专利名称：稳定的放射性药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定的99mTc放射性药物组合物，其含有辐射防护剂和一种或多种抗微生物防腐剂，从而其使用寿命延长。
背景技术：
已知基于放射性同位素锝-99m(99mTc)的诊断成像用放射性药物应用于多种临床诊断，其中包括功能研究(例如肾功能)和灌注(特别是心脏和脑)。放射性同位素99mTc的半衰期为6小时，因此这样的99mTc放射性药物通常由所谓的“试剂盒”制备。
这些制备99mTc放射性药物的试剂盒允许使用者维持非放射性试剂盒的原药，其被设计成应用99mTc供应品中的99mTc-过锝酸盐(TcO4-)重新配制。用无菌盐水洗脱锝发生器获得在等渗盐水中的99mTc-过碍酸盐的无菌溶液是本领域公知的。
用于制备99mTc放射性药物的试剂盒通常含有(i)与99mTc形成金属络合物的配体，(ii)能够把过碍酸盐(即Tc(VII))还原成所需99mTc金属络合物低价氧化态的生物兼容性还原剂。
用于99mTc过碍酸盐的生物兼容性还原剂通常为亚锡离子，即Sn(II)。该试剂盒可以含有其它赋形剂，例如弱螯合剂(例如葡萄糖酸盐、葡萄庚糖酸盐、酒石酸盐或EDTA)、稳定剂、pH-调节剂、缓冲剂、增溶剂或膨胀剂(例如甘露糖醇、肌醇或氯化钠)，这些赋形剂有助于试剂盒成分的处理和冷冻干燥。为了有利于储存和分配，非放射性试剂盒通常是在封闭的无菌小瓶中的冻干形式。这种冻干制剂还有助于最终使用者将其与无菌过锝酸盐在盐水中重新配制，从而获得用于人的无菌注射用99mTc放射性药物。这种非放射性锝试剂盒的储存期可以长达数月。
放射性药物组合物可能会发生辐射分解作用，特别是溶剂(例如水)的辐射分解作用，结果产生高反应性的自由基，该自由基可以降解组合物的一种或多种成分。已知应用辐射防护剂或自由基清除剂有助于抑制这种降解过程。通常说来，自由基清除剂可以从已知类型的抗氧化性化合物中选择。在US4364920中公开了抗坏血酸和抗坏血酸盐能够用作用于制备99mTc放射性药物的含亚锡的非放射性试剂盒的稳定剂，后来这些物质已经广泛地用于99mTc放射性药物制剂。在US 4233284中公开了用于99mTc放射性药物的龙胆酸稳定剂。在US4451451中公开了用于99mTc放射性药物制剂的对氨基苯甲酸(PABA)及相关的稳定剂。
US 3939258(1976)教导了可以把抗微生物防腐剂对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯添加至含有放射性同位素113mIn的放射性药物制剂中。这种制剂不含有辐射防护剂。
用于制备99mTc放射性药物的市售非放射性试剂盒CHOLETECTM在制剂中含有mebrofenin(4.5mg)、对羟基苯甲酸甲酯(4.5mg)、对羟基苯甲酸丙酯(0.5mg)和氟化亚锡(0.73mg)。该试剂盒制剂不含有辐射防护剂。包装说明书还包括如下内容“如果与Choletec一起应用的过锝酸钠Tc-99m注射液必须进行稀释，则应该应用不含防腐剂的氯化钠注射液USP。”Mebrofenin是一种用于99mTc的络合剂，其是一种取代的亚氨基二乙酸(IDA)。
对羟基苯甲酸酯类是一种已知类型的抗微生物防腐剂 R＝Me对羟基苯甲酸甲酯Et对羟基苯甲酸乙酯n-Pr 对羟基苯甲酸丙酯n-Bu 对羟基苯甲酸丁酯US 5093105涉及苯扎氯铵或苄索氯铵作为放射性药物抗微生物防腐剂的用途，其被认为能够与辐射防护剂兼容。US 5093105记载了与辐射防护剂不兼容的其它抗微生物防腐剂。然而，苄索氯铵被认为是弱的致癌物质，苯扎氯铵通常被认为口服给药时具有毒性。
Hensel等[J Pharm Sci 1995；84(1)115-118]公开了下列内容对羟基苯甲酸酯类防腐剂在大分子(例如多糖)存在下会发生降解，特别是通过与醇发生酯交换反应而降解，这是一个公知的问题。该文献报道对羟基苯甲酸酯类的酯交换反应在多元醇的存在下也会发生，所述的多元醇的例子包括木糖醇、甘油和山梨糖醇，但在醛糖(例如核糖或木糖)存在下没有观察到酯交换反应。
