长链非编码RNANONHSAT005760.2作为骨质疏松诊断标志物的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体为一种长链非编码rnanonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物的应用。

背景技术：

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易发生骨折的一种复杂的、多因素的全身性慢性骨骼疾病。我国随着老龄化现象的加剧，骨质疏松症的发病人数逐年增加，这给患者带来了全身骨痛、骨折、身高变矮等痛苦和危害，同时也给社会和家庭带来沉重的经济和生活负担。

骨质疏松症早期发病隐匿，临床表现不典型，要依赖影像学检查和辅助血清/尿液生物化学指标检查才能发现，并且存在一定局限性，进而导致骨质疏松症初期诊断率并不高。如果不加以重视，反复骨折会导致致残、致死的严重后果。因此，早期发现骨质疏松的高危人群，并进行干预处理、防止骨质疏松症发生，从而预防骨折，是提高老年人群健康水平及生活质量，降低老年人死亡率的重要措施之一。目前临床上骨质疏松的早期诊断仍缺乏特异性标志物。本发现对提高骨质疏松的诊断率和生存率，寻找高灵敏度和高特异性的骨质疏松诊断分子标记物有重大的临床意义。

人类的基因中仅有2％的基因编码蛋白质，大部分基因转录形成非编码的rna(ncrna)。其中长链非编码rna(lncrna)是一类长度大于200个核苷酸、缺少特异完整开放阅读框、无蛋白质编码功能的rna。lncrna参与了基因组印记、转录控制、转录后调控、蛋白功能调节等信号转导过程中的重要环节。已有研究表明lncrna与人类疾病的发生发展和防治有密切关联，例如免疫系统疾病、心血管疾病和肿瘤等。lncrna被认为参与了成骨细胞的分化，提示lncrna在骨质疏松症中扮演着重要角色。然而，目前国内外对骨质疏松症lncrna的表达谱特征及生物学功能的研究却鲜有报道。利用高通量测序技术从lncrna层面对骨质疏松症进行深入剖析，将为疾病的分子诊断提供强有力的科研支持。

本发明旨在通过高通量平台，对绝经后骨质疏松症患者中成骨细胞形成和破骨细胞吸收稳态中lncrna的调控机制进行研究。比较骨质疏松症患者和年龄性别相当的正常人群中差异表达的lncrna，进一步明确显著差异表达的lncrna在骨质疏松形成过程中的调控机制，靶向基因，分析lncrna调控的靶基因的生物学功能及其重要性，深入探索骨质疏松症的致病机制，为开发无创的预测、诊断型生物标志物及新的治疗靶点提供基础科学依据。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对目前临床上，骨质疏松症的检测仍缺乏高灵敏和高特异性的早期诊断指标，由此提供了lncrnanonhsat005760.2用于作为骨质疏松症诊断标志物的用途。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

检测骨密度正常人和骨质疏松患者外周血单核细胞的(pbmc)的lncrna；

计算细胞系的基因表达量，确定骨密度正常人和骨质疏松患者之间的差异lncrna，并检测lncrnanonhsat005760.2在骨组织中的表达量，证实lncrnanonhsat005760.2在骨质疏松患者骨质组织中高表达；

人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化，观察所述差异lncrna在成骨过程中的变化，证实差异lncrnanonhsat005760.2与骨形成有关，lncrnanonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物。

lncrnanonhsat005760.2用于作为骨质疏松诊断标志物的用途，所述长链非编码rnanonhsat005760.2的核酸序列为：

accgcagcgcagccggcacccagccgcctctccctttcctccgcacacgggcagccgcggtccaccgtagggcagtcgtcgttggcatcgcgcgcaagtgaaccggagcaaacgacttccgatccagtctgcgctgttgcagctcccgtttgggatttgatttgcagcatctttgagcctctacgacaaaaaaaccgcgaagcacgcccagccctcccccggcaccccgaaaagcacccactccctcccggggacacagctgggcgcgtccacacccccgcagccccacaccatgttgtgcggaaggacttccactccccgcctgtgtcgttgatgtcagaccccaggccagcctccgggcgctgcagttctcccggctaatgctgaggctgcggctccggctctagcacaggcaccagccgccgccgcacccggcctcagcgcccaccgtctgcatgtgcccgccgtagccgtctgcccagccc

本发明的有益效果：本发明提供的长链非编码rnanonhsat005760.2可用作骨质疏松诊断标志物，达到骨质疏松早诊断、早治疗的用途，长链非编码rna调控机制是骨质疏松发病机理研究中的一个新领域，lncrnanonhsat005760.2在骨质疏松患者骨组织和正常人骨组织中均有表达，且在骨质疏松患者骨质中的表达水平均显著高于正常人，差异具有统计学意义，提示lncrnanonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物的可行性及临床应用价值。

