一种基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法与流程

本发明涉及法医学检验领域，特别涉及一种基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法。

背景技术：

水中尸体的死因分析是法医学中的重大难题。尽管学者们对硅藻检验的溺死诊断价值仍存在分歧，但其自1904年被发明以来一直被认为是一种较为可靠的溺死诊断手段，尤其对于水中腐败尸体死因的鉴定，被视为最佳方法（“金标准”）。硅藻检验包括样品前处理和对样品所含硅藻种类的分析（即定性分析）和含量的分析（即定量分析）。硅藻检验实践中，样品前处理主要采用强酸加热消解-离心法，研究表明该法存在消解效率低、消解效果差、硅藻回收率低、污染环境等显著缺陷；硅藻种类分析，需应用硅藻分类学专业知识，通常法医工作者在拍摄硅藻照片后请硅藻学专家协助进行硅藻种类鉴定；而传统的硅藻含量分析方法是：在光学显微镜下以人工方式逐个视野搜寻、拍照、计数和统计，法医工作者虽可独立完成，但效率低、工作强度高、检验误差大。针对传统硅藻检验的上述不足，以本发明人中的胡孙林博士为主要完成人的课题组发明了“微波消解-真空抽滤-扫描电镜硅藻检验方法”（发明专利号：ZL 2009 1 0214550. 2，ZL 2010 1 0115728. 0）。该方法是硅藻检验研究领域的一个重大突破，是获得了2017年国家科技进步二等奖项目“法医硅藻检验关键技术及设备”的核心成果，相对于传统方法，该方法在提高检验灵敏度、防污染、高效性、安全性等方面都取得了显著进步，尤其，将溺死尸体硅藻检验阳性率由28%提高至97.4%，大大提高了硅藻检验的溺死诊断价值。

然而，“微波消解-真空抽滤-扫描电镜硅藻检验方法”仍采用人工方式进行硅藻识别和种类鉴定，此外扫描电镜的图像拍照速度不及光镜，这些因素制约了检验效率的提高。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种自动化程度高、高效、准确的法医学硅藻检验方法。

为了实现上述技术目的，本发明提出了一种基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法，该方法显著提高了检验效率和准确性、降低了劳动强度，在法医学实践中具有良好的应用前景，具体如下：

一种基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法，对法医学硅藻检验中的样品依次进行以下检验：

（1）微波消解，使样品在微波辐射作用下和强酸发生化学反应，以快速溶解有机质；微波消解的目的是从样品中提取出耐酸腐蚀、可用作溺死指示物的硅藻细胞壁。

（2）消解液pH调节，对经微波消解后得到的液体进行pH调节；

（3）消解液中的颗粒动态光学显微成像，调节pH后的消解液以流动方式进入流体光学显微成像装置，其中的颗粒（包括硅藻细胞壁）经过检测窗时被高速显微相机快速拍照；

（4）硅藻自动鉴定，利用硅藻自动鉴定系统对所拍摄、存储于计算机的颗粒显微图像进行硅藻自动识别和分类；

（5）数据处理和检验报告制作，对检验数据进行处理和分析，得到样品中硅藻的种类及含量；然后比较各样品所含硅藻的种类及含量，判断匹配程度；最后制作检验报告，为溺死诊断提供依据。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，除脏器组织和水样检验外，还设有空白样品和控制样品检验，以避免假阳性和假阴性结果发生。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，所述空白样品为不含硅藻的样品，如纯水；所述控制样品为含有中心纲和羽纹纲硅藻的标准样品，其硅藻浓度为1-100个/mL，大小为1-100μm。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，步骤（1）所述微波消解包括如下步骤：将样品加至微波消解罐内，加入浓硝酸（和/或其他强酸）后微波消解，消解液用纯水或超纯水稀释；将消解液转移至试管，备用；因消解后的消解罐可能残留硅藻，污染下一批样品，为去除硅藻残留物，将消解罐置于1-5NNaOH溶液中浸泡，再用超纯水清洗；或加HF溶液（或其他可溶解硅藻的酸）至消解罐进行微波消解以溶解硅藻细胞壁。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，步骤（1）所述样品包括1－10g脏器组织（肺、肝、肾、骨髓等）、1－10mL水样、1－10mL空白样品和1－10mL控制样品。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，步骤（2）所述消解液pH调节步骤具体为：

（1）真空抽滤：采用真空抽滤装置，将步骤（1）得到的消解液抽滤，滤完后加纯水或超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性；真空抽滤参数为：真空度为100－700mmHg，所采用滤膜直径10－50mm，孔径为0.1－3.0µm；

（2）颗粒脱附：采用超声脱附或真空抽吸的方法处理得到的滤膜，使其表面富集的颗粒脱附至纯水或超纯水中。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，步骤（3）所述消解液中的颗粒动态光学显微成像包括如下步骤：将步骤（2）所得悬浮液加至流体光学显微成像装置的进样器中，悬浮液以0.01mL/min~10mL/min的流速被输送至检测系统，当颗粒物（包括硅藻细胞壁）经过检测窗时，其图像即被高速显微相机拍摄，放大倍数为40-2000X。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，所述流体光学显微成像装置包括：进样器、流体输送系统、光源、检测窗、高速显微相机、计算机及控制软件。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，步骤（4）所述硅藻自动鉴定的过程包括：采用包括图像识别和分类技术的硅藻自动鉴定软件对所拍摄图像进行实时处理和分析，识别出硅藻并分类，硅藻鉴定结果自动存储于计算机。