某些放射性药物试剂在急性情形下特别有用，例如增强监护或急症病房(ER)装置中。某些患者需要在白天或黑夜的任何时间进行诊断，该诊断要求易于对诊断扫描应用放射性药物，当常规放射性药物学的放射性药物供应可能不是一个选择时。具体地说，为此目的需要能够由放射药物技术人员制备的放射性药物，但其重新配制后的储存期大于12小时，例如高达36小时。
本发明本发明提供改进的99mTc放射性药物组合物，其重新配制后的储存期至少为24小时。优选的99mTc放射性药物是那些在紧急状况下特别有用的药物组合物，其包括心脏、脑、肺和血栓成像试剂。
解决99mTc放射性药物试剂重新配制后具有延长的有效性的问题意味着在重新配制时，99mTc放射性的起始水平必须很高。这是因为6小时的99mTc半衰期意味着有一半的用于诊断成像的放射性在每6小时会放射性衰退，因此，24小时后仅仅保留原始放射性的1/16。对于99mTc放射性药物组合物来说，这样高水平的延长时间的放射性会造成显著的辐射分解可能性。因此本发明的组合物含有辐射防护剂。
胃肠外给药溶液中可能存在微生物，这也进一步限制注射用放射性药物的重新配制后的使用期。为了降低人体注射用的多用途溶液长时间(例如大于12小时)储存的感染危险性，该制剂必须在重新配制后的任何时间以冷冻状态或者在2-8℃的温度下储存。或者，必须存在杀菌剂(即微生物抑制剂)或制菌剂(即微生物生长抑制剂)以抑制微生物的生长。在运输(例如从放射药物工作者至临床工作者)以及使用之前的储存的整个过程中，放射性药物以冷冻状态或者在2-8℃下保存来延长储存是非常难以实现的，因此常规方法不受欢迎并且不方便。因此，本发明的放射性药物组合物中含有一种或多种抗微生物防腐剂。本发明的稳定组合物和试剂盒可以在环境温度或室温下储存，即不需要特别的温度储存条件用于抑制微生物的生长。这一点非常有利于方便使用。
发明详述本发明第一方面提供稳定的99mTc放射性药物组合物，其含有(i)99mTc金属络合物；(ii)辐射防护剂，含有抗坏血酸、对氨基苯甲酸或龙胆酸或其与生物兼容性阳离子形成的盐；(iii)一种或多种式(I)的抗微生物防腐剂 其中R为C1-4烷基，M为H或生物兼容性阳离子。
因此，与现有技术的教导相反，令人惊奇地发现式(I)的对羟基苯甲酸酯类抗微生物防腐剂可以用来与99mTc放射性药物制剂的辐射防护剂联合作用，不会对99mTc试剂的放射性化学纯度(RPC)产生有害影响(即基于99mTc的杂质的显著水平)，因此不会影响成像质量。
术语“99mTc金属络合物”表示锝与一种或多种配体的配位络合物。非常优选99mTc金属络合物“能够抵抗转螯合作用(transchelation)”，即不容易与其它潜在竞争配体在锝配位位置进行配体交换。潜在竞争配体可以是制剂中的其它赋形剂(例如稳定剂、辐射防护剂、抗微生物防腐剂或用于非放射性试剂盒的防腐剂)。这些化合物通常具有氧原子或氮原子供体，其为羧酸或其酯或醇。羧酸和醇容易与锝形成相对弱的络合物，这样的潜在竞争配体通常不具有螯合锝的供体原子。
在本发明中用于形成抗转螯合作用的99mTc络合物的合适配体包括螯合剂，其中2-6个、优选2-4个结合锝的金属供体原子排列成5元或6元螯合环(其中含有连接金属供体原子的碳原子或非配位杂原子的非配位骨架)；或者单齿配体，其含有与锝牢固结合的供体原子，例如异腈、膦类或diazenides。与锝良好结合作为螯合剂部分的供体原子类型的例子有胺类、硫醇类、酰胺类、肟类和膦类。膦类形成如此强的锝络合物，甚至于双齿螯合膦类例如Tetrofosmin(即6，9-双(2-乙氧基乙基)-3，12-二氧杂-6，9-二膦十四烷(diphosphatetradecane))形成合适的99mTc络合物。异腈和diazenides的线性几何结构使它们不容易混合到螯合剂中，因此通常用作单齿配体。合适的异腈的例子包括简单的烷基异腈如叔丁基异腈，以及醚取代的异腈，例如mibi(即1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)。合适的膦类的例子包括Tetrofosmin和单齿膦类例如三(3-甲氧基丙基)膦。合适的diazenides的例子包括HYNIC系列配体，即肼取代的吡啶类或烟酰胺类。
