一种用于检测DDX11基因突变的试剂盒及其专用捕获探针组的制作方法

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测ddx11基因突变的试剂盒及其专用捕获探针组。

背景技术：

尽管急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，aml)患者经过标准诱导方案化疗可以获得70％～80％的完全缓解率，但仅50％患者能被治愈。部分患者即使在强烈的诱导化疗及标准的巩固治疗甚至异基因造血干细胞移植后仍面临着疾病的进展和/或复发。分子诊断技术的发展在aml的精准分型和个体化治疗中起了巨大推动作用。但尽管如此，aml患者的临床预后仍然展示出巨大的异质性，复发仍然是临床医生及aml患者所共同面临的挑战之一，而新型生物学标记物的发现是实现aml个体化诊疗的必经之路。

ddx11(dead/h-boxhelicase11)基因定位于染色体12p11，编码一种atp依赖性的dna解螺旋酶，参与多种生物过程，如dna复制、dna修复和异染色质组织以及核糖体rna合成等，在维持基因组稳定性中起到重要作用。ddx11基因缺陷与许多影响基因组稳定性的疾病有关。人类ddx11基因的突变与华沙破裂综合征这一罕见的遗传疾病相关，伴随广泛的染色体断裂和染色单体凝聚缺陷。此外，越来越多的证据表明ddx11基因在肿瘤的发生发展中存在重要的作用。bhattacharya等报道在黑色素瘤从非侵袭性进展到高度恶性的侵袭性黑色素瘤的过程中，ddx11基因的表达量显著增高，通过ddx11-特异性si-rna敲低该基因在黑色素瘤细胞系wm1158中的表达，观察到黑色素瘤细胞增殖受抑，凋亡细胞增多。farinaa和parishjl等也采用ddx11靶向的si-rna干扰其在hela细胞系中的表达，观察到敲低组中hela细胞分裂过程中染色单体凝聚严重缺陷。但目前尚未见ddx11在血液肿瘤中的相关研究报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供用于检测ddx11基因突变的探针组。

本发明提供的用于检测ddx11基因突变的探针组由探针1-探针36组成：

所述探针1为序列表中序列1所示的单链dna分子；

所述探针2为序列表中序列2所示的单链dna分子；

所述探针3为序列表中序列3所示的单链dna分子；

所述探针4为序列表中序列4所示的单链dna分子；

所述探针5为序列表中序列5所示的单链dna分子；

所述探针6为序列表中序列6所示的单链dna分子；

所述探针7为序列表中序列7所示的单链dna分子；

所述探针8为序列表中序列8所示的单链dna分子；

所述探针9为序列表中序列9所示的单链dna分子；

所述探针10为序列表中序列10所示的单链dna分子；

所述探针11为序列表中序列11所示的单链dna分子；

所述探针12为序列表中序列12所示的单链dna分子；

所述探针13为序列表中序列13所示的单链dna分子；

所述探针14为序列表中序列14所示的单链dna分子；

所述探针15为序列表中序列15所示的单链dna分子；

所述探针16为序列表中序列16所示的单链dna分子；

所述探针17为序列表中序列17所示的单链dna分子；

所述探针18为序列表中序列18所示的单链dna分子；

所述探针19为序列表中序列19所示的单链dna分子；

所述探针20为序列表中序列20所示的单链dna分子；

所述探针21为序列表中序列21所示的单链dna分子；

所述探针22为序列表中序列22所示的单链dna分子；

所述探针23为序列表中序列23所示的单链dna分子；

所述探针24为序列表中序列24所示的单链dna分子；

所述探针25为序列表中序列25所示的单链dna分子；

所述探针26为序列表中序列26所示的单链dna分子；

所述探针27为序列表中序列27所示的单链dna分子；

所述探针28为序列表中序列28所示的单链dna分子；

所述探针29为序列表中序列29所示的单链dna分子；

所述探针30为序列表中序列30所示的单链dna分子；

所述探针31为序列表中序列31所示的单链dna分子；

所述探针32为序列表中序列32所示的单链dna分子；

所述探针33为序列表中序列33所示的单链dna分子；

所述探针34为序列表中序列34所示的单链dna分子；

所述探针35为序列表中序列35所示的单链dna分子；

所述探针36为序列表中序列36所示的单链dna分子。

上述探针组中，所述每条探针均标记生物素。具体的，所述每条探针的5’端均标记生物素。

本发明的另一个目的是提供用于检测ddx11基因突变的试剂盒。

本发明提供的用于检测ddx11基因突变的试剂盒包括上述探针组。

进一步的，所述试剂盒还可包括构建文库所需的试剂和/或pcr扩增所需试剂。所述构建文库所需的试剂具体可包括末端修复所需试剂、加a尾所需试剂。所述pcr扩增所需试剂具体可为kapahifihotstartreadymix(2x)试剂盒(kapa，kk2602)中的试剂。

更进一步的，所述试剂盒还可包括基因组dna提取所需试剂和/或纯化试剂。

本发明还有一个目的是提供上述探针组或上述试剂盒或检测ddx11基因是否发生突变的物质的新用途。

本发明提供了上述探针组或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样本中ddx11基因突变或变异中的应用。

本发明还提供了上述探针组或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样本中ddx11基因突变或变异的产品中的应用。

本发明还提供了上述探针组或上述试剂盒在检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病中的应用。

本发明还提供了上述探针组或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品中的应用。

本发明还提供了检测ddx11基因是否发生突变的物质在诊断或辅助诊断急性髓系白血病中的应用。

本发明还提供了检测ddx11基因是否发生突变的物质在制备诊断或辅助诊断急性髓系白血病的产品中的应用。

本发明还提供了检测ddx11基因是否发生突变的物质在检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病中的应用。

本发明还提供了检测ddx11基因是否发生突变的物质在制备检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品中的应用。

ddx11基因作为靶标在急性髓系白血病诊断中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是提供检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品。

本发明提供的检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品包括检测ddx11基因是否发生突变的物质。

上述应用或产品中，所述检测ddx11基因是否发生突变的物质为上述探针组。

上述应用或产品中，若待测患者ddx11基因发生突变或变异，则待测患者患有或候选患有急性髓系白血病。所述突变或变异的类型具体可为下述实施例的表2中所示。

本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本中ddx11基因突变或变异的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样本中ddx11基因突变或变异的方法包括如下步骤：

1)将待测样本的基因组dna进行片段化后，构建gdna文库；

2)用上述探针组与所述gdna文库杂交，得到杂交产物；

3)对所述杂交产物进行测序，根据测序结果分析待测样本中ddx11基因的突变或变异情况。

上述方法中，所述1)中，所述片段化为将基因组dna打断成长度为200-300bp的片段。

所述gdna文库的构建方法可按照如下步骤进行：将片段化的dna片段进行末端修复；然后将“a”碱基加入到dna片段的3’末端；最后在dna片段两端分别连接上带有特异index的接头，得到连接产物；纯化连接产物，并对纯化后的连接产物进行pcr扩增，得到带有特异index的dna文库。

所述2)中，所述探针组中的各探针的摩尔量相同。

所述2)或所述3)之间还包括如下步骤：使用带链霉素的磁珠捕获杂交产物中的目的dna片段，并采用kapahifihotstartreadymix(2x)试剂盒对捕获的dna片段进行pcr线性扩增，扩增产物经质检合格后即可进行测序。

所述3)中，所述测序为利用illuminahiseq平台进行pe150测序。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述ddx11基因突变可为ddx11体细胞突变和ddx11胚系突变。所述ddx11基因突变包括单个核苷酸变异、小片段插入缺失和拷贝数变异。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述待测样本可为来源于待测患者的外周血或骨髓。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述ddx11基因序列如序列表的序列37所示，所述ddx11基因编码区序列如序列表的序列38所示，所述ddx11基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表的序列39所示。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述ddx11基因突变或变异具体可为如下(1)-(14)中的至少一种：

(1)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第1222位核苷酸由g突变为a；

(2)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第947位核苷酸由c突变为t；

(3)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第637位核苷酸由a突变为g；

(4)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第572位核苷酸由a突变为c；

(5)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第1087位核苷酸由c突变为a；

(6)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第2146位核苷酸由g突变为a；

(7)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第2291位核苷酸由g突变为t；

(8)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第2476位核苷酸由c突变为t；

(9)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第545位核苷酸由c突变为g；

(10)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第697位核苷酸由a突变为g；

(11)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第821位核苷酸由g突变为a；

(12)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第487-489位核苷酸缺失；

(13)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第641-642位核苷酸中间插入ggatga(nm_001257144(ddx11):c.641_642insggatga(p.v214delinsvde))；

(14)野生型ddx11基因(序列表的序列38)第781位核苷酸g缺失(nm_001257144(ddx11):c.781delg(p.g261fs))。

本发明提供了一种用于检测ddx11基因突变的试剂盒，所述试剂盒不仅可以用于检测肿瘤基因组层面的体细胞突变和胚系突变，且检测方法简便、灵敏，还可用于血液肿瘤患者(特别是aml患者)的辅助诊断、微小残留病监测和预后的评估等，将在医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为ddx11基因部分突变类型的sanger测序验证结果。图1a为样本0951d：nm_001257144(ddx11):c.487_489del(p.163_163del)，exon5，delgaa。图1b为样本338b：nm_001257144(ddx11):c.641_642insggatga(p.v214delinsvde)，exon6，insggatga。图1c为样本2798e：nm_001257144(ddx11):c.781delg(p.g261fs)，exon7，delg。图1d为样本1032b：nm_001257144(ddx11):c.947c>t(p.p316l)，exon9，c>t。图1e为样本1682b：nm_001257144(ddx11):c.1087c>a(p.q363k)，exon9，c>a。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、检测ddx11基因突变的试剂盒及其检测方法

一、检测ddx11基因突变的试剂盒

1、探针序列

本发明的用于检测ddx11基因突变的试剂盒中包括36个探针序列，36个探针序列的名称及具体序列如表1所示。本发明的36条探针可覆盖ddx11基因的全部编码序列。

表1、本发明的检测试剂盒中探针序列

2、目标区域检测原理

将待测样本的基因组dna经covaris超声破碎仪随机打断成长度为200-300bp的片段，末端修复和加a尾后在片段两端分别连接上接头制备dna文库。将步骤1中的探针进行生物素标记，然后将带有特异index的dna文库与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将外显子捕获下来，经pcr线性扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。后续利用illuminahiseq平台进行pe150测序，得到的测序数据利用相关生物信息学软件检出目标基因ddx11突变或变异情况。

二、检测ddx11基因突变的方法

(一)检测方法

1、检测样本

本实施例中的检测样本为310例来源于北京大学人民医院的急性髓系白血病(aml)患者，所有患者均经临床诊断确定，诊断标准依据世界卫生组织新的分型标准，且患者知情同意。

2、dna样品的提取及检测

分别提取上述患者的外周血或骨髓的基因组dna，并对dna样品进行检测。检测主要包括3种方法：

1)毛细管电泳分析dna降解程度；

2)nanodrop检测dna的纯度(od260/od280比值)；

3)qubit对dna浓度进行精确定量。

其中od260/od280值在1.8～2.0之间，dna浓度≥20ng/μl，总量1μg以上的dna样品被用来建库。

3、文库构建及目标基因捕获

(1)对基因组dna进行片段化处理，将基因组dna经covaris超声破碎仪随机打断成长度为200-300bp的片段；

(2)对步骤(1)获得的片段化的双链dna进行末端修复；然后将“a”碱基加入到dna片段的3’末端；最后在dna片段两端分别连接上带有特异index的接头，得到连接产物；纯化连接产物以除去未连接的接头序列，采用kapahifihotstartreadymix(2x)试剂盒(kapa，kk2602)对纯化后的连接产物进行pcr扩增，并纯化pcr产物，得到带有特异index的dna文库；

(3)将表1中的各探针的5’端均进行生物素标记，得到生物素标记的探针。然后将带有特异index的dna文库与生物素标记的探针进行液相杂交，捕获目的dna片段；

(4)使用带链霉素的磁珠(dynabeads^tmm-270streptavidin，invitrogen，65305)捕获杂交的目的dna片段并分离纯化(ampurexpbeads，beckman，a63882)，除去未结合的dna片段；

(5)采用kapahifihotstartreadymix(2x)试剂盒(kapa，kk2602)对捕获的dna片段进行pcr扩增，并纯化pcr产物。

4、文库质检

文库构建完成后进行质量检测：先使用qubit4.0进行初步定量，随后使用agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。

5、上机测序

库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行illuminahiseqpe150测序。pe150(pairend150bp)为高通量双端测序，每端各测150bp。在构建的小片段文库中插入dna，即插入片段是高通量测序直接测序的片段。双端测序是将每条插入片段的两端进行测序的方法。

6、生物信息分析流程

测序结束获得原始测序序列(rawdata)后，进入信息分析流程，流程可概括为三个主要阶段：

1)测序数据质量控制：主要通过对测序质量、测序错误率、数据量、比对率、覆盖率等进行统计，评估测序数据是否达到了质控标准，符合标准则进行后续的分析；

2)变异检测：将高质量的序列比对到人参考基因组(grch37)上，对比对数据进行质量校正和去除duplication，然后检测样本中的变异信息。利用gatk软件检测germline胚系突变，利用mutect2软件检测somaticsnv以及indel；

3)变异注释和过滤：采用annovar软件对检测变异进行注释，包括基因、hgvs、人群频率、变异类型等。此外，需要对检出的变异进行过滤，保留对蛋白有影响(如错义突变，移码突变等)且在正常人群位点突变频率<1％的位点。

(二)检测结果

310例急性髓系白血病(aml)患者中共检出ddx11基因突变型患者23例，突变检出率为7.4％(23/310)，为首次在成人正常核型aml报道的高频突变基因。

23例ddx11突变阳性患者具体突变情况如下：

4例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第1222位核苷酸由g突变为a。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第408位氨基酸由v突变为m；

4例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第947位核苷酸由c突变为t。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第316位氨基酸由t突变为l；

3例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第637位核苷酸由a突变为g。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第213位氨基酸由r突变为g；

2例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第572位核苷酸由a突变为c。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第191位氨基酸由e突变为a；

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第1087位核苷酸由c突变为a。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第363位氨基酸由q突变为k。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第2146位核苷酸由g突变为a。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第716位氨基酸由v突变为i。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第2291位核苷酸由g突变为t。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第764位氨基酸由g突变为v。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第2476位核苷酸由c突变为t。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第826位氨基酸由p突变为s。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第545位核苷酸由c突变为g。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第182位氨基酸由p突变为r。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第697位核苷酸由a突变为g。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第233位氨基酸由s突变为g。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第821位核苷酸由g突变为a。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第274位氨基酸由s突变为n。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第487-489位核苷酸缺失。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第163位氨基酸缺失。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第641-642位核苷酸中间插入ggatga。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第214位氨基酸由v突变为vde。

1例：与野生型ddx11基因的编码区(序列表的序列38)的区别在于：第781位核苷酸g缺失。与野生型ddx11蛋白的区别在于：第261位氨基酸g后发生移码突变。

表2展示了23例ddx11基因突变检出详情。

表2、ddx11基因在23个aml样本中检出突变情况

对23例突变患者所涉及的全部14种突变类型中的5种进行了sanger测序验证。部分测序结果如图1所示。测序结果表明：本发明方法得到的检测结果与sanger测序法得到的结果完全一致。说明本发明得到的ddx11基因突变检测结果是正确的。

上述结果表明：本发明的探针组可以有效检测出待测样本中的ddx11基因突变情况，在急性髓系白血病的辅助诊断中可发挥重要作用。

序列表

<110>北京大学人民医院（北京大学第二临床医学院）

<120>一种用于检测ddx11基因突变的试剂盒及其专用捕获探针组

<160>39

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

catggctaatgaaacacagaaggttggtgccatccattttccttttcccttcacacccta60

ttccatccaggaagacttcatggcagagctgtaccgggttttggaggctggcaagattgg120

<210>2

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggtgccatccattttccttttcccttcacaccctattccatccaggaagacttcatggca60

gagctgtaccgggttttggaggctggcaagattgggatatttgagagtccaactggcact120

<210>3

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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gaagcgtgaagaagaggcacgactccttgaaactggaactggccccttacatgatgagaa120

<210>4

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agatgaatccctgtgtctgtcttcttcctgcgaaggggctgcaggcaccccgaggcctgc60

tggagaaccggcctgggttactcagtttgtgcagaagaaagaagagagggacctggtgga120

<210>5

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctgtgtctgtcttcttcctgcgaaggggctgcaggcaccccgaggcctgctggagaaccg60

gcctgggttactcagtttgtgcagaagaaagaagagagggacctggtggaccgactaaag120

<210>6

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ggcggagcaggccaggaggaagcagcgagaagaacgcctgcagcagctgcagcacagggt60

gcagctcaagtatgcagccaagcgcctggtgagcctcatttcttggggggcaggattatg120

<210>7

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gaggcaggaagaagaagaaagagagaatctcctccgcctcagcagggagatgctagagac60

aggcccggaggctgagcggctggagcagctggagtctggggaggaggagctggtcctcgc120

<210>8

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

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cagcagggagatgctagagacaggcccggaggctgagcggctggagcagctggagtctgg60

ggaggaggagctggtcctcgccgaatacgagagtgatgaggagaaaaaggtggcgagcag120

<210>9

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<212>dna

<213>人工序列

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cctcagctggtgctgtgctgggggtataggctgggctgtgcacccctggggaggaggctg120

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<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

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<213>人工序列

<400>11

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<213>人工序列

<400>12

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<210>13

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<212>dna

<213>人工序列

<400>13

ggccttctccgggatgaggccctggcagaggtgaaggacatggagcagctgctggccctt60

gggaaggaggcccgggcctgtccctattacgggagccgccttgccatccctgcagcccag120

<210>14

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

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<210>15

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<212>dna

<213>人工序列

<400>15

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<210>16

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<212>dna

<213>人工序列

<400>16

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cctctgaggtagtgggacagtcccttggtggccccctgcgtgggcctctgagaggcaggc120

<210>17

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ggaagcgtttgaaggccaagaacctgatgtacctgaagcagatcctgtatttgctggaga60

aattcgtggctgtgctagggggtgagagcctcgtccccctgctgaccccgggcctgcaaa120

<210>18

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gggaacattaagcaaaatcccaatacacagagtctgtcacagacaggtaagagagttgcc60

ctcagagggcccagagctgatctgagccacttccgagcttaaccctgggactgaaacctg120

<210>19

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

gggacggagctgaagaccatcaacgactttctcttccagagccagatcgacaacatcaac60

ctgttcaaggtagaggtttccacctttccacattccacatccaatttccttcctgtcacc120

<210>20

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ggtgcagcgatactgtgagaagagcatgatcagcagaaaggtaactgctcccatcttgtg60

gtcctgaacaagacccagctgtgccccaaccccctgcccttgccatgctttcctcccctg120

<210>21

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

gctctttggattcactgaacggtacggagcagtgttctcatcccgggagcagcccaaact60

ggctgggtttcagcaattcctgcagagcctgcagcccaggacgactgaaggtgaggcagg120

<210>22

<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

gctcttgcagcccctgcagacgagagtcaggccagcaccctgcgaccagcttctccactg60

atgcacatccaaggcttcctggcagctctcactacggccaaccaggacggcagggtcatc120

<210>23

<211>120bp

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<213>人工序列

<400>23

ctgcagacgagagtcaggccagcaccctgcgaccagcttctccactgatgcacatccaag60

gcttcctggcagctctcactacggccaaccaggacggcagggtcatcctgagccgccaag120

<210>24

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<212>dna

<213>人工序列

<400>24

ggcagcctcagtcagagcaccctgaagtttttgctcctgaatccagctgtgcactttgcc60

caagtggtgaaggaatgccgggcagtggtcattgcggggggtaccatgcagccggtaagg120

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<212>dna

<213>人工序列

<400>25

ggtgtctgacttccggcagcagctgctggcctgtgccggggtggaagctgagcgcgtggt60

ggagttttcctgtggtgagaagctgtgcccagggtggggcaggctagaggtcaggttctg120

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<213>人工序列

<400>26

ggtcacgtgatccctccagacaacatcctgcccctcgtcatctgcagcgggatctccaac60

cagccgctggaattcacgttccagaaaagagagctgcctcagatggtcagtcccagccag120

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<213>人工序列

<400>27

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ctgtttcttcccctcctacgagtacctgcgccaggtccatgcccactgggagaagggtgg120

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<211>120bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

ctgtgcggtgtggttcctggaggggtggtctgtttcttcccctcctacgagtacctgcgc60

caggtccatgcccactgggagaagggtggcctgctgggccgtctggctgccaggaagaag120

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<212>dna

<213>人工序列

<400>29

gatattccaggaacctaagagcgcacaccaggtggagcaggtgctgctggcatattccag60

gtgcatccaggtgcgggcgtcatgctgggcttgggtctgagatcgtgtgggggtggcagc120

<210>30

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<212>dna

<213>人工序列

<400>30

ggcctgtggccaggagagaggccaggtgacaggggccctgctcctctctgtggttggagg60

aaagatgagtgaagggatcaacttctctgacaacctaggccggtaagtagtggttctgct120

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<211>120bp

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<213>人工序列

<400>31

ggtgtgtggtgatggtgggcatgcccttccccaacatcaggtctgcagagctgcaggaga60

agatggcctacttggatcaaaccctcgtgagtgaccccagtgtcacagagggtgacagga120

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<213>人工序列

<400>32

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tcaaccagtccataggtgagcctggctgcctccagctgggtggacagatgggggctggag120

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<211>120bp

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<213>人工序列

<400>33

ggcagggccatcaggcaccagaaggattttgccagcgtagtgctcctggaccagcgatat60

gcccggccccctgtcctggccaagctgccggcctggatccgagcccgtgtggaggtcaaa120

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<211>120bp

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<400>34

gtagtgctcctggaccagcgatatgcccggccccctgtcctggccaagctgccggcctgg60

atccgagcccgtgtggaggtcaaagctacctttggccccgccattgctgctgtgcagaag120

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<213>人工序列

<400>35

gtttcaccgggagaagtcggcctcttcctgatgggcaaccacaccactgcctggcgccgt60

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<212>dna

<213>人工序列

<400>36

gtctgcggggatcctgttacaaaggtgaaacccaggaggagagtgtggagtccagagtgc60

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<211>3823

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>37

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tcagtggcgtttgccctgattcccggggcctggctttcagcgtagcaattctgccggcga120

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ataaaagtgtgctgttggttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3823

<210>38

<211>2913

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>38

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tccatccaggaagacttcatggcagagctgtaccgggttttggaggctggcaagattggg120

atatttgagagtccaactggcactgggaagtccttaagtcttatttgtggggccctctct180

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gaagaacgcctgcagcagctgcagcacagggtgcagctcaagtatgcagccaagcgcctg480

aggcaggaagaagaagaaagagagaatctcctccgcctcagcagggagatgctagagaca540

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gaatacgagagtgatgaggagaaaaaggtggcgagcagagtggatgaggatgaggatgac660

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caggagagaggccaggtgacaggggccctgctcctctctgtggttggaggaaagatgagt2340

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tcccgtaggagaaaatgggggaatcctgaatga2913

<210>39

<211>970

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>39

metalaasngluthrglnlysvalglyalailehispheprophepro

151015

phethrprotyrserileglngluaspphemetalagluleutyrarg

202530

valleuglualaglylysileglyilephegluserprothrglythr

354045

glylysserleuserleuilecysglyalaleusertrpleuargasp

505560

phegluglnlyslysargglugluglualaargleuleugluthrgly

65707580

thrglyproleuhisaspglulysaspgluserleucysleuserser

859095

sercysgluglyalaalaglythrproargproalaglygluproala

100105110

trpvalthrglnphevalglnlyslysglugluargaspleuvalasp

115120125

argleulysalagluglnalaargarglysglnargglugluargleu

130135140

glnglnleuglnhisargvalglnleulystyralaalalysargleu

145150155160

argglnglugluglugluarggluasnleuleuargleuserargglu

165170175

metleugluthrglyproglualagluargleugluglnleugluser

180185190

glygluglugluleuvalleualaglutyrgluseraspgluglulys

195200205

lysvalalaserargvalaspgluaspgluaspaspleuglugluglu

210215220

hisilethrlysiletyrtyrcysserargthrhisserglnleuala

225230235240

glnphevalhisgluvallyslysserpropheglylysaspvalarg

245250255

leuvalserleuglyserargglnasnleucysvalasngluaspval

260265270

lysserleuglyservalglnleuileasnaspargcysvalaspmet

275280285

glnargserarghisglulyslyslysglyalaglugluglulyspro

290295300

lysargargargglnglulysglnalaalacysprophetyrasnhis

305310315320

gluglnmetglyleuleuargaspglualaleualagluvallysasp

325330335

metgluglnleuleualaleuglylysglualaargalacysprotyr

340345350

tyrglyserargleualaileproalaalaglnleuvalvalleupro

355360365

tyrglnmetleuleuhisalaalathrargglnalaalaglyilearg

370375380

leuglnaspglnvalvalileileaspglualahisasnleuileasp

385390395400

thrilethrglymethisservalgluvalserglyserglnleucys

405410415

glnalahisserglnleuleuglntyrvalgluargtyrglylysarg

420425430

leulysalalysasnleumettyrleulysglnileleutyrleuleu

435440445

glulysphevalalavalleuglyglyasnilelysglnasnproasn

450455460

thrglnserleuserglnthrglythrgluleulysthrileasnasp

465470475480

pheleupheglnserglnileaspasnileasnleuphelysvalgln

485490495

argtyrcysglulyssermetileserarglysleupheglyphethr

500505510

gluargtyrglyalavalpheserserarggluglnprolysleuala

515520525

glypheglnglnpheleuglnserleuglnproargthrthrgluala

530535540

leualaalaproalaaspgluserglnalaserthrleuargproala

545550555560

serproleumethisileglnglypheleualaalaleuthrthrala

565570575

asnglnaspglyargvalileleuserargglnglyserleusergln

580585590

serthrleulyspheleuleuleuasnproalavalhisphealagln

595600605

valvallysglucysargalavalvalilealaglyglythrmetgln

610615620

provalserasppheargglnglnleuleualacysalaglyvalglu

625630635640

alagluargvalvalgluphesercysglyhisvalileproproasp

645650655

asnileleuproleuvalilecysserglyileserasnglnproleu

660665670

gluphethrpheglnlysarggluleuproglnmetmetaspgluval

675680685

glyargileleucysasnleucysglyvalvalproglyglyvalval

690695700

cysphepheprosertyrglutyrleuargglnvalhisalahistrp

705710715720

glulysglyglyleuleuglyargleualaalaarglyslysilephe

725730735

glngluprolysseralahisglnvalgluglnvalleuleualatyr

740745750

serargcysileglnalacysglyglngluargglyglnvalthrgly

755760765

alaleuleuleuservalvalglyglylysmetsergluglyileasn

770775780

pheseraspasnleuglyargcysvalvalmetvalglymetprophe

785790795800

proasnileargseralagluleuglnglulysmetalatyrleuasp

805810815

glnthrleuserproargproglythrproarggluglyserglygly

820825830

gluprovalhisgluglyargglnprovalhisargglnglyhisgln

835840845

alaprogluglyphecysglnargseralaproglyproalailecys

850855860

proalaprocysproglyglnalaalaglyleuaspproserprocys

865870875880

glyglyglnsertyrleutrpproarghiscyscyscysalagluval

885890895

serproglygluvalglyleupheleumetglyasnhisthrthrala

900905910

trpargargalaleuproleusercysproleugluthrvalpheval

915920925

valglyvalvalcysglyaspprovalthrlysvallysproargarg

930935940

argvaltrpserproglucyscysglnaspproglythrglyvalser

945950955960

serargargarglystrpglyasnproglu

965970