附图说明

图1为本发明的技术路线图；

图2位差异lncrna和mrna的表达量(log10(exp+1))heatmap图；

图3为钙茜素红染色成骨细胞；

图4为差异lncrnanonhsat005760.2在骨质疏松和正常两个人群中的tpm值分布；

图5为差异lncrnanonhsat005760.2在细胞四个时期(d0,d3,d7和d14)的表达量分布。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

长链非编码rnanonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物的应用：找到与骨质疏松相关的lncrna并预测其功能，在骨质疏松症中，某些特定的lncrna的表达水平会发生改变，这种表达水平的变化能够作为骨质疏松筛查的标志物，通过找到与变化lncrna共表达且差异的编码基因，从而推测lncrna的功能，具体地，本发明三个阶段进行：

第1阶段，收集样品，高通量测序；

第2阶段，数据过滤、样本定量、计算差异表达及差异lncrna的靶基因预测；

第3阶段，候选靶基因功能注释，及筛选lncrna、lncrna和mrnaqpcr和细胞功能验证。

第1阶段的具体流程包括：(收集样品，高通量测序)

步骤1.1收集150位45-70岁区间绝经妇女通过dx双能射线检测骨密度(髋关节及腰椎)，t值<＝-2.5归类为骨质疏松组，t值>＝-1归类为骨量正常组，骨转换代谢指标p1np,ctx值作为参考。

步骤1.2分离pbmc细胞，提取总rna，建库和高通量测序，数据下机；

(1)收集绝经后60位骨质疏松症患者和90位正常女性的血液样本；

(2)对血液进行分离，分成上层的血浆和下层的血细胞。

(3)从下层的血细胞中分离出外周血单核细胞(peripheralbloodmonouclearcell，pbmcs)，总rna去除核糖体rna，以最大限度保留所有非编码rna；得到的rna随机打断成为短片段，再以片断后的rna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成cdna第一链，并加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成cdna第二链，经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，然后通过ung(uracil-n-glycosylase)酶降解第二条链，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行pcr扩增；

(4)建好的150bppe文库在bgiseq500上进行高通量测序；

第2阶段的具体流程包括：(数据处理、样本定量、计算差异表达lncrna、差异lncrna靶基因预测)

步骤2.1下机的原始reads预处理

将下机数据通过soap(参数：-m0-x1000-s28-l32-v5-r2)与核糖体数据库比对，去除序列中核糖体rna数据。然后再去除接头污染、低质量reads(质量值q≤5的碱基数占整条read的10％以上)、含n碱基reads，得到cleandata，每个样本产生不少于6gcleandata。

步骤2.2样本定量和计算差异表达

将每个样本的cleandata通过hisat2比对回hg19(参数：--phred64--sensitive--no-discordant--no-mixed-i1-x1000-n1)，然后对得到的bam文件通过htseq-count(参数：-rname-sno-a10-munion)计算每个转录本和基因的rawreadcount。过滤掉80％的样本中readcount>＝0的基因，然后同时采用deseq2、edger和limma计算骨质疏松组和骨量正常组的组间差异基因。另外将cleandata通过bowtie2(参数：-q--phred64--sensitive--dpad0--gbar99999999--mp1,1--np1--score-minl,0,-0.1-i1-x1000--no-mixed--no-discordant-p4-k200-n1)比对到rna序列上，通过rsem计算每个基因的tpm值和fpkm值。通过degseq分别计算骨质疏松组和骨量正常组的组间差异。

步骤2.3差异lncrna靶基因预测

使用rnaplex，来预测反义lncrna与mrna之间的互补结合，根据其热力学结构计算最小自由能来预测最佳碱基配对关系。同时，计算每个lncrna与mrna的皮尔逊相关系数及其显著性水平,相关系数绝对值大于等于0.6且p-value值小于0.05的lncrna-mrna对判定为候选的lncrna及其靶基因对。另外，认为lncrna的功能与其相邻的蛋白编码基因相关，位于编码蛋白上下游的lncrna可能与启动子或者共表达基因的其他顺式作用元件有交集。计算lncrna与mrna在染色体上的相对位置，mrna上游10k和下游20k的lncrna，存在可以作为lncrna候选的靶基因。

