一株阴沟肠杆菌及其在降解噻虫嗪中的应用的制作方法

本发明涉及一株阴沟肠杆菌（enterobactercloacae）及其在降解噻虫嗪中的应用，即针对叶菜种植体系中土壤源塑化剂噻虫嗪残留污染的土壤利用该阴沟肠杆菌制备的菌剂并加以应用，属于微生物学与食品安全领域。

背景技术：

蔬菜产业的发展对我国种植业结构优化调整、农业增效、农民增收、扩大出口创汇等方面具有不可替代的作用。蔬菜生育期短，生长快，复种指数高，在生产过程中极易受到病虫害的危害。据不完全统计，我国蔬菜虫害有200余种，每年需使用大量农药以保障蔬菜免受或少受虫害影响，但农药的大量使用在一定的程度上造成了环境污染和食品安全隐患。除了直接喷施在作物上的农药外，作物还可以从被污染的土壤和水吸收农药残留，被作物吸收的农药残留可能最终进入到食物链中而对人和动物的健康造成威胁。因此消除环境中或作物体内的农药残留对保障食品安全有至关重要的作用。传统的物理和化学方法清除土壤和水中污染物不仅耗资巨大，还会对环境造成一定破坏性。

新烟碱类杀虫剂是近几十年来主要开发的一种新型杀虫剂。该类杀虫剂用量少、持久性强、对大多数节肢动物高神经毒性以及独特的选择性作用机制，在不到20年的时间里，发展为全世界使用最广泛的一类杀虫剂，吡虫啉和噻虫嗪是该类杀虫剂中两个主要的品种。新烟碱类杀虫剂既可用作茎叶处理，也可用于土壤和种子处理。然而，新烟碱类杀虫剂在世界范围内的大量使用对环境和非靶标生物的影响引起了各国的高度关注，已有大量的文献报道了新烟碱类杀虫剂对蜜蜂等授粉昆虫和蚯蚓有高毒，还可引起蜂群崩溃失调病；不仅如此，此类杀虫剂对鸟类还具有高生殖毒性；影响鼠类的呼吸作用和造成肝脏损伤；甚至导致生物多样性的下降。我国登记使用的新烟碱类杀虫剂有效成分8个，涉及相关产品1729个，是我国当前在蔬菜水果和粮食作物上应用最为广泛的一类杀虫剂。

噻虫嗪(thiamethoxam)是1991年由瑞士诺华公司研发的高效、安全、高选择性、低毒的第二代新型烟碱类杀虫剂，以氯噻唑环增加广谱作用并提高活性，极性强，溶解性高，内吸作用强，用于茎叶喷雾、土壤灌根、种子处理，施药后叶片或根系通过内吸迅速传输到植株各部位，可有效防治蚜虫、潜叶蛾等害虫。噻虫嗪具有强烈的内吸性和较高的水溶解度，导致其在土壤施用或作为种衣剂使用后可迅速传导至植株的各部位，造成作物花粉、花蜜和吐水等污染。如用噻虫嗪作为种衣剂处理玉米，玉米花粉中噻虫嗪的残留量为1～7µg/kg，而吐水液滴中的噻虫嗪含量则可达（11.9±3.32）mg/l；当噻虫嗪被用作土壤处理后，玉米花蜜中的噻虫嗪残留量可达（10±3）ng/g。噻虫嗪可在反复使用时积累，增加了其所带来的环境污染和暴露于非目标生物的可能性。噻虫嗪的使用可能会对蜜蜂的生存存在较大风险，岳孟等对意大利工蜂进行室内毒力测定，研究发现lc15（8.21ng/g）会使哺育蜂的存活寿命缩短9.2d，而lc25（137.48、16.83和13.50ng/g）会使新出房蜂、哺育蜂和采集蜂的存活寿命分别缩短19.0、15.0和10.9d，这表明随着噻虫嗪浓度的增加，蜜蜂的生存风险增大。charreton等发现亚致死剂量的噻虫嗪、吡虫啉和噻虫胺能够引起蜜蜂运动和飞行麻痹现象，并且影响蜜蜂的学习记忆能力以及嗅觉功能。yao等发现，噻虫嗪对粉虱捕食性天敌刀角瓢虫serangiumjaponicumchapin的致死和亚致死效应因施药方式不同而不同，并会妨碍捕食性天敌的生防功能。

