一株戊糖片球菌ZF618及其应用的制作方法

本发明属于生物发酵技术领域、特别是食醋行业领域，具体涉及分离自天然米酒曲的戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618及其在液态深层发酵米醋生产中的应用。

背景技术：

米醋作为一种传统的发酵调味品，在中国具有长久的历史。我国市售的米醋多为利用传统米醋固态发酵工艺制作而成。固态发酵工艺制备的米醋营养丰富、色香味俱佳；但固态发酵工艺存在机械化程度低、劳动强度大、发酵周期长、原料利用率低的问题。随着科学技术的发展，深层液态发酵米醋工艺取得长足的进步，机械化程度高，产量高，尤以大量引进的德国frings食醋发酵工艺为代表。但由于液态深层发酵米醋在纯种及发酵模式下导致有益微生物的缺失，引起液态深层发酵米醋不挥发酸及总酯含量不足和口感刺激、香气缺失的问题，风味及口感远不如固态发酵米醋。

中国发明专利申请《一种食醋的生产工艺》(cn102807947a)公开了以酿造白酒为原料，使用糖、白酒和水混合，加入醋酸菌、红茶菌、乳酸菌等菌种，静置发酵制醋的工艺。非专利文献《液态深层发酵与固态发酵食醋风味差别探讨》(胡本高，《食品工业》，2004年05期，第27-28页)指出在原料配方中增加15％左右的豆粕或豆饼粉作为氮源，可以明显增加食醋的氨基酸含量，提升鲜味；中国发明专利申请《一种改良液态风味食醋的发酵制备方法》(cn106167756a)通过在酒醪制备过程中加入增香糖化曲、乳酸菌和酵母，提高液态发酵食醋中的不挥发酸含量改善食醋的风味。非专利文献《乳酸菌和酵母菌共酵改善食醋品质的研究》(蒋忠等，《中国酿造》，2015年，第34卷第9期，第104-108页)将酵母菌与乳酸菌共同发酵制备酒醪，可以明显提升酒醪中的乳酸含量，用该酒醪经液态深层法酿造的食醋不挥发酸和酯类含量得到明显提升，并最终改善了液醋的感官品质。中国发明专利申请《多菌种分段发酵食醋的制备工艺》(cn108300639a)公开了在食醋发酵过程中，通过在不同的发酵阶段加入麸曲、酒母、复合乳酸菌、醋酸菌等多菌种工艺制备食醋，食醋中的不挥发酸和酯类物质含量得到明显提高。非专利文献《高乳酸食醋酿造技术研究进展》(畅功民等，《中国酿造》，2016年第09期，第1-4页)指出乳酸对调节食醋风味协调性具有重要作用；在关键工艺环节进行特定乳酸菌种及代谢产物的靶向调控，调节食醋中醋酸和乳酸的合理配比，增加不挥发酸占比，可全面提升食醋风味的品质。这些专利文献或非专利文献通过原料的改变、多菌种发酵模式来提升食醋的品质，一方面，风味原料及多菌种的引入大大增加了生产成本，不经济；另一方面，由于外源性多菌种的引入，其在米醋发酵体系中的生存及作用能力均存在很大的不确定性；另外，外来菌群的引入可能会引起食品微生物的安全性问题。

中国发明专利《一株短小芽孢杆菌及其应用》(cn101974457b)公开了一株从镇江香醋醋醅中分离出的短小芽孢杆菌，该菌株经培养可产生乙酸、琥珀酸、苹果软及乳酸，在酿醋过程中添加该菌株，可提高原料的利用率、改善食醋的风味。中国发明专利申请《一株瑞士乳酸菌及其应用》(cn106119166a)从镇江香醋生产工艺过程中分离筛选得到一株瑞士乳杆菌，通过在醋醅中应用该菌，食醋中的乳酸含量得到明显提高，产品风味及口感得到改善。中国发明专利申请《一株适用于食醋酿造的发酵乳杆菌及其菌粉的制备方法和应用》(cn106190893a)公开了一株适用于食醋酿造的发酵乳杆菌，该菌种的使用可明显提高食醋或其他醋产品中的不挥发酸含量，改善产品风味和品质。中国发明专利《一株枯草芽孢杆菌及其应用》(cn101974458b)公开了一株从镇江香醋醋醅中分离出的枯草芽孢杆菌，该菌株经培养可产生乙酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸和乳酸，在酿醋过程中添加该菌株，可提高原料的利用率、改善食醋风味。硕士论文《乳酸菌的分离鉴定及在食醋酿造中的应用》(孙峰宇，天津科技大学，2013年，硕士论文)公开了从独流老醋的酒醅中分离得到一株有利于食醋发酵的优良乳酸菌微小魏斯氏菌(weissellaminor)，并将该乳酸菌与酵母菌协同发酵，探讨了乳酸菌对食醋改善口感和增强风味的作用。这类专利文献或非专利文献均通过从镇江香醋醋醅或独流老醋中分离的菌株来实现食醋风味的提升。然而镇江香醋或独流老醋均为固态发酵工艺食醋，固态发酵食醋体系中的菌株在纯液态米酒、米醋发酵模式下生长状态、发酵性能均存在很大的不确定性。

