抗体响应s900pd-1抗体不响应s910pd-1抗体不响应s923pd-1抗体响应s933pd-1抗体响应s940pd-1抗体不响应以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12