蔬菜上的农药残留几乎无可避免，即便有机蔬菜上仍有农药残留的问题，而传统种植方法产出的蔬菜的农药残留情况更为严重。土壤农药污染治理的方法包括物理修复、化学修复和生物修复。虽然物理、化学的方法可以达到一定的效果，但其存在能耗大、环境不友好等问题，新烟碱类杀虫剂已被证实会对蚯蚓和其他土壤无脊椎动物造成危害，对土壤生态系统产生非常不利的影响。生物修复利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使被污染的土壤环境能够部分或完全恢复到初始状态，具有操作简单、处理费用低、效果好、可以就地进行处理等优点，是目前治理环境污染的有效途径，对于治理农药造成的污染也是如此。农药多为水溶性质，容易被植物吸收。除草剂都能为植物所吸收,对大部分不溶于水的杀虫剂、杀菌剂等农药,植物主要利用根际圈的生物降解作用进行修复。植物修复农药污染环境的机理要复杂得多,经历的过程可能包括吸附、吸收、转移、降解、挥发等。但并非所有植物对化学物质都有降解能力，且植物对化学物质的适应或敏感程度也不相同。

微生物修复是利用筛选、驯化的专性微生物或基因工程菌去除或降解土壤有机污染物，实现修复的目的。由于微生物对环境有极强的适应性，可以在各种条件下进行生长繁殖，并具有较强的变异性，因此在生存过程中分化出多种多样的代谢类型，并能较强地适应生存环境。在有机物污染土壤中，经过自然驯化，存在大量能降解污染物的微生物，对污染物的去除起着重要作用。许多微生物具有强大的酶降解体系，农药降解的每个过程均由酶催化完成。除酶促反应外，微生物还通过自身的活动改变土壤的理化性质，而间接作用于农药，如矿化作用、共代谢作用、种间协同代谢。

阴沟肠杆菌广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便、水、泥土、植物中均可检出，易获得，实际应用价值高。现有研究发现阴沟肠杆菌可降解btex、咪草烟、乐果、氯氟氰菊酯、拟除虫菊酯类杀虫剂、石油烃等化合物。目前还未有肠杆菌属降解新烟碱类杀虫剂的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一株阴沟肠杆菌（enterobactercloacae），该菌株可针对土壤主要塑化剂噻虫嗪进行降解，并可进一步制备为修复剂，能够有效降解残留于栽种土壤中的塑化剂污染，进而减少其向叶菜中的吸收转移，同时要保证不影响叶菜植株的正常生长，以及不引入其他污染源。

为实现上述目的，本发明首先提供了一株保藏号为cgmccno:16235的阴沟肠杆菌（enterobactercloacae），该菌株分离自多年生本草植物麦冬体内，菌株呈棒杆状,不内生芽孢，芽孢杆菌属；该菌株多数对动植物无害，申请人将该菌株自命名为tmx-6。

其次，本发明提供了上述保藏号为cgmccno:16235的阴沟肠杆菌在降解噻虫嗪中的应用，进一步包括菌株cgmccno:16235在降解土壤或叶菜植株体内噻虫嗪残留中的应用。

进一步，上述菌株cgmccno:16235在叶菜植株体内噻虫嗪残留中的应用是指，将保藏号为cgmccno:16235的阴沟肠杆菌制备成菌含量为10^7-8cfu/ml（od值为1）的菌液，对叶菜植株进行进行浸根处理24h，用以降解叶菜植株中可食用部位残留的噻虫嗪。

进一步，上述菌株cgmccno:16235在降解土壤噻虫嗪残留中的应用是指，将保藏号为cgmccno:16235的阴沟肠杆菌制备成菌含量为10^7-8cfu/ml（od值为1）的菌液，对叶菜植株地上部位进行喷施处理（喷施量约为300-500kg/hm²），用以降解叶菜植株中可食用部位残留的噻虫嗪。