中国发明专利申请《一种食醋的酿造方法》(cn106520513a)公开了通过在控制发酵阶段的温度变化，加入不同的酶分解大分子物质，提高食醋的风味和澄清度。然而大量酶的引入，成本高昂。

目前液态深层发酵米醋在纯种及发酵模式下导致有益微生物的缺失，引起液态深层发酵米醋不挥发酸及总酯含量不足、口感刺激、香气缺失的问题。

技术实现要素：

本发明通过从天然米酒曲中分离、筛选与液态深层发酵米醋风味具有密切关系的菌株，并对其应用方式进行了研究。通过该菌株制备高含不挥发酸、风味前体物质的风味酒醪，提升液态深层发酵食醋的风味品质。

本发明不仅避免了外源风味物质的添加导致的成本上升及安全性问题；而且筛选所获菌株来源于天然米酒曲中，其适宜在液态深层发酵米醋的原料米酒的发酵体系中生长，因而避免了米酒外源菌群的引入可能导致拮抗等不确定性以及安全性问题。

本发明提供一种分离自天然米酒曲的戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618及其在液态深层发酵米醋生产中的应用，以解决液态深层发酵米醋在纯种及发酵模式下导致有益微生物的缺失，引起液态深层发酵米醋不挥发酸及总酯含量不足、口感刺激、香气缺失的问题。提升液态深层发酵米醋产品风味、质量。

本发明所涉及到的戊糖片球菌zf618，已于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60517，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

本发明通过以下技术方案予以实现：

1、候选菌株的分离；

本发明中的候选菌株通过稀释平板法进行分离获得；使用无菌采样瓶采样自然发酵而成的米酒曲，低温带回；立即使用无菌水分别稀释至10^-3、10^-4、10^-5，涂布于mrs固体培养基上；然后放入30℃的厌氧恒温培养箱中，培养48h；挑取候选菌落，进行平板划线分离，如此重复4至5次，直至获得纯的单菌落。将纯化的单株制备甘油管，于-70℃冰箱保存。

2、候选菌株的初筛——风味酒醪；

将候选菌株和酿酒酵母复配接种至大米液化醪中，25至35℃条件下发酵8至10d，发酵结束后，对发酵液中的不挥发酸含量进行测定，评估候选菌株在含醇条件下利用大米液化醪产生不挥发酸的能力差异。

3、候选菌株的复筛——风味米醋；

将所获风味酒醪经食醋液态深层发酵工艺制备成米醋，对米醋中的不挥发酸、香气成分进行测定，评估候选菌株在米醋中的应用效果。

4、本发明的戊糖片球菌的生物性特征如下：在mrs培养基平板上菌落突起，呈圆形，直径1-3mm，白色，不透明，湿润光滑(见图1)；菌体为革兰氏染色阳性球菌，呈单、双、堆状排列(见图2)。将所测16srrna序列(16srdna序列见seqidno：1)通过blast比对，使用mega4.1软件构件微生物系统进化树，鉴定其为戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)，并命名为pediococcuspentosaceuszf618。

5、候选菌株在液态深层发酵食醋中的应用；

本发明提供戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618在液态深层发酵米醋生产中的应用。

该应用方法包括以下步骤：

(1)一级种子液的制备：戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618的活化，将戊糖片球菌接种至经121℃、15min灭菌并冷却至常温的无菌mrs肉汤中；30℃条件下，静置培养12至48h，获得戊糖片球菌zf618一级种子液。

(2)大米液化醪的制备：将米醋原料大米按照质量比1:1至1:5加水，升温并保持92至95℃，加入体积比1‰至1％的液化酶，搅拌20至200min，完成原料的液化，降温至25至40℃，制备获得大米液化醪。

(3)二级种子液的制备：取步骤(2)中制备的大米液化醪，加入质量1‰至5％的酵母抽提物，于115℃条件下，灭菌10至20min；按照体积比的1‰至10％接种戊糖片球菌zf618种子液；在25至35℃条件下，静置培养12至48h后，获得戊糖片球菌zf618二级种子液。

