一种检测放射性损伤的试剂及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种检测放射性损伤的试剂及其应用，具体的涉及检测linc00514的试剂。

背景技术：

放射性疾病(radiationdisease)是指电离辐射所致不同类型和不同程度损伤和疾病的总称。放射性疾病分为职业性和非职业性，放射工作人员受到照射多为长期低剂量职业性照射。电离辐射引起的生物效应分为随机性效应和组织反应(又叫确定性效应)，随机性效应的发生概率(非严重程度)与受照剂量大小有关，不存在剂量阈值，辐射致癌效应和遗传效应都属于随机性效应很多因素都可以引发癌症，放射性肿瘤与其它因素诱发的肿瘤在临床及病理上无区别，因此实现癌症的早期诊断，对于不同病因如放射性诱发的疾病的早期治疗具有重要的意义。

乳腺癌(breastcancer,bc)是全世界范围内女性最为常见的一种恶性肿瘤，发病率和死亡率居于各类恶性肿瘤的首位，并且有不断上升的趋势，严重威胁着广大女性的健康(rebeccas,kimberlym,ahmedinj.cancerstatistics,2017[j].cacancerjclinician,2017,67(1):7-30.)。据资料统计，在我国每年新发的病例中，大约有4％～10％的乳腺癌发现时即伴有远处转移，临床治疗效果较差(hannaf,krishnam,lindas,eta1.long-termoutcomeinyoungwomenwithbreastcancer:apopulation-basedstudy[j].breastcancerrestreat,2011,60(1):131-143)，因此早期诊断和治疗尤为重要，能有效降低乳腺癌死亡率。目前，已经发现的乳腺癌主要危险因素有年龄、乳腺癌家族史、乳腺良性肿瘤病变史、职业环境受电离辐射、长时间主动或者被动吸烟、肥胖、内源性激素水平、口服避孕药和激素替代疗法、生育及哺乳因素等等。

近年来，随着二代测序、高通量芯片等技术的迅速发展和广泛应用，发现包括非编码区域在内的人类基因组是普遍转录的，约75％的人类基因组可以转录为rna，而蛋白编码基因仅占不到2％，即人类转录组主要由非编码rna组成(djebalis，davisca,merkela,dobina,lassmannt,mortazavia,tanzera,lagardej,linw,schlesingerfetal:landscapeoftranscriptioninhumancells.nature2012,489(7414):101-108.)。根据rna长度是否大于200个核苷酸，将其分为长链非编码rna(longnoncodingrna；1ncrna)和小分子非编码rna(naganot,fraserp:no-nonsensefunctionsforlongnoncodingrnas.cell2011,145(2):178-181.)。研究表明，1ncrnas可以作为其结合靶点的转录激活剂、诱饵、引导者或脚手架等，进而参与细胞增殖、分化、凋亡和迁移等多种生物学进程(wangkc,changhy:molecularmechanismsoflongnoncodingrnas.molecularcell2011,43(6):904-914.)。目前，关于疾病相关1ncrnas的研究已成为国内外学者关注的热点，然而大部分1ncrnas在疾病(尤其是肿瘤)中的作用及临床意义尚有待确定。因此研究与乳腺癌发生发展相关的lncrna对于揭示乳腺癌的分子机制，实现乳腺癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与放射性疾病-乳腺癌相关的lncrna标志物，将其应用到临床中，可以实现乳腺癌的早期诊断和治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测linc00514的试剂在制备诊断早期乳腺癌的产品中的应用。

进一步，所述试剂包括通过反转录pcr、实时定量pcr、原位杂交、芯片技术检测linc00514表达水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：特异性识别linc00514的探针；或特异性扩增linc00514的引物。

进一步，特异性扩增linc00514的引物序列如seqidno.1～2所示。

本发明提供了一种诊断早期乳腺癌的产品，所述产品包括检测linc00514的试剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述芯片包括特异性识别linc00514的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括特异性扩增linc00514的引物，或特异性识别linc00514的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括特异性识别linc00514的寡核苷酸探针。

本发明提供了linc00514在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于乳腺癌的风险或与有助于评估早期乳腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有乳腺癌风险的个体、具有乳腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估乳腺癌中使用的数学算法的统计方法选自da(即线性、二次、规则判别分析)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