与现有技术相比，本发明提供的阴沟肠杆菌（enterobactercloacae）自植物内分离，属于植物生菌阴沟肠杆菌（enterobactercloacae），该菌株可针对植物体内农药噻虫嗪进行降解，并可进一步制备为修复剂，进而减少其向叶菜中的吸收转移，不影响叶菜植株的正常生长，不引入其他污染源。

附图说明

图1为阴沟肠杆菌（enterobactercloacae）tmx-6的扫描电镜图。

图2为阴沟肠杆菌tmx-6对噻虫嗪的降解功能验证结果示意图。

图3为该微生物菌剂浸根接菌和叶面喷施接菌处理对减少叶菜体内噻虫嗪污染的效果示意。

图4为该微生物菌剂对叶菜蔬菜促生的效果示意。

具体实施方式

实施例所涉及的培养基：

lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/l氯化钠，ph7.0；

无机盐液体培养基:mgso4·7h2o(0.4g),feso4·7h2o(0.2g),k2hpo4(0.2g),(nh4)2so4(0.2g),andcaso4,(0.08g),去离子水1l,ph7.0~7.2;

种子培养基：k2hpo4(4.8g),kh2po4(3.5g),(nh4)2so4(2g),mgcl2(0.16g),cacl2(0.02g),namoo4.2h2o(0.0024g),fecl3(0.0018g),mncl2.2h2o(0.0015g),ph=7.0,加水至1l；

无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中添加20g/l琼脂；

菌种活化培养基:10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/l氯化钠，ph7.0；

无机盐液体培养基:mgso4·7h2o(0.4g),feso4·7h2o(0.2g),k2hpo4(0.2g),(nh4)2so4(0.2g),andcaso4,(0.08g),去离子水1l,ph7.0~7.2;

以下实施例所涉及的试剂，除非特别说明，均为商业渠道购买。

实施例1阴沟肠杆菌tmx-6的分离鉴定与降解功能验证

1、菌株enterobactercloacaesp.tmx-6分离鉴定

申请人于2016年7月采集来自浙江省农业科学院原农药厂旧址的沟渠(e120°11,n30°18′)中的野生杂草麦冬，然后对麦冬植株进行表面消毒，研磨成汁液，涂布在含有噻虫嗪为唯一碳氮源的无机盐固体培养基上，筛选获得一株具备噻虫嗪降解特性的植物内生菌。申请人将该菌自命名为tmx-6，其电镜图片如图1所示，该菌株呈棒杆状，无内生芽孢。

通过生理生化特性和16srdna保守序列比对tmx-6菌株鉴定为阴沟肠杆菌（enterobactercloacae），申请人于2018年8月8日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为cgmccno.16235,分类命名为阴沟肠杆菌（enterobactercloacae）。

2、enterobactercloacaesp.tmx-6菌株降解dbp功能验证

先用lb培养基过夜培养步骤1筛选获得的纯tmx-6菌株，菌体经过离心（5000rpm，15min,4℃）并用无菌磷酸缓冲液（pbs，ph7.0）洗涤三遍，然后用pbs重悬成tmx-6菌悬液（od600=1.0左右）；再按体积比1%的接菌量将tmx-6菌悬液加入2μg/ml的噻虫嗪为唯一碳氮源的无机盐液体培养基中培养2、6、12、36、48、5小时;最后用高效液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms）检测无机盐液体培养基中的噻虫嗪残留含量，对比不接菌的对照（加入等体积1%的pbs），计算tmx-6菌株的降解率（接菌）：

噻虫嗪降解率=（对照组噻虫嗪含量-实验组噻虫嗪含量）/对照组噻虫嗪含量*100%；最终确定enterobactercloacaesp.tmx-6的噻虫嗪降解性能。

上述高效液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms）参见文献：liy,longl,yanh,gej,chengj,renl,yux,2018.comparisonofuptake,translocationandaccumulationofseveralneonicotinoidsinkomatsuna(brassicarapavar.perviridis)fromcontaminatedsoils.chemosphere2008,603-611.

