一株乳酸菌Lactobacillussucicola及其应用的制作方法

本发明涉及一株乳酸菌，还涉及该乳酸菌的应用。

背景技术：

乳酸菌是一类能够发酵糖类且主要产物为乳酸的革兰氏阳性杆菌或球菌，对与其亲缘关系较近的部分革兰氏阳性或阴性细菌具有良好的抑制作用，目前广泛用于食品发酵、保鲜等领域。但有关乳酸菌对真菌的抑制作用尚少见报道。

柑橘是芸香科柑橘亚科柑橘属植物，柑橘果实是世界上产量最多的水果，在贮藏中受微生物侵染和贮藏环境的影响极易出现腐烂、水肿、浮皮等现象，严重影响果实的商品价值。由真菌指状青霉(penicilliumdigitatum)引起的绿霉病是柑橘果实贮藏过程中主要的侵染性病害。目前柑橘果实采后病害防治主要采用多菌灵、甲基托布津、抑霉唑等化学杀菌剂，但存在化学杀菌剂的残留性、微生物易对其产生抗药性等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于从柑橘果园中筛选、鉴定具有抑制指状青霉效果特别是能够预防柑橘果实采后绿霉病的乳酸菌，以丰富乳酸菌菌种资源库，拓宽乳酸菌在果蔬保鲜领域的应用范围，同时为柑橘果实采后绿霉病的防治提供新的解决方法。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.乳酸菌lactobacillussucicolajt03，保藏编号为cgmccno.17538。

2.乳酸菌lactobacillussucicolajt03在制备抑制指状青霉(penicilliumdigitatum)的药物中的应用。

进一步，乳酸菌lactobacillussucicolajt03在制备预防由指状青霉(penicilliumdigitatum)引起的柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用。

本发明的乳酸菌lactobacillussucicolajt03于2019年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17538。

本发明的有益效果在于：本发明从柑橘果园中筛选出了具有抑制指状青霉效果特别是能够预防由其引起的柑橘果实采后绿霉病的乳酸菌，不仅丰富了乳酸菌菌种资源库，拓宽了乳酸菌在果蔬保鲜领域的应用范围，也为柑橘果实采后绿霉病的防治提供了新的解决方法。

附图说明

图1为乳酸菌对指状青霉的离体抑菌效果。

图2为乳酸菌无菌发酵液对指状青霉的离体抑菌效果。

图3为乳酸菌无菌发酵液对指状青霉引起的柑橘果实采后绿霉病的控制效果，图中标有相同小写英文字母(a、b、c)的组之间不存在显著差异(p＞0.05)；标有不同小写英文字母(a、b、c)的组之间存在显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

1、乳酸菌的筛选

从重庆市北碚区缙云山柑橘果园分别采集柑橘果实、叶片、土壤和花生叶片作为样品。将各样品分别完全浸没于100mlmrs肉汤培养基中，37℃富集培养24h，10倍梯度稀释后涂布于含有0.3％caco3的mrs平板上，37℃培养48h，挑选具有明显溶钙圈的单个菌落进行分离纯化，并进行镜检和革兰氏染色。纯化后的菌种置于-80℃冰箱保存。

结果如表1所示，实验共筛选出68株疑似菌株，其中16株来自柑橘果实，6株来自柑橘叶片，24株来自柑橘果园土壤，22株来自花生叶片，镜检观察到球状和杆状两种形态，革兰氏染色均呈阳性。

表1乳酸菌的筛选

2、乳酸菌对指状青霉的离体抑菌效果

将筛选出的68株菌株通过双层平板法明确其对指状青霉的离体抑菌效果。

将各疑似菌株挑取一菌环接种于20mlmrs肉汤培养基中，37℃培养48h得到种子液；吸取1ml种子液接种于100mlmrs肉汤培养基中，37℃培养48h；随后用接种针在mrs平板中间平行划两条长度为2cm的直线，将平板置37℃培养48h；然后加入10ml含10⁴指状青霉孢子的pda培养基，待培养基完全凝固后，将平板置25℃培养；观察抑菌现象，以未接种菌株的mrs肉汤培养基划线为对照，筛选出对指状青霉具有较高抑制活性的菌株。