(4)风味酒醪的制备：按照液化醪体积比的1‰至10％加入戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618培养液，控制发酵罐温度在25至35℃范围内，发酵12至48h。待结束后，往发酵罐中加入酿酒酵母，继续控温25至35℃，发酵3至15d后，压榨过滤获得富含不挥发酸、风味前体物质的风味酒醪。

(5)米醋的制备：使用步骤(4)制备的风味酒醪经过液态深层发酵食醋工艺制备获得富含不挥发酸、酯香浓郁的液态深层发酵米醋胚。

因此，在一个方面，本发明提供一株戊糖片球菌zf618，其于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno：60517。

在一个实施方案中，本发明提供戊糖片球菌zf618在食品发酵中的用途。

在又一个实施方案中，所述食品发酵为米醋发酵。

在另一个实施方案中，所述食品发酵为米酒发酵。

在另一个实施方案中，本发明提供戊糖片球菌zf618在米醋发酵中的用途。

在又一个实施方案中，其中所述戊糖片球菌zf618用于在米醋发酵初期接入。

在另一个实施方案中，本发明提供戊糖片球菌zf618在制备米醋中的用途。

在另一方面，本发明提供一种米醋，其采用戊糖片球菌zf618与酿酒酵母共同发酵获得。

在又一方面，本发明提供一种制备米醋的方法，其包括采用戊糖片球菌zf618与酿酒酵母共同发酵。

在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含戊糖片球菌zf618。

在又一方面，本发明提供本发明的包含戊糖片球菌zf618的组合物在制备米醋中的用途。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

(1)在米酒发酵期间，将戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618接入到酒精发酵体系中，能够明显提升酒醪风味。本发明经济、高效地解决了液态深层发酵米醋在发酵及菌种单一模式下不挥发酸及总酯含量不足、口感刺激、香气缺失的问题。

(2)通过从传统风味良好的天然酒曲中筛选有益菌株来制备风味酒醪，避免了外源菌群的引入。这对保证液态深层发酵米醋的食品安全性具有重要意义。

(3)该菌株产酸、产香速度快，培养条件简单，易于工业化生产；在液体深层发酵米醋生产中具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明pediococcuspentosaceuszf618菌株的菌落形态图。

图2为本发明pediococcuspentosaceuszf618菌株的菌体形态图。

图3为本发明pediococcuspentosaceuszf618菌株根据16srdna序列所做的微生物系统进化树。

生物保藏信息

一株戊糖片球菌zf618，其分类学名称为pediococcuspentosaceus，该菌株于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60517，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例对本发明的具体实施做进一步说明，但并不仅限于此实施例。

实施例1、候选菌株的分离

使用无菌采样瓶采样自然发酵而成的米酒曲，低温带回；立即使用无菌水分别稀释至10^-3、10^-4、10^-5，涂布于mrs固体培养基上；然后放入30℃的厌氧恒温培养箱中，培养48h；挑取候选菌落，进行平板划线分离，如此重复4至5次，直至获得纯的单菌落。将纯化的单株制备甘油管，于-70℃冰箱保存。

其中，mrs固体培养基的配方如下：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-801.0ml，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·4h2o0.05g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0l，ph值6.2±0.2。

实施例2、候选菌株的初筛——风味米酒

将候选菌株和酿酒酵母复配接种至大米液化醪中，30℃条件下发酵10d，发酵结束后，对发酵液中的不挥发酸含量进行测定，以植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、耐酸乳杆菌作为对照，评估候选菌株在含醇条件下利用大米液化醪产生不挥发酸的能力差异。

其中，大米液化醪的制备方法如下：将米醋原料大米按照质量比1:1至1:5加水，升温并保持92至95℃，加入体积比1‰至1％的液化酶，搅拌20至200min，完成原料的液化，降温至25至40℃，制备获得大米液化醪。

本实施例的试验结果如下：

表1候选菌株及对照菌株制备的米酒不挥发酸含量检测结果

从以上结果可以看出，在含醇发酵体系中候选菌株1的不挥发酸含量明显优于其他菌株，候选菌株1具有较强的产不挥发酸能力。

实施例3、候选菌株的复筛——风味米醋

将实施例2所获风味酒醪经食醋液态深层发酵工艺制备成米醋，对米醋中的不挥发酸、香气成分进行测定，评估候选菌株在米醋中的应用效果。测定结果见表2和表3。

表2候选菌株及对照菌株制备的米醋不挥发酸含量检测结果

表3候选菌株及对照菌株制备的米醋香气成分及含量检测结果

从以上结果可以看出，候选菌株1制备的米醋中不挥发酸含量最多；香气成分总含量达0.54g/100ml，远高于对照菌株及候选菌株2和3；且候选菌株1制备的米醋中含有一种呈现香蕉水果香的乙酸戊酯。由上可知，候选菌株1能够赋予液态深层发酵米醋较高的不挥发酸含量，提升米醋的口感；能够提升香气含量，赋予液态深层发酵米醋较佳的香气。