检测结果如图2所示，1%体积的tmx-6菌液就能够将浓度为2μg/ml的噻虫嗪的半衰期从78小时缩减到10小时，降解率在48小时时达到62%。充分验证了enterobactercloacaesp.tmx-6对噻虫嗪的高效降解特性。

实施例2tmx-6菌剂的制备

本实施例中tmx-6菌剂是这样获得的：

a）将实施例1获得的菌株tmx-6接种至lb培养基，30℃划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落于菌种活化培养基中，30℃,150-220rpm摇床震荡培养12-24h，获得活化菌种；

b）向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种，接种量为种子培养基体积的1%，25-38℃，通空气培养16-24h,得到液体种子;

c）向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子，接种量为种子培养基体积的1%，30-35℃,200rpm下避光培养至对数生长期，得到活菌体培养物；

d）取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心20min,取沉淀菌体用无菌生理盐水冲洗3次，再用无菌生理盐水调节至菌浓度为10^7-8cfu/ml,即获得tmx-6菌剂。

实施例3tmx-6菌剂灌根接菌/叶面喷施修复叶菜噻虫嗪污染实验

取样农田自然土壤，先暴晒风干，再过30目筛子去除过大的石粒，土壤成分性质为ph5.97,有机质含量66.8g/kg干土,总氮含量0.36%,总碳含量49.61%,总氢含量5.7174%,总硫含量0.01%,氧含量44.37%，黏土含量2.33%，淤泥含量16.1%，沙含量81.5%。

1）将三叶一心的小青菜上海青的根全部浸泡在实施例2获得的tmx-6菌剂(10^7-8cfu/ml)中24h后，移栽至上述农田自然土壤，对照组1浸泡在生理盐水中；待栽培21d上海青成熟后，实验组（灌根接菌）在上海青叶面喷施噻虫嗪农药（市购产品，按推荐剂量喷药），三天后取叶菜可食用部分，用高效液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms）检测叶菜可食用部分的噻虫嗪残留含量（检测方法参照文献：liy,longl,yanh,gej,chengj,renl,yux,2018.comparisonofuptake,translocationandaccumulationofseveralneonicotinoidsinkomatsuna(brassicarapavar.perviridis)fromcontaminatedsoils.chemosphere2008,603-611.）；对照组（灌根对照组）以等量生理盐水灌根。

2）将小青菜上海青种植于实施例3所述的农田自然土壤，种植40天左右上海青成熟后，在上海青叶面喷施噻虫嗪农药（从市面够得，按推荐剂量喷药），待叶面上的农药完全干后，实验组（叶面喷施接菌）将实施例2获得的tmx-6菌剂喷施于上海青叶面（喷施量300-500kg/hm²），对照组（叶面喷施对照组）喷施等量生理盐水，三天后取叶菜可食用部分，用高效液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms）检测叶菜可食用部分的噻虫嗪残留含量（检测方法同实施例3）。

该实验结果如图3所示，可见，灌根接菌方法处理后，噻虫嗪残留含量从1.52mg/kg（灌根对照组）降低到0.26mg/kg（灌根接菌），证明tmx-6菌剂能够显著降低叶菜可食用部分的噻虫嗪残留；叶面喷施该菌剂能够将叶菜可食用部分的噻虫嗪残留从1.52mg/kg（叶面喷施对照组）显著降低到0.26mg/kg（叶面喷施接菌）。

实施例4tmx-6菌剂灌根接菌对叶菜促生的作用

将三叶一心的小青菜上海青的根全部浸泡在实施例2获得的tmx-6菌剂中24h后，移栽至实施例3所述农田自然土壤，对照组浸泡在生理盐水中；栽培21d上海青成熟后，拔出整颗植株观察生长情况，实验结果如图4所示，该菌剂能让植株的根系更发达，须根显著增多。证明tmx-6菌剂对上海青植株具有促进生长的作用。

上述实施例验证了tmx-6菌剂可降解植株体内噻虫嗪残留，并对上海青具有促生长的作用。