结果如图1所示，实验共筛选出10株对指状青霉具有较高抑制活性的菌株，其中7株来自花生叶片，2株来自柑橘果园土壤，1株来自柑橘叶片。

3、乳酸菌的鉴定

将筛选出的10株对指状青霉具有较高抑制活性的菌株通过16srdna序列分析进行鉴定。

取培养菌液，采用基因组dna提取试剂盒提取菌体dna；采用通用引物pcr扩增16srdna序列，正向引物为5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno.1)，反向引物为5’-ctacggctaccttgttacga-3’(seqidno.2)；反应体系包括：12.5μl2×estaqmastermix(dye),1μl各引物和1μldna模板；pcr反应过程如下：预变性，94℃，2min；然后30个循环：变性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸72℃，30s；终延伸，72℃，2min。pcr扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，委托上海生工生物股份有限公司进行测序，测序结果通过ncbi中的blast程序进行同源性比对分析。

结果见表2，10株对指状青霉具有较高抑制活性的菌株经鉴定，其中8株均为lactobacillussucicola，1株为类肠膜魏斯氏菌(weissellaparamesenteroides)，1株为乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)。

表2乳酸菌的鉴定

将所得lactobacillussucicola菌株命名为jt03，于2019年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17538。其16srdna序列如seqidno.3所示。

将所得类肠膜魏斯氏菌(weissellaparamesenteroides)菌株命名为jt13，于2019年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17539。其16srdna序列如seqidno.4所示。

将所得乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)菌株命名为jy03，于2019年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17540。其16srdna序列如seqidno.5所示。

4、乳酸菌无菌发酵液对指状青霉的离体抑菌效果

考察经鉴定的3株乳酸菌的无菌发酵液对指状青霉的离体抑菌效果。

吸取1ml乳酸菌种子液接种于100mlmrs肉汤培养基中，37℃培养；每隔2h取出一定量发酵液，5000rpm离心15min，上清液过0.22μm微孔膜，得到不同培养时间的无菌发酵液。将100μl发酵液与100μl10⁴指状青霉孢子悬浮液(含5％pdb培养基)混合，以未接种乳酸菌的mrs肉汤培养基为对照，25℃培养48h，测定od600值。

结果如图2所示，3株乳酸菌(jt03、jt13、jy03)的无菌发酵液对指状青霉均存在不同程度的抑制效果，且随着培养时间的延长，抑制效果逐渐增强，培养至60h后能够完全抑制指状青霉的生长。

5、乳酸菌无菌发酵液对柑橘果实采后绿霉病的控制效果

通过同孔接种实验考察经鉴定的3株乳酸菌的无菌发酵液对柑橘果实采后绿霉病的抑制效果。

吸取1ml乳酸菌种子液接种于100mlmrs培养基中，37℃培养48h，5000rpm离心15min，上清液过0.22μm微孔膜，得到乳酸菌无菌发酵液；挑选大小均一、成熟度一致、无机械伤的健康柑橘果实，用2％次氯酸钠溶液浸泡2min进行表面消毒，水冲洗晾干；果实赤道部位用70％酒精消毒后，用打孔器在果实赤道部位等距打2个小孔(直径3mm，深3mm)，接种10μl10⁴指状青霉孢子悬浮液，待液体吸收完全后再接种20μl乳酸菌无菌发酵液，以未接种乳酸菌的mrs肉汤培养基为对照，待液体吸收完全后将果实进行单果包装，放置于25℃、相对湿度90-95％的环境中贮藏。每天观察记录果实发病率及病斑直径。

结果如图3所示，3株乳酸菌(jt03、jt13、jy03)的无菌发酵液均能够在一定程度上抑制柑橘果实的发病和病斑直径的增长。其中jt03和jt13的效果更好。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>西南大学

<120>一株乳酸菌lactobacillussucicola及其应用

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<213>乳酸片球菌jy03(pediococcusacidilacticijy03)

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