形成抗转螯合作用的99mTc络合物的对锝合适的螯合剂的例子包括但不限于(i)下式的二胺二肟类 其中R1-R6各自独立地为R基团；各个R为H或C1-10烷基、烷基芳基烷氧基烷基、羟烷基、氟烷基或氨基烷基，其中一个或多个R基团可以任选地与生物靶分子结合；Q为式-(A)n的桥基；其中n为3、4或5，各个A独立地为-O-、-NR-或-CR2-，条件是在(A)n中最多有一个A基团为-O-或-NR-。
在优选的二胺二肟类中，R1-R6＝C1-3烷基、烷基芳基烷氧基烷基、羟基烷基、氟烷基或氨基烷基，其中一个或多个R基团可以任选地与生物靶分子结合。在最优选的二胺二肟类中，R1-R6＝CH3，其中一个或多个R基团可以任选地与生物靶分子结合，并且Q＝-(CH2)3-即亚丙基胺肟或PnAO；Q＝-(CH2)4-即亚丁基胺肟或BnAO；Q＝-(CH2)5-即亚戊基胺肟或PentAO；Q＝-N(CH2)2NR(CH2)2N-；或R1、R3、R5和R6＝CH3，并且R2＝R4＝H以及Q＝-CH2C(CH3)2CH2-即六甲基亚丙基胺肟或HMPAO；
(ii)具有硫醇三酰胺供体的N3S配体例如MAG3以及相关配体；或者具有二酰胺吡啶硫醇供体的N3S配体例如Pica；(iii)具有二胺二硫醇供体的N2S2配体例如BAT或ECD(即半胱氨酸乙酯二聚体)，或具有酰胺胺二硫醇供体的N2S2配体例如MAMA；(iv)N4配体，其为具有羟化四甲铵、酰胺三胺或二酰胺二胺供体的开链或大环配体，例如环拉胺(cyclam)、单氧代环拉胺或双氧代环拉胺。
(v)具有二胺二酚供体的N2O2配体。
优选的本发明的配体为膦类、异腈类和二胺二肟类，其中特别优选Tetrofosmin和mibi(即2-甲氧基-异丁腈(isobutylnitrile)或1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)，最优选Tetrofosmin。Tetrofosmin和mibi形成适合于心脏成像的阳离子亲脂性99mTc络合物，并且分别用于市售的产品MyoviewTM和CardioliteTM。术语“阳离子亲脂性99mTc络合物”是指锝-99m配位络合物，其中锝带正电荷，并且锝络合物的辛醇/水分配系数大于0.5。
本发明的99mTc配体可以任选地与生物靶分子结合，使99mTc放射性药物对准哺乳动物身体的目标位点，例如具体器官、受体或疾病位置。合适的这样的生物靶分子包括1-100链节的直链或环状肽或肽类似物，特别优选3-20链节的肽类；单克隆抗体或其片断；或者酶底物或抑制剂、合成的受体结合化合物、低核苷酸或寡DNA或寡RNA片断。
术语“抗微生物防腐剂”是指抑制可能有害的微生物(例如细菌、酵母菌或霉菌)生长的试剂。所述抗微生物防腐剂还可以显示某些杀菌特性，其特性取决于剂量。本发明抗微生物防腐剂的主要作用是抑制所有这样的微生物在99mTc放射性药物组合物重新配制后(即在放射性诊断产品自身中)的生长。然而，所述抗微生物防腐剂还可以任选地用于抑制可能有害的微生物在本发明非放射性试剂盒重新配制前的一种或多种成分中的生长。
本发明的式(I)对羟基苯甲酸酯抗微生物防腐剂在pH4-8时具有最佳活性，因此适合于广泛范围的99mTc放射性药物制剂。对羟基苯甲酸酯类在低浓度下能够有效地抵抗真菌(酵母菌和霉菌)和细菌。它们对微生物的静态作用强于致死(即杀菌)作用。随着对羟基苯甲酸酯的烷基链的增长，对羟基苯甲酸酯的抗微生物防腐剂的活性增加。对羟基苯甲酸酯还具有的优点在于与制菌剂苯甲醇和三氯叔丁醇不同，对羟基苯甲酸酯是难挥发物质，因此能够在冻干制剂中含有。对羟基苯甲酸酯还被Regulatory Authorities批准用于注射用放射性药物制剂。含有抗微生物防腐剂的注射于人的盐水溶液通常被缩写为“BSI”(注射用制菌盐水)。作为抗微生物防腐剂的含有对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的BSI USP可以购自American Pharmaceutical Partners(APP)。每cm3溶液含有对羟基苯甲酸甲酯 1.2mg，对羟基苯甲酸丙酯 0.12mg，氯化钠 9mg其pH为4.5-7.0。