本发明提供了linc00514在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括linc00514的抑制剂。

进一步，所述药物组合物包括linc00514的抑制剂。所述抑制剂选自：以linc00514或其转录本为靶序列、且能够抑制linc00514基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，药学上可接受的载体包括(但并不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

本发明的药物组合物还可与其他治疗乳腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

在本发明中，“标志物”、“生物标志物”“基因标志物”可以通用，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，转录linc00514的基因是位于人18号染长臂2区1带上，id为283875，本发明中的linc00514包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的linc00514如genebank中公开的nr_033861.1所示。熟悉本领域的技术人员可以了解，对测序结果进行生物信息学分析时，通常会将测序结果和已知的基因组进行比对，只要测序片段可以比对到相关的基因上，就可以看做是该基因的表达。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

lncrna水平的一些检测或定量方法是本领域已知的并且都适合用于本文提供的方法以测量生物标志物的水平。示例性的方法包括但不限于rna印迹(northernblots)、核糖核酸酶保护试验和基于pcr的方法。

所述测定方法可以根据所需lncrna信息的类型而变化。示例性的方法包括但不限于rna印迹(northernblots)和基于pcr的方法(例如，qrt-pcr)。qrt-pcr等方法也可以对样品中lncrna的量进行准确定量。

本发明的检测lncrna芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于linc00514所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的lncrna的序列，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

在本发明中，试剂盒包括检测linc00514表达水平的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

在本发明中，术语“核酸膜条”包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明的优点与有益效果：

本发明首次发现了linc00514的差异表达与乳腺癌的发生发展相关，通过检测linc00514的表达水平可以判断受试者是否患有早期乳腺癌，从而实现早发现，早治疗，提高患者的生活质量。

附图说明

图1是利用qpcr检测linc00514基因在乳腺癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与早期乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集31例i-ii期的乳腺癌组织样本及与之相对应的癌旁组织样本(距离肿瘤边缘2公分)，从中随机选取4例进行高通量测序，全部病例排除其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病。

2、rna样品的制备

使用trizol法提取组织中的rna，步骤如下：

1)用剪刀组织剪碎，加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

3、总rna定量与纯度分析

将提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

4、构建cdna文库

1)使用epicentre的ribo-zero试剂盒除去总rna中的核糖体rna。

2)对完整的rna序列，利用金属离子进行随机打断，将rna随机断裂成200bp左右的小片段。

3)采用illuminatruseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建。

5、测序

使用illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。

6、高通量转录组测序数据分析

删除不易检测到的lncrna，使用r-3.3.3工具中的deseq2的对reads数进行差异表达分析，差异表达lncrna筛选标准：fdr<0.05，abs(log2fc)>2。

7、结果

高通量测序结果显示，与癌旁组织相比，linc00514在早期乳腺癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2qpcr测序验证linc00514基因的差异表达

1、利用前面收集的31例早期乳腺癌的组织样本和癌旁组织样本对linc00514进行大样本qpcr验证。

2、rna提取操作步骤同实施例1

3、qrt-pcr扩增检验

3.1逆转录

使用takara公司的反转录试剂盒(takaracode：drr047a)进行操作。

1)去除基因组dna

在试管中加入5×gdnaeraserbμffer2.0μl，gdnaeraser1.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

2)反转录反应

将5×buffer24.0μl，rtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，rnasefreeddh2o4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

3.2qpcr扩增

1)引物设计

根据linc00514和gadph的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

linc00514基因：

正向引物为5’-caagcaatccatctacaa-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-atctccactcactactac-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

2)qpcr扩增检验

用premixextaq^tmii(takaracode:drr081)试剂盒配置pcr反应体系，在thermalcyclerrealtimesystem扩增仪上进行pcr扩增，反应结束后确认realtimepcr的扩增曲线和溶解曲线，δδct法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

premixextaqtmii(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

4、结果

qpcr结果如图1所示，与癌旁组织相比，linc00514在早期乳腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，提示linc00514可作为分子标志物应用于乳腺癌的诊断和治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>青岛市中心医院

<120>一种检测放射性损伤的试剂及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caagcaatccatctacaa18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atctccactcactactac18

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aatcccatcaccatcttccag21

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagccccagccttctccat19