一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，特别是指一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用。

背景技术：

随着社会经济发展和饮食结构的改变，胃肠道恶性肿瘤的发病率逐年上升。胃肠道恶性肿瘤包括胃癌和结直肠癌。2018年最新统计数据显示，胃癌和结直肠癌分别位居我国癌症发病率和死亡率的第三位和第四位，严重威胁人民的生命健康。胃肠道作为人体消化和吸收营养最重要的器官，其恶性肿瘤的发生有着相似的病理生理学基础。目前对其发生的机制虽已取得一系列进展，但确切病因尚不能完全明确，目前多认为是环境、遗传、免疫及内分泌等多重因素共同作用的结果。其中胃癌的发生多与幽门螺杆菌的感染相关，临床上约65%的胃癌患者可检测到幽门螺杆菌感染。此外胃癌的发生与地域环境和饮食生活因素有关。在我国北方胃癌发病率高于南方，长期食用富含亚硝酸盐，多环芳烃化合物等致癌物的盐腌、熏烤食品会导致胃癌发病率升高，吸烟者和胃癌患者直系亲属的发病率也较高。结直肠癌的发生与高脂肪低纤维素饮食、肥胖、吸烟、饮酒、2型糖尿病、炎症性肠病、大肠腺瘤、家族性息肉病等多种因素相关。

在胃肠道恶性肿瘤发生的早期阶段，通过外科切除术或联合放疗、化疗、靶向治疗、免疫疗法等，早期胃癌和结直肠癌的平均治愈率可分别达到85%和65%以上。但到目前为止，中晚期胃肠道恶性肿瘤患者的临床预后仍然较差。胃镜、肠镜检查，b超及ct等检查手段都能有效发现早期胃肠道恶性肿瘤，因此近几十年来此类疾病的死亡率已呈明显下降趋势。但胃肠道恶性肿瘤起病隐匿，在潜伏期没有明显症状，当出现明显症状时多已进展至中晚期，治疗难度大，这也是导致我国胃癌和结直肠癌患者5年生存率低于全球水平的重要原因之一。因此筛选有效的分子标志物并揭示其在胃肠道恶性肿瘤发生中的作用机制，对于此类疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。

wnt4属于wnt家族成员之一，通过激活非经典wnt信号通路在骨骼、肾脏、女性生殖系统的苗勒管及多种分泌性腺体的发育过程中发挥重要调控作用。目前已明确wnt4基因突变与雄激素增多症、肾脏和尿道先天异常、掌挛缩症等遗传性疾病的发生密切相关。此外，wnt4在调控细胞分化、细胞迁移运动等细胞学行为中也发挥重要作用。wnt4基因表达异常还参与多种恶性肿瘤的发生、侵袭、转移、肿瘤血管生成及淋巴组织侵犯等病理过程。研究表明，wnt4在多种实体瘤中主要发挥抑癌作用。wnt4基因在食管鳞癌组织中的表达水平降低，wnt4/jnk1信号通路的激活水平与食管鳞癌的病理分期、淋巴转移、浸润深度等指标呈负相关。类似地，wnt4在白血病细胞中表达水平也明显降低，过表达wnt4基因会诱导白血病细胞停滞于g1期进而抑制其恶性增殖。促肾上腺皮质激素细胞腺瘤组织中wnt4的表达水平也发生降低，过表达wnt4可以抑制癌细胞的侵袭能力。但也有研究表明，wnt4在某些肿瘤的发生中起着促癌基因的角色。在侵袭性小叶性乳腺癌细胞中过表达wnt4基因会通过激活nf-κb信号通路促进癌细胞的增殖。因此wnt4基因的作用具有一定的组织特异性，需要根据特定的肿瘤类型进行确定。

因此本发明将检测wnt4基因在胃肠道恶性肿瘤组织中的表达情况，旨在为胃肠道恶性肿瘤检测及风险提示提供新的诊断标志物，并在此基础上研究过表达wnt4基因对胃肠道恶性肿瘤发生的影响，旨在为胃肠道恶性肿瘤的治疗提供新的药物靶向，这对于提高胃肠道恶性肿瘤的早期诊断率及改善胃肠道恶性肿瘤患者的生存状况具有潜在价值。

技术实现要素：

本发明提出一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用，促进现胃肠道恶性肿瘤的早期诊断试剂及试剂盒的研究，及制备抑制胃肠道恶性肿瘤基因药物的开发中的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种胃肠道恶性肿瘤标志物，所述胃肠道恶性肿瘤标志物为wnt4。

所述胃肠道恶性肿瘤为人类的胃肠道恶性肿瘤组织，包括胃癌、结直肠癌。

所述的标志物作为制备早期诊断胃肠道恶性肿瘤试剂的应用，以wnt4的荧光定量pcr引物对，以待测样本的cdna为模板进行荧光定量pcr反应，测得wnt4扩增的ct值，并以内参基因β-actin的ct值进行标准化校正，鉴定待测样本。

所述荧光定量pcr引物对为：正向引物如seqidno：1所示，反向引物如seqidno：2所示。

标志物作为制备抑制胃肠道恶性肿瘤药物方法，步骤如下：

（1）以wnt4为目标调控基因，构建过表达wnt4基因的载体；

（2）利用步骤（1）中的载体，制备用于离体施用或体内施用的药物。

所述步骤（1）中过表达wnt4基因包括激活或过表达wnt4编码基因，增加wnt4基因的拷贝数，激活或提高wnt4基因的转录和翻译功能，以及促进wnt4蛋白功能发挥的一种或多种基因。

所述步骤（1）中载体为病毒载体或非病毒基因沉默载体；病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或疱疹病毒载体；非病毒基因过表达载体为crispr系统基因激活载体、质粒dna过表达载体或在此基础上改造的载体。

本发明的有益效果在于：

第一：本发明通过可靠的荧光定量pcr方法，筛选发现wnt4在胃肠道恶性肿瘤组织中的表达水平明显降低，该方法的灵敏度高，特异性强，可作为胃肠道恶性肿瘤临床早期诊断的标志物。

第二：本发明通过大量的实验数据证明，wnt4在胃肠道恶性肿瘤的发生过程中发挥抑癌基因的作用，过表达wnt4基因表达能够显著抑制胃肠道恶性肿瘤细胞的增殖和迁移能力，以及在裸鼠体内的成瘤能力，wnt4可望成为新的防治胃肠道恶性肿瘤的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为荧光定量pcr分析wnt4在不同类型胃肠道恶性肿瘤组织及癌旁正常组织中的mrna表达情况；（图a）胃腺癌组织及癌旁正常组织（n=15）；（图b）结直肠腺癌组织及癌旁正常组织（n=15）；β-actin作为wnt4的内参对照基因。

图2为荧光定量pcr分析，a：在结直肠癌hct-116细胞中转染wnt4-pex4过表达质粒后，细胞内wnt4基因mrna水平的变化；b：在结直肠癌hct-116细胞中转染wnt4-pex4质粒后，细胞内wnt4蛋白表达水平的变化。

图3为过表达wnt4基因对结直肠癌hct-116细胞增殖的影响，结直肠癌hct-116细胞转染wnt4-pex4的24，48，72小时后，癌细胞的增殖情况。

图4为划痕实验分析过表达wnt4基因对结直肠癌hct-116细胞迁移的影响；a：结直肠癌hct-116细胞转染wnt4-pex4的36、72小时后，癌细胞的愈合情况；b：结直肠癌hct-116细胞转染wnt4-pex4的36、72小时后，癌细胞的愈合率示意图。

图5为裸鼠体内成瘤实验分析过表达wnt4基因对结直肠癌hct-116细胞体内成瘤能力的影响；a：将稳定过表达wnt4基因的结直肠癌hct-116细胞或对照细胞接种至裸鼠体内后，移植瘤的实时增殖曲线。每3天测量一次瘤体大小，根据测得瘤体的长度和宽度计算瘤体体积（体积=1/2×长×宽²）。b：不同实验组瘤体的生长情况（代表性图片）及瘤体的重量。*p＜0.05，**p＜0.01。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所述的过表达wnt4基因包括激活wnt4的编码基因，增加wnt4基因的拷贝数，激活或提高wnt4基因的转录或翻译，以及促进wnt4蛋白功能发挥的整个生物过程。

在一些具体的实施方式中，所述药物可以加入一种或多种药学上可接受的佐剂，包括但不限于颗粒剂、缓冲剂、表面活性剂等公知的药物佐剂。

在一些具体的实施方式中，所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型，这些剂型可以按照药学领域常规的方法制备。