本发明的式(I)对羟基苯甲酸酯类抗微生物防腐剂的应用形式为苯酚(即M＝H)或盐形式(其中M＝生物兼容性阳离子)。术语“生物兼容性阳离子”是指与离子化的负电荷基团(此处指酚盐基团，即苯基-O-)形成盐的正电荷抗衡离子，其中所述正电荷抗衡离子还是非毒性离子，因此适合给药于哺乳动物，特别是人体。合适的生物兼容性阳离子的例子包括碱金属(例如钠或钾)；碱土金属(例如钙、镁和钡)；以及铵离子。优选的生物兼容性阳离子是钠。当式(I)的M为生物兼容性阳离子时，对羟基苯甲酸酯抗微生物防腐剂更容易溶于水。例如，1份对羟基苯甲酸甲酯的钠盐能够溶解于2份水中，1份对羟基苯甲酸丙酯的钠盐能够溶解于1份水中。
术语“辐射防护剂”是指通过捕获高活性自由基(例如由水辐射分解产生的含氧自由基)抑制降解反应(例如氧化还原反应)的化合物。本发明的辐射防护剂合适地选自抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即2，5-二羟基苯甲酸)以及这些物质与上述生物兼容性阳离子形成的盐。优选的辐射防护剂为抗坏血酸和抗坏血酸钠。本发明的辐射防护剂可以经市售得到，例如抗坏血酸注射剂USP可以购自许多供应商，包括Abbott Laboratories。
式(I)对羟基苯甲酸酯抗微生物防腐剂在99mTc放射性药物溶液中的浓度应该能够足以有效地用作抗微生物防腐剂，优选至少0.3mg/cm3，可以高至对羟基苯甲酸酯在基质中的溶解度。应用规定的测试方法，例如应用USP Chapter 51抗微生物效力测试方法，可以容易地确定给定浓度的效力。某些具体的对羟基苯甲酸酯类(M＝H)在水中的溶解度为对羟基苯甲酸甲酯 2.5mg/cm3对羟基苯甲酸乙酯 0.070％w/w，25℃，对羟基苯甲酸丙酯 1份溶解于2000份水中对羟基苯甲酸丁酯 1份溶解于5000份水中。
在制剂溶液中的浓度足以有效用作抗微生物防腐剂的合适的对羟基苯甲酸酯类组合物可以根据下列因素容易地确定所述物质的水溶解性、基质的pH、溶液的相对亲水/亲脂组成、所需要的最终浓度。基质的pH值是重要的，因为所有抗微生物防腐剂具有最佳的pH范围。对于以水为主的制剂来说，对羟基苯甲酸甲酯在M＝H的苯酚类物质中是最合适的，因为它在水中的溶解度最高。本发明的抗微生物防腐剂可以合适地含有两种或多种不同的对羟基苯甲酸酯类，因为已知单个酯的组合在效果上是相加的。随着烷基链长度的增加，对羟基苯甲酸酯的水溶解度减小，然而，随着烷基链的增长，抗微生物活性增加。因此，优选把短链对羟基苯甲酸酯和长链对羟基苯甲酸酯类联合用作抗微生物防腐剂。这样的联合提供相加的抗微生物防腐效果，虽然长链对羟基苯甲酸酯具有非常有限的水溶解性，但由于其活性强，因此用量少。优选的两种对羟基苯甲酸酯类的混合物是R＝甲基的化合物和R＝丙基的化合物的联合。据信这种联合能够获得良好的抗真菌和抗细菌效果。特别优选对羟基苯甲酸甲酯(R＝甲基且M＝H)与对羟基苯甲酸丙酯(R＝丙基且M＝H)的联合。
用于本发明的辐射防护剂的合适浓度为0.0003-0.7摩尔，优选0.001-0.07摩尔，最优选0.002-0.02摩尔。对于抗坏血酸来说，这种相应的合适浓度为0.05-100mg/cm3，优选0.2-10mg/cm3，最优选0.3-3.0mg/cm3。对于99mTc放射性药物Myoview，抗坏血酸或抗坏血酸盐辐射防护剂的优选浓度为0.0025-0.01摩尔，当辐射防护剂为抗坏血酸时，其相应于0.4-1.5mg/cm3的浓度。
适合诊断成像的99mTc的放射性含量为180-1500MBq，其取决于体内成像部位、摄取部位和目标部位与背景的比值。对于应用99mTc放射性药物的心脏成像来说，在紧张研究中应用约1110MBq(30mCi)，在休息研究中应用约350MBq(10mCi)。因此，在本发明的稳定99mTc放射性药物组合物中，起始的99mTc活性为0.2-100GBq，其允许在同一制剂中的多个剂量，即使在若干99mTc半衰期的放射性活性衰变后也是如此。
第二方面，本发明提供适合人体给药的无菌形式的稳定的99mTc放射性药物组合物，其在容器中或者在预先填充的注射器中。这样的预先填充的注射器含有单个人的剂量，优选适于临床用的一次性注射器或者其它注射器。预先填充的注射器可以任选地带有注射器防护物以保护操作者免受放射性剂量的影响。合适的放射性药物注射器防护物是现有技术中已知的，优选含有铅或钨。
适于人体给药的无菌形式的稳定的99mTc放射性药物组合物可以存放于有盖的容器中，该容器盖适合用皮下注射针进行多次刺穿(例如crimped-on隔膜盖)。这样的容器可以含有单-或多-患者剂量。优选的容器包括含有多患者剂量的单个大瓶(例如10-30cm3体积)，因此，在适合临床应用的稳定制剂的可使用期间的各个时间间隔，可以把单个患者剂量抽至临床用注射器中。
第三方面，本发明提供用于制备稳定99mTc放射性药物组合物的非放射性试剂盒。合适地，这样的试剂盒包括用于制备99mTc放射性药物的常规冻干小管，和含有辐射防护剂和对羟基苯甲酸酯抗微生物防腐剂的一个或多个另外的容器，以及制备说明书。所述试剂盒可以任选地首先用盐水中的99mTc-过锝酸盐或BSI(即制菌的0.9％注射用盐水)重新配制。对于MyoviewTM，这两种选择均是可行的，但优选首先形成99mTc-tetrofosmin络合物，然后添加BSI，因为这样比相反顺序的添加能获得更高的放射化学纯度(RCP)。
或者，可以把辐射防护剂在任何合适阶段添加至放射性药物试剂盒制剂中。合适地，可以把辐射防护剂从试剂盒制剂的外部混合，或者在形成99mTc-放射性药物后加入。然而，如同对羟基苯甲酸酯抗微生物防腐剂，优选在重新配制后尽早地把辐射防护剂加入到该放射性药物制剂中，因为添加辐射防护剂的延误会增加降解的危险性。对于MyoviewTM，优选在放射性重新配制后15分钟内添加辐射防护剂。
或者，可以把一种或两种辐射防护剂和抗微生物防腐剂任选地加入到非放射性试剂盒的冻干制剂中。
第四方面，本发明提供一种组合物的用途，其中所述组合物含有
(i)辐射防护剂，含有抗坏血酸、对氨基苯甲酸或龙胆酸或其与生物兼容性阳离子形成的盐；(iii)一种或多种式(I)的抗微生物防腐剂 其中R为C1-4烷基，M为H或生物兼容性阳离子；用于稳定和抑制微生物在99mTc放射性药物制剂中的生长。
下面通过详细的非限制性实施例举例说明本发明。
实施例1表明即使在pH约9.6的条件下经7天后，13C NMR研究没有发现抗坏血酸和对羟基苯甲酸甲酯之间发生了显著的反应；也没有发现更浓的溶液发生了任何显著的水解。Hensel等[J.Pharm Sci 1995；84(1)115-118]报道短链烷基的对羟基苯甲酸酯类与多元醇发生转酯化反应的活性较高。这表明如果与抗坏血酸发生了任何反应，应该是甲基酯而不是长链烷基类似物发生了反应。
实施例2显示在99mTc放射性药物MyoviewTM中，即使在重新配制后24小时，对羟基苯甲酸酯类和抗坏血酸一起对制剂的放射化学纯度(RCP)没有显著的副作用。实施例3和4显示通过抑制故意添加细菌的非放射性制剂的细菌生长，本发明的制剂确实能够起抗微生物防腐剂的作用。
实施例5显示加入99mTc的MYOVIEW 24重新配制的放射性制剂对测试菌种显示抗微生物效力，所述菌种包括大肠杆菌、绿脓假单胞菌、施氏假单胞菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌。MYOVIEW24是稳定的MyoviewTM制剂，其含有作为辐射防护剂的抗坏血酸(AA)和作为防腐剂的制菌氯化钠0.9％。与含有生理盐水的对照组小管和注射器相比，在小管和注射器中，72小时后所有细菌在MYOVIEW 24中的浓度降低至少2个log系数(表1)。在研究期间(14天)，酵母菌和霉菌在种群数目上没有增加。测试的两个菌种为白色念珠菌和黑曲霉。因此，在重新配制的MyoviewTM制剂中，微生物的增殖得到有效控制。
实施例6显示本发明的稳定MyoviewTM制剂的生物分布完全与不稳定的MyoviewTM产品的生物分布相当。
实施例7显示在99mTc放射性药物MyoviewTM中，即使在重新配制24小时后，对羟基苯甲酸酯和龙胆酸对制剂的放射化学纯度(RCP)没有明显的负作用。重新配制后15分钟和24小时，RCP大于90％。
图1表示把25-200％BSI加入到MyoviewTM/抗坏血酸并储存于注射器中产生的抗绿脓假单胞菌的抗微生物效力。
图2表示把25-200％BSI加入到MyoviewTM/抗坏血酸并储存于注射器中产生的抗大肠杆菌的抗微生物效力。
图3表示本发明的非放射性MYOVIEW24制剂能够有效地抵抗大肠杆菌微生物的攻击。
图4表示本发明的非放射性MYOVIEW24制剂能够有效地抵抗绿脓假单胞菌微生物的攻击。
图5表示在Wistar大鼠(雌性，平均值±标准偏差，n＝3)心脏中，以MyoviewTM或MYOVIEW24给药的99mTc-tetrofosmin注射剂量百分比的比较，其结果表明添加的抗微生物防腐剂和辐射防护剂没有显著效果。
实施例113C NMR研究抗坏血酸和对羟基苯甲酸甲酯之间的反应实验A.在蒸馏水(2.1cm3)中混合抗坏血酸(1.0g)和对羟基苯甲酸甲酯(48mg)。在搅拌下加入少量氢氧化钠粉末调节pH值。在3种pH下(pH7.5、8.8和9.6)，把代表性等分试样(0.5cm3)转移至NMR小管中。在1星期中用13C NMR每天监测3个样品的反应混合物。当不被监测时，把混合物在室温下避光保存。在监测期终点，把少量甲醇加入到所述溶液中以证实是否发生水解，由转酯化反应产生的任何甲醇的13CNMR信号将与起始甲基酯共振信号良好地分开。
在pH7.5下，对羟基苯甲酸酯具有有限的溶解度，因此必须确保在移开样品等分试样之前把所述成分有效地混合。在此样品的13C NMR谱中，由于类似的原因，对羟基苯甲酸酯的信号强度也大体降低。
13C NMR谱由JEOL EX270 NMR光谱仪获得，在67.94MHz的频率中用宽带可调节探针操作。以约30分钟的时间获得各个光谱数据。
实验B.在剧烈搅拌下，把少量氢氧化钠粉末加入到抗坏血酸(100mg)和对羟基苯甲酸甲酯(100mg)在水(2.0cm3)中的混合物中直至达到恒定的pH9.5。取出等分试样(0.5cm3)的无色溶液，用13C NMR光谱监测。作为检测过程的部分，29小时后把样品置于Bruker AM250 NMR光谱仪中，积聚其13C NMR光谱16小时。加工后的数据给出的光谱中信噪比为230∶1。该光谱表明从两种成分相互作用中没有产生大量的任何其它成分，并且，没有证据表明对羟基苯甲酸甲酯水解产生了任何甲醇。然后把少量甲醇加入到样品中作为参考峰。
在NMR光谱中观察到下列共振δc(H2O)51.9、62.7、69.6、78.4、113.2、115.0、118.2、132.1、169.9、171.1、175.5、177.4[位移ppm，相对于MeOH在49ppm]。在62.7、69.6、78.4、113.2、175.5和177.4处的共振是抗坏血酸盐的信号，其余共振是对羟基苯甲酸甲酯的信号。
实施例2对MyoviewTM试剂盒放射化学纯度的作用MyoviewTM是一种冻干制剂，其含有Tetrofosmin0.23mg氯化亚锡二水合物 0.03mg磺基水杨酸二钠 0.32mgD-葡萄糖酸钠 1.0mg碳酸氢钠 1.8mgpH 8.3-9.1，其在10ml玻璃小管中用氮气USP/NF密封，用无菌过锝酸钠(99mTc)注射液USP/Ph.Eur.重新配制获得含有心脏成像用放射性药物99mTc-tetrofosmin的溶液。
含有抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯的MyoviewTM制剂如下制备(i)用注射器把抗坏血酸USP溶液(500mg/cm3，0.5cm3)加入到含有注射用制菌盐水USP[在0.9％(w/v)氯化钠溶液中，1.2％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.12％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯；10cm3]的小管中；(ii)应用从99mTc产生器(1.5-5.0cm3，30-400mCi/cm3)中获得的盐水中的99mTc-过锝酸盐重新配制常规MyoviewTM小管；
(iii)在步骤(ii)重新配制的5分钟内，把步骤(i)的溶液的等分试样(0.2cm3)加入到步骤(ii)的重新配制的MyoviewTM小管中；(iv)把与步骤(ii)所用洗出液体积相等的另一体积(1.5-5.0cm3)的BSI加入到步骤(iii)的溶液中获得MYOVIEW24制剂。
MYOVIEW24是一种稳定的MyoviewTM制剂，其含有作为辐射防护剂的抗坏血酸(AA)和作为防腐剂的制菌氯化钠0.9％(BSI)。
然后按照MyoviewTM包装说明书的教导应用ITLC(瞬时薄层色谱法)和PC(纸色谱法)测定放射化学纯度(RCP)。MYOVIEW24在ITLC和PC中的放射化学曲线与通常MyoviewTM相同，作为起始产品，相同少量杂质发生同样变化。虽然MYOVIEW24制剂在此具体例子中具有94％的RCP，正常MyoviewTM标记对所需99mTc-tetrofosmin络合物具有96％的RCP，但是在标记后30分钟，放射色谱类似。在标记后24和30小时，与起始的标记相比，MYOVIEW24制剂的RCP几乎是恒定的，即仍然大于90％。
实施例3抗微生物效果革兰氏阴性菌和非放射性制剂把一系列浓度的相当于25-200％的BSI对羟基苯甲酸酯浓度(1.2mg/cm3对羟基苯甲酸甲酯和0.12mg/cm3对羟基苯甲酸丙酯)的对羟基苯甲酸酯加入到用于制备MyoviewTM的非放射性试剂盒中，往其中加入抗坏血酸(4.76mg)。加入革兰氏阴性菌(1×106cfu/小管；其中cfu是克隆形成单位)，把产品装入到小管和注射器中，然后在37℃下温育72小时。对于绿脓假单胞菌，在注射器(图1)和小管中温育后72小时，所有浓度在细菌计数方面均显示相当于1log以上降低的效力。对于大肠杆菌，在注射器(图2)和小管中温育后72小时，所有大于40％BSI的浓度均显示相当于1log以上降低的抗菌活性。
实施例4抗微生物活性非放射性制剂按照USP<51>的记载，应用大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白色念珠菌和藤黄微球菌六种微生物攻击实施例2的含有50％BSI的MYOVIEW24制剂。把温育物储存于注射器和小管中。在72小时内，产品在所有细菌计数中显示大于1log的降低，在14天内，显示大于2log的降低。图3和4分别显示大肠杆菌和绿脓假单胞菌的代表性数据。对于酵母菌和霉菌，任何时候细菌计数均没有增加。
实施例5抗微生物活性放射性制剂按照实施例2的方法制备重新配制的MYOVIEW24小管，用100μl(1.0％总体积)标准接种物(USP<51>中指明的6种微生物，即大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白色念珠菌和藤黄微球菌)接种，然后混合。对各个微生物制备3个小管。各个微生物的接种物估计为1.0×107至1.0×108CFU/mL，这样当把接种物加入到MYOVIEW24小管中时，测试制剂的最终浓度为105-106CFU/mL产品。
把各个接种物小管的等分试样(3ml)放置到3ml塑料注射器中，把剩余7ml接种物加入到排空的小管中。对各种微生物制备一式三份这样的注射器和小管。
把6小管的MyoviewTM与10ml生理盐水和抗坏血酸注射用USP溶液(500mg/ml AA、9mg/ml氯化钠和5mg/ml连二硫酸钠，pH为5.5-7.0)以非活性方式重新配制，然后在测试期间对于阳性对照组用如上所述同样的接种物接种(即不含防腐剂)。阳性对照组不用锝-99m制备。如上所述把所述体积加入到小管和注射器中。
以盐水填充不含接种物的MyoviewTM小管制备阴性对照组一式两份。如上所述把所述体积加入到注射器和小管中。把一组注射器/小管进行温育，在作为菌种的TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)上接种。把一组注射器/小管进行孵育，在作为霉菌和酵母菌的SDA(Saboraud葡萄糖琼脂)上接种。
在22.5±2.5℃下维持所有注射器和小管直至取样。按照程序在0、6、24和72小时、第7天和14天除去各个注射器和小管的样品。对于白色念珠菌、黑曲霉和施式假单胞菌，移开48小时样品。用溶化的生长基质培养样品，冷却后温育。记录恢复的微生物数量。Log降低数如表1所示
表1.