第3阶段的具体流程包括：靶基因功能注释和候选基因qpcr和细胞功能验证

步骤3.1靶基因功能注释

由于得到的差异lncrna数量较少，结合使用文献查找、genecards、kegg通路等方式查找lncrna对应靶基因的相关功能。

步骤3.2挑选组间表达差异显著的mrna和lncrna(优选基因间区或内含子区)进行qpcr验证和细胞功能验证。

本发明技术途径见图1：

(1)实验：收集150位骨质疏松症患者和正常对照的血液，分别提取rna，进行高通量lncrna建库和测序样品提取总rna后，总rna去除核糖体rna，以最大限度保留所有lncrna；得到的mrna随机打断成为短片段，再以片断后的mrna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成cdna第一链，并加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成cdna第二链，经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，然后通过ung(uracil-n-glycosylase)酶降解第二条链，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行pcr扩增，最后建好的测序文库用进行高通量测序。

(2)信息分析：对下机数据去除杂质，去除rrna得到cleandata，然后利用cleandata构建转录本、non-codingrna库注释、蛋白库比对、cpc(codingpotentialcalculator)预测、表达量统计等。最后结合样本的临床信息找出患者和对照样本中表达显著差异的lncrna，并对其进行功能分析。

(3)实验细胞系高通量测序验证：通过诱导人骨髓间充质干细胞(bmsc)成骨，钙茜素红染色证明成骨诱导成骨。高通量测序分析成骨过程中(0天，3天，7天，14天)lncrna含量变化。使用α-mem培养基和10％的胎牛血清(gibico)培养bmsc细胞，加入成骨诱导液(α-mem+10％fbs+0.2mm抗坏血酸+100nm地塞米松+10mmβ-甘油磷酸钠)诱导成骨，并按时间点收集细胞提取总rna总rna去除核糖体rna，以最大限度保留所有非编码rna；得到的rna随机打断成为短片段，再以片断后的rna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成cdna第一链，并加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成cdna第二链，经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，然后通过ung(uracil-n-glycosylase)酶降解第二条链，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行pcr扩增；建好的150bppe文库在bgiseq500上进行高通量测序；

细胞系的基因表达量的计算(数据处理、样本定量)

步骤1下机的原始reads预处理

将下机数据通过soap(参数：-m0-x1000-s28-l32-v5-r2)与核糖体数据库比对，去除序列中核糖体rna数据。然后再去除接头污染、低质量reads(质量值q≤5的碱基数占整条read的10％以上)、含n碱基reads，得到cleandata，每个样本产生不少于50mcleanreads。

步骤2.2样本定量和计算差异表达

将每个样本的cleandata通过bowtie2(参数：-q--phred64--sensitive--dpad0--gbar99999999--mp1,1--np1--score-minl,0,-0.1-i1-x1000--no-mixed--no-discordant-p4-k200-n1)比对到mrna和lncrna序列上，通过rsem计算每个编码基因和lncrna的tpm值。

综上所述：本发明首先是检测骨密度正常人和骨质疏松患者外周血单核细胞的(pbmc)的lncrna，上述实施例中收集60位骨质疏松症患者血液样本，和90位正常女性的血液样本形成对照组；检测骨密度正常人和骨质疏松患者外周血单核细胞的(pbmc)的lncrna；然后计算细胞系的基因表达量，确定骨密度正常人和骨质疏松患者之间的差异lncrna，并检测lncrnanonhsat005760.2在骨组织中的表达量，证实lncrnanonhsat005760.2在骨质疏松患者骨质组织中高表达；最后人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化，观察所述差异lncrna在成骨过程中的变化，证实差异lncrnanonhsat005760.2与骨形成有关，lncrnanonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物。

图2差异lncrna和mrna的表达量(log10(exp+1))heatmap图，图2中右边纵坐标为长链rna名称，图2中颜色深浅表示表达量高低；图3为钙茜素红染色成骨细胞；图4为差异lncrnanonhsat005760.2在骨质疏松和正常两个人群中的tpm值分布；图5为差异lncrnanonhsat005760.2在细胞四个时期(d0,d3,d7和d14)的表达量分布。此结果证实差异lncrnanonhsat005760.2在骨质疏松病人骨组织中高表达量，且差异lncrnanonhsat005760.2与骨形成有关，差异具有统计意义，提示差异lncrnanonhsat005760.2可作为骨质疏松诊断标志物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳市人民医院；深圳华大生命科学研究院

<120>长链非编码rnanonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物的应用

<141>2019-05-09

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>485

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

accgcagcgcagccggcacccagccgcctctccctttcctccgcacacgggcagccgcgg60

tccaccgtagggcagtcgtcgttggcatcgcgcgcaagtgaaccggagcaaacgacttcc120

gatccagtctgcgctgttgcagctcccgtttgggatttgatttgcagcatctttgagcct180

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