以下通过实施例进一步描述本发明，其中包括使用材料及具体来源。但应当理解的是，这些只是示例性的，而非限制本发明。与如下组织、细胞、试剂、仪器的类型及型号、或性质或功能相似或相同的材料均可以用于本发明的实施。

下述示例中的方法如无特殊说明均为普通方法。

主要材料：

注：除非另有所指，本发明中用到的试剂可以是任何合适的市售试剂；细胞系均可以通过市售获得。

一、wnt4的组织表达分析检测

1.癌症临床样品的采集

胃腺癌、结直肠腺癌组织对应的癌旁正常组织均采集自河南大学附属淮河医院。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，迅速切成小块于冻存管中置于液氮中保存备用。

2.rna抽提

每100mg组织加入1mltrireagent，置于冰上充分匀浆破碎组织块，室温下静置5分钟后，加入1/10倍trireagen体积的的bcp溶液，涡旋混匀15秒后室温静置10分钟。4℃，13,400g室温离心15分钟；将上清液转移至新的1.5ml离心管，加入等倍上清体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀数次后，室温静置10分钟，4℃，13400g离心10分钟后，吸除上清，加入500μl的75%乙醇水溶液，轻吹悬浮清洗rna，4℃，13400g离心5分钟沉淀rna。吸除上清后，置于室温通风处晾干，干燥5分钟左右。加入适量无rna酶水并置于55℃水浴10分钟，待充分溶解后测定od260和od280吸收值。一般认为a260/a280在1.8-2.1之间可以初步判定总rna质量较好。

3.荧光定量pcr检测wnt4水平

取2μgrna将其反转录成cdna。以cdna为模板，使用针对wnt4的引物及pcr2×sybrgreenqpcrmixture，在abi7500荧光定量pcr仪上进行扩增。pcr条件为：50℃20秒；95℃10分钟；95℃10秒；60℃1分钟，重复40个循环；测得样本wnt4扩增的ct值，以内参基因β-actin的ct值进行标准化校正。所得ct值使用2^-δ∆ct法进行计算，比较不同样本间wnt4含量的差异。所用wnt4正向引物如seqidno：1所述；wnt4反向引物如seqidno：2所述。内参对照β-actin正向引物如seqidno：3所述；内参对照β-actin反向引物如seqidno：4所述。

结果：如图1所示，与癌旁正常组织相比，wnt4基因的mrna水平在胃腺癌组织（图a）、结直肠腺癌组织（图b）中均明显降低，***p＜0.001。表明wnt4基因表达水平的异常降低与胃肠道恶性肿瘤的发生密切相关。

二、过表达wnt4基因可以明显抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力

1.细胞培养

人结肠癌细胞系hct-116细胞在dmem培养基（thermo,usa）中进行培养。培养基中含有10%胎牛血清（gibco,usa）、青霉素（100u/ml）和链霉素。所有细胞置于37℃培养箱、5%co2条件下培养。

2.细胞转染

hct-116细胞铺板约20小时后至60%左右密度后开始转染，转染设置wnt4-pex4过表达组、nc-pex4通用阴性对照组。所用转染试剂为脂质体2000，转染方法参照说明书进行。

3.细胞内wnt4基因mrna水平的检测

转染后继续培养36小时，收集细胞。按照实施例1中的方法，抽取细胞的总rna，反转录后利用荧光定量pcr的方法，检测转染后hct-116细胞内wnt4基因mrna水平的变化。

4.细胞内wnt4基因蛋白表达水平的检测

转染后继续培养48小时，消化后离心收集细胞。加100μl细胞裂解液裂解细胞，13200rpm，4℃离心15分钟，提取细胞总蛋白；检测蛋白浓度后，每组样本取20μg样本与4×sds-pageloadingbuffer混合，95℃加热处理5min。用10%的sds-page胶分离蛋白；电泳结束后，在transferbuffer中转膜60分钟；使用5%脱脂牛奶封闭印迹膜1小时，tbst洗涤3次后加稀释的一抗，4℃温育过夜；tbst洗涤3次后，加入适当的二抗稀释液，室温孵育1小时。tbst再次洗涤3次；经显影定影处理后，凝胶成像系统拍照，使用imagej软件对条带进行灰度分析处理。

结果：如图2所示，荧光定量pcr分析显示（图a），转染wnt4-pex4质粒可显著上调hct-116细胞内wnt4的mrna水平（*p＜0.05），并显著上调其蛋白表达水平（图b）（**p＜0.01）。该结果表明通过外源性方法在结肠癌细胞内过表达wnt4的水平是切实可行的。