72小时和7天的Log降低
其中NA＝不适用实施例6Mvoview和Mvoview24的对比生物分布把MyoviewTM小管用来自Amertec II99mTc生成器的洗脱液重新配制，得到最终放射性浓度为5.4mCi/cm3(0.2GBq/cm3)(正常活性)或64.9mCi/cm3(2.4GBq/cm3)(高活性)。按照实施例2的方法应用来自99mTc生成器的洗脱液制备MYOVIEW24，得到最终放射性浓度为33.8mCi/cm3(1.25GBq/cm3)(正常活性)或64.9mCi/cm3(2.4GBq/cm3)(高活性)。在重新配制后15-30分钟内测定所有制剂的RCP，并在1小时重新配制后使用后立即测定所有制剂的RCP，所有情况下发现RCP大于90％。把重150-200g的Wistar大鼠轻微麻醉(氟烷)，通过侧尾静脉注射0.15cm3重新配制的MyoviewTM或MYOVIEW24。在注射正常活性制剂后第2分钟、20分钟、1小时和7小时，或者在注射高活性制剂后24小时，应用孪晶γ-计数仪，通过对放射性的分析、测试，测定注射的放射活性百分比(以注射剂量％表示)。
各个器官或组织的注射放射性百分比的结果表明在雌性或雄性大鼠中，作为MyoviewTM或MYOVIEW24给药的99mTc-Tetrofosmin生物分布没有显著差异。MyoviewTM和MYOVIEW24均显示
(i)在注射后的头两分钟，血液中的放射性迅速降低至注射剂量的2％以下；(ii)心脏中放射性含量在注射后(p.i.)两分钟约为1.5％，在注射后7小时降低至约0.8％；(iii)注射24小时后整个身体消除约75％(60％粪便；15％尿)。此时保留放射活性的主要位置是骨骼肌。
图5说明在MyoviewTM的目标器官即心脏中，MyoviewTM和Myoview24具有相当的生物分布数据。
实施例7龙胆酸和对羟基苯甲酸酯对MvoviewTM试剂盒放射化学纯度的作用。
以龙胆酸(GA)代替抗坏血酸(AA)作为辐射防护剂，以类似于实施例2的方式，研究在稳定的MyoviewTM试剂盒中其与对羟基苯甲酸酯联合应用的作用。因此，用99mTc-洗脱液(1.5ml)、龙胆酸(5mg，在0.2ml BSI中)和BSI(1.5ml)重新配制1小管MyoviewTM试剂盒。按照实施例2的方式分析RCP，分析之间在环境温度下储存制剂。结果如下重新配制后时间15分钟 24小时99mTc-tetrofosmin的RCP 90.9％ 91.3％(n＝3)
权利要求
1.稳定的放射性药物组合物，含有(i)99mTc金属络合物；(ii)辐射防护剂，含有抗坏血酸、对氨基苯甲酸或龙胆酸或者它们与生物兼容性阳离子形成的盐；(iii)一种或多种式(I)的抗微生物防腐剂 其中R为C1-4烷基，M为H或生物兼容性阳离子。
2.权利要求1的稳定的放射性药物组合物，其中辐射防护剂为抗坏血酸或其与生物兼容性阳离子形成的抗坏血酸盐。
3.权利要求1或2的稳定的放射性药物组合物，其中99mTc金属络合物为阳离子、亲脂性99mTc络合物。
4.权利要求1和2的稳定的放射性药物组合物，其中99mTc金属络合物为中性物质。
5.权利要求3的稳定的放射性药物组合物，其中阳离子亲脂性99mTc金属络合物选自TcO2(tetrofosmin)2+和Tc(1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)6+。
6.权利要求1-5的稳定的放射性药物组合物，其中M为H。
7.权利要求6的稳定的放射性药物组合物，其中抗微生物防腐剂含有对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯或者它们的混合物。
8.权利要求7的稳定的放射性药物组合物，其中抗微生物防腐剂含有对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的混合物。
9.稳定的99mTc放射性药物组合物，其含有(i)TcO2(tetrofosmin)2+，(ii)辐射防护剂，其含有抗坏血酸或其与生物兼容性阳离子形成的抗坏血酸盐；(iii)一种或多种权利要求1的式(I)抗微生物防腐剂。
10.权利要求9的稳定的99mTc放射性药物组合物，其中抗微生物防腐剂含有对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的混合物。
11.适用于人体给药的无菌放射性药物制剂，其含有权利要求1-10任意一项的稳定的99mTc组合物，该组合物为溶液形式，置于预先填充的注射器中。
12.适用于人体给药的无菌放射性药物制剂，其含有置于容器中的权利要求1-10的任意一项的稳定的99mTc组合物。
13.用于制备权利要求11或12的无菌放射性药物组合物的非放射性试剂盒，其含有(i)形成99mTc金属络合物的配体；(ii)辐射防护剂，其含有抗坏血酸、对氨基苯甲酸或龙胆酸或其与生物兼容性阳离子形成的盐；(iii)权利要求1的式(I)的抗微生物防腐剂；其在一个或多个容器中以无菌形式提供。
14.权利要求13的非放射性试剂盒，其中配体选自tetrofosmin或1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷。
15.权利要求13和14的非放射性试剂盒，其中抗微生物防腐剂含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或者它们的混合物。
16.权利要求13-15的非放射性试剂盒，其中一种或多种试剂盒成分是冻干形式。
17.一种组合物的应用，所述组合物含有下列物质的混合物(i)辐射防护剂，其含有抗坏血酸、对氨基苯甲酸或龙胆酸或其与生物兼容性阳离子形成的盐；(ii)一种或多种式(I)的抗微生物防腐剂； 其中R为C1-4烷基，M为H或生物兼容性阳离子；从而能够稳定和抑制微生物在99mTc放射性药物制剂中的生长。
全文摘要
本发明涉及稳定的
文档编号A61K9/19GK1484534SQ01821609
公开日2004年3月24日 申请日期2001年4月11日 优先权日2000年12月28日
发明者A·M·福尔斯特, D·爱德华兹, O·K·耶尔斯图恩, A M 福尔斯特, 禄 , 耶尔斯图恩 申请人:阿默沙姆公开有限公司