实施例4、候选菌株的鉴定

候选菌株1在mrs培养基平板上菌落突起，呈圆形，直径1-3mm，白色，不透明，湿润光滑(见图1)；菌体为革兰氏染色阳性球菌，呈单、双、堆状排列(见图2)。将所测16srrna序列(16srdna序列见seqidno：1)通过blast比对，使用mega4.1软件构件微生物系统进化树，鉴定其为戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)，并命名为pediococcuspentosaceuszf618。

实施例5、菌株的扩大培养

(1)一级种子液的制备：戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618的活化，将戊糖片球菌接种至经121℃、15min灭菌并冷却至常温的无菌mrs肉汤中；30℃条件下，静置培养12至48h，获得戊糖片球菌zf618一级种子液。

(2)大米液化醪的制备：将米醋原料大米按照质量比1:1至1:5加水，升温并保持92至95℃，加入体积比1‰至1％的液化酶，搅拌20至200min，完成原料的液化，降温至25至40℃，制备获得大米液化醪。

(3)二级种子液的制备：取步骤(2)中制备的大米液化醪，加入质量1‰至5％的酵母抽提物，于115℃条件下，灭菌10至20min；按照体积比的1‰至10％接种戊糖片球菌zf618种子液；在25至35℃条件下，静置培养12至48h后，获得戊糖片球菌zf618二级种子液。

实施例6、风味酒醪及米醋的制备

(1)风味酒醪的制备：按照液化醪体积比的1‰至10％加入戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)zf618培养液，控制发酵罐温度25至35℃范围内，发酵12至48h。待结束后，往发酵罐中加入酿酒酵母，继续控温25至35℃，发酵8至10d后，压榨过滤获得富含不挥发酸、风味前体物质的风味酒醪。

(2)米醋的制备：使用上述步骤制备的风味酒醪经过液态深层发酵食醋工艺制备获得富含不挥发酸、酯香浓郁的液态深层发酵米醋胚。

取不同工艺米醋在公司内部组织鉴评人员进行了感官鉴评，鉴评结果见表4。

表4普通液态发酵米醋与添加zf618菌株液态发酵米醋鉴评结果

因此，采用戊糖片球菌zf618与酿酒酵母共同发酵的工艺能够明显提升酒醪风味，提升米醋质量。本发明的菌株产不挥发酸能力较强，香气成分高，能够提升米醋的口感，赋予米醋较佳的香气，所制备的米醋中不挥发酸含量多，酸感柔和，绵酸协调，香气纯净，清新，酯香浓郁，香气纯净度和酯香味明显提升，酸感柔和，整体较为协调。

上述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制；因此在和本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应该认为是包括在权利要求书的范围内。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110>佛山市海天（高明）调味食品有限公司

佛山市海天调味食品股份有限公司

<120>一株戊糖片球菌zf618及其应用

<130>idc190075

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1505

<212>dna

<213>16srdna

<400>1

gagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacg60

aacttccgttaattgattatgacgtacttgtactgattgagattttaacacgaagtgagt120

ggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccagaagtaggggataacacctggaaa180

cagatgctaataccgtataacagagaaaaccgcatggttttcttttaaaagatggctctg240

ctatcacttctggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggcaaaggctcaccaa300

ggcagtgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcc360

cagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggag420

caacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttaaagaagaacg480

tgggtaagagtaactgtttacccagtgacggtatttaaccagaaagccacggctaactac540

gtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaa600

gcgagcgcaggcggtcttttaagtctaatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgc660

attggaaactgggagacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtga720

aatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgcaactgac780

gctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgta840

aacgatgattactaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaa900

gtaatccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaagaattgacgggggcccg960

cacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttg1020

acatcttctgacagtctaagagattagaggttcccttcggggacagaatgacaggtggtg1080

catggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacc1140

cttattactagttgccagcattaagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccg1200

gaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgc1260

tacaatggatggtacaacgagtcgcgagaccgcgaggttaagctaatctcttaaaaccat1320

tctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgc1380

ggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccat1440

gagagtttgtaacacccaaagccggtggggtaaccttttaggagctagccgtctaaggtg1500

ggaca1505