三、过表达wnt4基因抑制结肠癌细胞的增殖能力

采用cck-8细胞增殖检测试剂盒检测细胞的增殖情况。将5×10⁵个hct-116细胞铺于6孔培养皿中，按照实施例2中的方法，转染wnt4-pex4质粒及nc-pex4阴性对照质粒。于转染后6小时消化细胞，将两个转染组细胞接种至96孔板中，1×10⁴/孔，每个转染组设置6个重复孔，并设置4个检测时间点。细胞贴壁后向每孔加入10μl的cck-8溶液，将培养板置于培养箱孵育4小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。随后分别在转染后24小时、48小时和72小时进行检测。根据测定的o.d值绘制细胞增殖曲线。

结果：如图3所示，与对照组相比，转染wnt4-pex4后24小时，hct-116细胞的增殖速度就开始出现减缓，此时两组细胞的生长速度已有统计学差异（*p＜0.05）。在转染后48小时和72小时，wnt4-pex4组细胞的生长速度显著低于对照组（**p＜0.01，***p＜0.001）。表明过表达wnt4基因可以有效抑制结肠癌细胞的增殖。由此我们推断，上调胃肠道恶性肿瘤组织内wnt4基因的表达或可有效抑制癌细胞的增殖。

四、过表达wnt4基因抑制结肠癌细胞的迁移能力

1.将hct-116细胞铺于6孔培养皿中，转染前细胞生长至60%左右密度为宜，按照实施例三中的方法，分别转染wnt4-pex4或nc-pex4通用阴性对照。转染6小时后用200μl无菌移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，pbs清洗三次去除划下的细胞，加入不含血清的培养基继续培养细胞。在4倍显微镜下先选一处划痕光滑的位置标记，并拍照记为0h对照，然后将培养皿置于培养箱继续培养，并在36小时和72小时采集相同位置细胞图像。用imageproplus6.0软件测量划痕的面积和宽度。

细胞的愈合率：(宽度1-宽度2)/宽度1，宽度1和宽度2分别为划痕在0小时和36/72小时的宽度，划痕宽度是划痕面积与长度的比值。

结果：如图4所示，与对照组相比，转染wnt4-pex436小时后，结肠癌细胞的划痕愈合率并无明显变化；转染后72小时，对照组细胞的划痕愈合率约为60%，而wnt4-pex4转染组细胞的划痕愈合率仅为40%左右（*p＜0.05），表明过表达wnt4基因能够明显抑制结肠癌细胞的迁移能力。因此上调胃肠道恶性肿瘤组织内wnt4基因的表达水平或可有效抑制癌细胞的扩散及转移。

五、过表达wnt4基因抑制结肠癌移植瘤在裸鼠体内的生长

如实施例一中的方法，在结直肠癌hct-116中分别转染wnt4-pex4质粒和nc-pex4对照质粒，2天后在培养基中加入50μg/ml的g418（遗传霉素），连续筛选15天后得到稳定过表达wnt4基因的稳转细胞系，扩大培养备用。购买6只4周龄雄性balb/c裸鼠，局部麻醉后在裸鼠腋窝和腹股沟部位的皮下注射150μl稳定过表达wnt4基因的hct-116悬液（含有1×10⁷个细胞）或对照细胞，3天后可观察到肉眼可见的瘤体长出，此后每3天测量一次肿瘤大小。24天后麻醉处死裸鼠，摘取瘤体并称重，比较不同处理组瘤体的大小。

结果：如图5所示，与对照组结直肠癌移植瘤相比，稳定过表达wnt4基因结直肠癌移植瘤的生长速度较慢，并且在注射后第18天时开始出现明显差异（*p＜0.05）。摘取瘤体称重后发现，稳定过表达wnt4基因组瘤体的重量明显较对照组低（*p＜0.05）。说明过表达wnt4基因能够明显抑制结直肠癌细胞在裸鼠内的成瘤速度，因此将上调wnt4基因表达作为抑制胃肠道恶性肿瘤的方法是切实可行的。

统计学分析：所有数据取三次独立重复实验的平均值，标准差（sd）利用graphpadprism8.0中的方法进行数据分析。p<0.05认为具有统计学意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>河南大学

<120>一种胃肠道恶性肿瘤标志物及其应用

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