作为优选的，在上述基于流体光学显微成像的法医学硅藻检验方法中，步骤（5）所述数据处理和检验报告制作包括如下步骤：

（1）统计检验数据；

（2）仅当空白样品检验结果阴性，控制样品检出硅藻种类与已知种类相同、硅藻含量误差小于已知值10-20%时，检材检验结果有意义，方可出具检验报告书；

（3）制作检验报告书，按司法鉴定文书相关要求制作检验报告书，在其检验结论部分，应表述检材中硅藻的种类及含量，如检材包含脏器组织和水样，还应表述脏器组织和水样硅藻检验结果的匹配程度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.高效：本发明通过两种技术提高检验效率：其一，采用高速显微相机代替扫描电镜，大大提高了颗粒成像速度；其二，以自动硅藻鉴定方式代替人工硅藻鉴定方式，自动硅藻鉴定系统实时对所拍照片自动分析、识别硅藻并分类，避免了传统硅藻检验方法和“微波消解-真空抽滤-扫描电镜硅藻检验方法”耗时、耗力的不足。

2.准确：与传统方法和“微波消解-真空抽滤-扫描电镜硅藻检验方法”相比，本发明采用硅藻自动鉴定系统进行硅藻鉴定，克服了检验人员由于硅藻鉴定水平差异所导致的人员误差。

3.自动化程度高、劳动强度低：与传统方法和“微波消解-真空抽滤-扫描电镜硅藻检验方法”相比，本发明采用自动进样和自动检测方式，避免了搜寻、标记、放大、拍照、鉴定等人工步骤，大大降低了检验人员的劳动强度。

附图说明

图1为流体光学显微成像装置原理示意图；

图2为由流体光学显微成像装置拍摄的硅藻图片；

(a)快速拍摄的硅藻照片，100X；

(b) 慢速拍摄的硅藻照片，200X；

图3为本发明的检验流程图。

具体实施方式

实施例1：

本发明包括如下步骤：微波消解、消解液pH调节、消解液中的颗粒动态光学显微成像、硅藻自动鉴定、数据处理和检验报告制作。

1 样品

包括检材、空白样品（I和II）、控制样品。

1.1 检材

脏器组织（肺、肝、肾、骨髓等）和水样。

1.2 空白样品I

纯水或超纯水。

1.3 空白样品II

纯水或超纯水。

1.4 控制样品

含有中心纲和羽纹纲硅藻的标准样品，其硅藻浓度为1-100个/mL，大小为1-100μm。

2 检验顺序

按空白样品I、控制样品、空白样品II、封闭器官组织（肝、肾、骨髓等）、肺、水样的顺序依次进行检验。

3 检验方法

所有样品均按以下方法检验。

3.1微波消解：

将样品加至微波消解罐内，加入浓硝酸（和/或其他酸）后微波消解，消解液用纯水或超纯水稀释；将消解液转移至试管，备用。因消解后的消解罐可能残留硅藻，污染下一批样品，为去除硅藻残留物，将消解罐置于1-5NNaOH溶液中浸泡，再用超纯水清洗；或加HF溶液（或其他可溶解硅藻的酸）至消解罐进行微波消解以溶解硅藻细胞壁。

样品用量如下：

空白样品（I和II）：1-10mL

控制样品：1-10mL

脏器组织（肺、肝、肾、骨髓等）：1-10g

水样：1－10mL

微波消解条件设定：按微波消解仪厂家推荐参数或经实验优化后的参数设定。

3.2 消解液pH调节

消解液pH调节步骤具体为：

3.2a真空抽滤

采用真空抽滤装置，将3.1处理得到的消解液抽滤，滤完后加纯水或超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性；

真空抽滤参数为：真空度为100－700mmHg，所采用滤膜直径10－50mm，孔径为0.1－3.0µm。

3.2b颗粒脱附

采用超声脱附或真空抽吸的方法处理3.2a得到的滤膜，使其表面富集的颗粒脱附至1-50mL纯水或超纯水中。

4 颗粒动态光学显微成像

将3.2b得到的悬浮液加至流体光学显微成像装置的进样器中，悬浮液以0.01mL/min~10mL/min的流速被输送至检测系统，当颗粒物（包括硅藻细胞壁）经过检测窗时，其图像即被高速显微相机拍摄，放大倍数为40-2000X。

5 硅藻自动鉴定

采用基于人工智能、机器视觉、深度学习、神经网络等图像识别和分类技术设计的硅藻自动鉴定软件对4所拍摄图像进行实时处理和分析，识别出硅藻并分类，硅藻鉴定结果自动存储于计算机。

6数据处理和检验报告制作

6a统计检验数据。

6b仅当空白样品检验结果阴性，控制样品检出硅藻种类与已知种类相同、硅藻含量误差小于已知值10-20%时，检材检验结果有意义，方可出具检验报告书。

6c制作检验报告书。按司法鉴定文书制作相关要求制作检验报告书，在其检验结论部分，应表述检材中硅藻的种类及含量，如检材包含脏器组织和水样，还应表述脏器组织和水样硅藻检验结果的匹配程度。